摘" 要：化學(xué)遺傳學(xué)是一種多學(xué)科交叉的新興研究方法?；瘜W(xué)遺傳學(xué)具有實(shí)驗(yàn)周期短、對(duì)靶蛋白功能有特異性干擾等優(yōu)勢(shì)。該研究利用化學(xué)遺傳學(xué)方法篩選促進(jìn)鋁誘導(dǎo)根系蘋果酸分泌的小分子化合物，并探討小分子化合物在擬南芥中的作用靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物MLN8237和LY2228820對(duì)擬南芥蘋果酸分泌有顯著促進(jìn)作用，且它們?cè)跀M南芥中的候選靶蛋白分別為AtAurora1、AtAurora2、AtAurora3和MAPKs。運(yùn)用化學(xué)遺傳學(xué)方法探究鋁誘導(dǎo)擬南芥蘋果酸分泌途徑新組分具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞：鋁毒；蘋果酸；小分子化合物；化學(xué)遺傳學(xué)；擬南芥

中圖分類號(hào)：Q944" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16601/j.cnki.issn2096-7330.2024.02.016文章編號(hào)：2096-7330（2024）02-0106-06

收稿日期：2023-12-23

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“化學(xué)遺傳學(xué)表征鋁脅迫下AtALMT1介導(dǎo)蘋果酸分泌的調(diào)控機(jī)制研究”（2021GXNSFBA196009）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目“擬南芥應(yīng)對(duì)鋁脅迫的調(diào)控因子AtALMT1的研究”（2021KY0396）

通信作者：吳柳杰，博士，南寧師范大學(xué)講師，526551612@qq.com。

0" 引言

土壤酸化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，并已成為全球農(nóng)業(yè)所面臨的一大難題。中國(guó)南方紅壤分布廣泛，地處于熱帶和亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，擁有豐富的水熱資源和良好的生態(tài)環(huán)境，是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)和糧食產(chǎn)區(qū)［1］。然而，由于工業(yè)廢氣排放和農(nóng)業(yè)氮肥過(guò)度使用等因素，紅壤地區(qū)的酸度逐漸升高，給農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)嚴(yán)重影響，威脅農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［2］。鋁毒是酸性土壤中限制植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量的主要因素［3］。因此，深入研究植物對(duì)鋁毒的耐受機(jī)制和分子機(jī)理，發(fā)掘植物自身的潛能來(lái)解決酸性土壤鋁毒問題，是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)土壤改良的關(guān)鍵策略。

鋁誘導(dǎo)擬南芥（Arabidopsis thaliana）根系蘋果酸分泌即受到蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtALMT1（Aluminum-Activated Malate Transporter 1）活性的影響又與AtALMT1基因轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)［4］。然而，有關(guān)鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ALMT1的調(diào)控因子及作用機(jī)制仍有待深入研究。目前常采用經(jīng)典遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)等手段探討逆境脅迫下植物根系有機(jī)酸分泌的調(diào)控因子，例如利用表型性狀推測(cè)遺傳物質(zhì)成分、分布及傳遞規(guī)律等來(lái)研究生命過(guò)程發(fā)生及發(fā)展規(guī)律［5］。反向遺傳學(xué)法是一種利用現(xiàn)代生物理論和技術(shù)的方法，通過(guò)改變核苷酸序列的突變、缺失和插入等操作來(lái)構(gòu)建突變體，然后研究這些突變對(duì)表型效應(yīng)的影響，以揭示生命發(fā)生的基本原理［6］。然而這些方法一般存在培養(yǎng)突變體周期長(zhǎng)、基因冗余和基因突變致死等問題?；瘜W(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用于植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫研究是一個(gè)多學(xué)科交叉的新興手段。相對(duì)于傳統(tǒng)遺傳學(xué)，化學(xué)遺傳學(xué)具有實(shí)驗(yàn)周期短、對(duì)靶蛋白功能有特異性干擾等優(yōu)勢(shì)。在醫(yī)學(xué)研究中小分子化合物已被廣泛用于研究復(fù)雜的生物過(guò)程，如腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。它通過(guò)作用于特定的靶點(diǎn)受體，如通道蛋白、載體等，進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］。因此，通過(guò)應(yīng)用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，可以確定在某種疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因或蛋白質(zhì)，從而為新藥篩選提供有潛力的靶點(diǎn)。目前該種方法已被用于研究植物體內(nèi)相關(guān)生理、生化指標(biāo)的變化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等［8-11］。

本研究利用化學(xué)遺傳學(xué)研究思路篩選影響鋁誘導(dǎo)擬南芥根系分泌蘋果酸的小分子化合物，并探討小分子化合物在擬南芥中的作用靶點(diǎn)。通過(guò)小分子化合物的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了21種小分子化合物對(duì)擬南芥中蘋果酸的分泌具有顯著促進(jìn)作用。因此，基于BLAST等方法分析小分子化合物在擬南芥中的作用靶點(diǎn)，為鋁脅迫下植物根系蘋果酸分泌途徑增添新組分，可對(duì)鋁脅迫下植物根系蘋果酸分泌機(jī)制的研究提供重要理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

供試植物為野生型擬南芥Col-0（Columbia），由岐阜大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)學(xué)部植物細(xì)胞工學(xué)研究室小山博之教授研究團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)選用的270種小分子化合物由靜岡縣立大學(xué)藥學(xué)研究院小鄉(xiāng)尚久團(tuán)隊(duì)提供。

1.2" 植株培養(yǎng)

1.2.1" 擬南芥種子春化

取Col-0種子若干顆，置于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL的0.5%次氯酸鈉和0.8 mL滅菌去離子水消毒，在固定式混勻儀（MX-S）上振蕩5 min。用滅菌去離子水清洗消毒后的種子，反復(fù)清洗4～5次，最后用滅菌去離子水浸泡清洗后種子，于4 ℃中暗處理3～5天。

1.2.2" 擬南芥的培養(yǎng)表1" 2%MGRL營(yíng)養(yǎng)液配方

元素摩爾質(zhì)量（g/moL）濃度（mmol/L）用量（μL）

MgSO4·7H2O246.47150.00200

MnSO4·H2O169.011.03200

FeSO4·7H2O278.010.86200

ZnSO4·7H2O287.560.10200

CuSO4·5H2O249.680.10200

KNO3101.10300.00200

H3BO361.833.00200

（NH4）6Mo7O24·4H2O1235.860.0024200

CoCl2·6H2O237.930.013200

Na2EDTA·2H2O372.240.067200

NaNO384.99400.00200

CaCl2110.98100.002000

將春化后的種子轉(zhuǎn)移至200 mL含有2%MGRL營(yíng)養(yǎng)液（pH為5.5）的透明培養(yǎng)盒中［12］（表1）。

將擬南芥種子種于漂浮的1 cm × 1 cm網(wǎng)格上，網(wǎng)格漂浮于內(nèi)含200 mL的2% MGRL營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中。每個(gè)網(wǎng)格種植16顆擬南芥種子作為一個(gè)處理。在12 h光照/12 h黑暗、溫度為25 ℃、濕度為75%和光合光子通量密度為37μmol/m2s的條件下生長(zhǎng)4d［13］（圖1）。

1.3" 擬南芥根系分泌蘋果酸的收集

在篩選實(shí)驗(yàn)中，將上述水培4 d長(zhǎng)勢(shì)一致的擬南芥幼苗分別轉(zhuǎn)入含①0μmol/L AlCl3，②10μmol/L AlCl3，③10μmol/L AlCl3+5μmol/L小分子化合物（小分子化合物溶解于DMSO中）的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行處理，每個(gè)處理16株幼苗，三次重復(fù)（處理液pH5.0，不含P）（圖2）。

1.4" 擬南芥根尖分泌蘋果酸的測(cè)定

1.5" 基于BLAST分析小分子化合物靶蛋白對(duì)應(yīng)的擬南芥候選蛋白

根據(jù)前期擬南芥根系蘋果酸分泌量測(cè)定結(jié)果，篩選出顯著促進(jìn)根系蘋果酸分泌的小分子化合物。首先，以鋁處理作為空白對(duì)照（100%），篩選處理組中根系蘋果酸相對(duì)分泌量大于150%的小分子化合物。其次，通過(guò)Selleck.cn數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//selleck.cn）查找小分子化合物在哺乳動(dòng)物中的靶蛋白（表4）。再次，利用UniProtKB （https：//www.uniprot.org） 可查得小分子化合物在哺乳動(dòng)物中的靶蛋白氨基酸序列。最后，利用生物大分子序列比對(duì)搜索工具BLAST（Basic Local Alignment Search Tool），將小分子化合物哺乳動(dòng)物的靶蛋白氨基酸序列與擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）進(jìn)行比對(duì)，即可得出小分子化合物在擬南芥中的候選靶蛋白。由于E值越小表明比對(duì)序列之間相似性的可信度越大。因此，選取E 值≤9.00E-80的擬南芥候選蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

1.6" 數(shù)據(jù)分析

本研究數(shù)據(jù)利用Excel、SPSS、Origin、AutoDock和PyMOL等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2" 結(jié)果分析

通過(guò)水培試驗(yàn)分析270種小分子化合物對(duì)鋁誘導(dǎo)擬南芥根系蘋果酸分泌的影響。以擬南芥幼苗根系蘋果酸分泌量作為篩選依據(jù)（鋁處理為對(duì)照組，100%），初步篩選出21個(gè)顯著（≥150%）促進(jìn)根系蘋果酸分泌的小分子化合物（表4，圖3）。

這21種小分子化合物包括蛋白激酶和其他激酶抑制劑：（1）磷脂酰肌醇/NAD依賴性蛋白去乙?；敢种苿謩e是Quercetin和 TG100-115；（2）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑，分別是GDC-0068和NVP-BGT226；（3）絲裂原活化蛋白激酶抑制劑，為L(zhǎng)Y2228820；（4）受體酪氨酸蛋白激酶抑制劑，分別是Desmethyl Erlotinib、WZ8040、WZ3146、Lapatinib Ditosylate和Tandutinib；（5）酪氨酸蛋白激酶抑制劑，為NVP-BSK805；（6）肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑，為PHA-665752；（7）表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，為BMS-599626；（8）極光激酶抑制劑，分別為MLN8237和CYC116；（8）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，分別為Sunitinib Malate、KRN-633、Ki8751和Apatinib；（9）原癌基因酪氨酸激酶抑制劑，為KX2-391；（10）受體酪氨酸蛋白激酶/表皮生長(zhǎng)因子受體制劑，為Afatinib。

2.2" 小分子化合物的哺乳動(dòng)物靶蛋白對(duì)應(yīng)的擬南芥候選蛋白分析

上述21種小分子化合物已被廣泛用于研究復(fù)雜的生物過(guò)程（如腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等）。通過(guò)Selleck.cn數(shù)據(jù)庫(kù)可篩選它們?cè)诓溉閯?dòng)物中的靶蛋白。利用BLAST分析，將21個(gè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的靶蛋白與擬南芥基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)，初步篩選它們?cè)跀M南芥中的靶蛋白。在本研究中以E值作為參考依據(jù)，篩選E 值≤9.00E-80的蛋白作為擬南芥相似度較高的候選蛋白（E值越小表示比對(duì)序列之間相似性的可信度越大）。分析發(fā)現(xiàn)小分子化合物MLN8237和LY2228820對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物的靶蛋白Aurora A、B和ρ38MAPK，分別與擬南芥中的AtAurora1、AtAurora2、AtAurora3和MAPKs等12個(gè)蛋白氨基酸序列的相似度較高（表5）。

國(guó)內(nèi)外研究表明MAPKs（絲裂原活化蛋白激酶）家族成員可參與調(diào)控植物體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在鋁脅迫下植物中的MAPK級(jí)聯(lián)被激活，“MAPK信號(hào)通路-植物通路”顯著上調(diào)［16］。擬南芥的 MEKK1-MKK1-MAPK3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊在鹽脅迫1小時(shí)內(nèi)激活［17］。激酶Aurora是一種真核生物高度保守的蛋白激酶，深度參與細(xì)胞周期調(diào)控。本研究分析發(fā)現(xiàn)，小分子化合物MLN8237與AtAurora1、AtAurora2、AtAurora3的蛋白氨基酸序列相似度均較高（E 值≤9.00E-90），見表5。然而，國(guó)內(nèi)外有關(guān)Aurora參與調(diào)控鋁誘導(dǎo)植物根系有機(jī)酸分泌的研究卻鮮有報(bào)道。

3" 結(jié)論與討論

本研究利用化學(xué)遺傳學(xué)研究思路篩選促進(jìn)鋁誘導(dǎo)根系蘋果酸分泌的小分子化合物，并探討小分子化合物在擬南芥中的作用靶點(diǎn)。通過(guò)水培試驗(yàn)篩選出21個(gè)顯著（≥150%）促進(jìn)根系蘋果酸分泌的小分子化合物（表4，圖3）。BLAST分析發(fā)現(xiàn)，小分子化合物MLN8237和LY2228820在哺乳動(dòng)物中的靶蛋白Aurora A、B和p38MAPK對(duì)應(yīng)擬南芥的候選蛋白分別為AtAurora1、2、3和MAPKs，即擬南芥激酶AtAurora1、2、3和MAPKs可能參與調(diào)控鋁誘導(dǎo)的根系蘋果酸分泌過(guò)程。

MAPK在植物重金屬毒害的過(guò)程中發(fā)揮著信號(hào)傳遞的作用。研究表明，擬南芥通過(guò)編碼20種不同的MAPKs調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)［18］。由此可見，鋁活化的MAPKs 參與陰離子通道活性的調(diào)控。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫可促進(jìn)MAPK14的表達(dá)，而抑制MAPK12的表達(dá)［19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK4、MAPK5、MAPK12、MAPK14等9個(gè)絲裂原活化蛋白激酶可能參與調(diào)控鋁誘導(dǎo)擬南芥根系蘋果酸分泌。然而，MAPKs參與調(diào)控鋁誘導(dǎo)根系蘋果酸分泌的機(jī)制有待深入研究。

激酶Aurora是一種真核生物高度保守的蛋白激酶，它在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著非常重要的作用。較多癌癥中均存在激酶Aurora的過(guò)度表達(dá)，因而Aurora在抗腫瘤研究中被廣泛關(guān)注，但有關(guān)Aurora參與調(diào)控鋁誘導(dǎo)植物根系有機(jī)酸分泌的研究卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物MLN8237可能通過(guò)直接或間接地作用于擬南芥AtAuroras進(jìn)而影響根系蘋果酸分泌。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增強(qiáng) UV-B 輻射可以改變Aurora1的活性和表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致染色體異常分裂的發(fā)生。同時(shí)Aurora1 參與了對(duì)UV-B脅迫的響應(yīng)，在一定程度上可以提高植物對(duì)UV-B的耐受性［20］。由此可見，植物激酶Aurora在應(yīng)對(duì)非生物脅迫上發(fā)揮一定的作用。綜上所述，運(yùn)用化學(xué)遺傳學(xué)方法探究鋁誘導(dǎo)擬南芥蘋果酸分泌途徑新組分具有一定的可行性。在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步探討AtAurora1、AtAurora2、AtAurora3和MAPKs通過(guò)何種途徑調(diào)控根系蘋果酸的分泌。

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［責(zé)任編輯：黃天放］