摘要： 【目的】優(yōu)化核桃分心木多酚提取工藝，并研究其抗氧化活性?！痉椒ā恳栽颇涎ê颂曳中哪緸樵希脝我蛩卦囼?yàn)探究纖維素酶添加量、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)核桃分心木多酚提取率的影響，采用響應(yīng)面法對(duì)多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；通過D101 大孔樹脂對(duì)粗提物進(jìn)行初步純化得到核桃分心木多酚，并分析其純度；利用DPPH·自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及鐵還原能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性?！窘Y(jié)果】超聲輔助纖維素酶法提取核桃分心木多酚的最佳工藝為：酶添加量0.6%、料液比1∶80（g∶mL）、超聲功率600 W、超聲時(shí)間60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，多酚提取率為7.26%，初步純化得到的多酚純度為89%。核桃分心木多酚對(duì)DPPH·自由基和ABTS+自由基清除率的 IC50 值分別為11.11 和183.12 μg/mL，鐵離子還原能力達(dá)到同等質(zhì)量濃度抗壞血酸的59.62%，表明核桃分心木多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性?！窘Y(jié)論】得到核桃分心木多酚的最佳提取工藝，為核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和核桃分心木有效成分的開發(fā)利用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 核桃分心木；多酚；超聲波；纖維素酶；響應(yīng)面；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： S664.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 03?0107?09

核桃分心木是核桃果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜，主要由不易消化的纖維素和木質(zhì)素組成[1]，是核桃副產(chǎn)品之一，在加工過程中常被丟棄[2]。分心木是一種傳統(tǒng)中藥材，長期以來被用于治療失眠、腹瀉、腎虛、生殖系統(tǒng)疾病等[3-4]，也被用作民間文化中涼茶和膳食補(bǔ)充劑[5]。核桃分心木富含多種生物活性成分，包括黃酮、酚酸、多糖等[6-7]，且在體外具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫、預(yù)防心臟病、降血糖等功效[8-9]；其資源豐富，但主要被用于工業(yè)，如制作燃料或與核桃殼燒制成活性炭，利用率和附加值低，造成資源的浪費(fèi)[10-11]。

核桃分心木富含的植物多酚是一類多羥基酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病等多種功效[12]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[13]。目前，植物多酚新型綠色提取方法主要包括酶解、微波輔助、超聲輔助等[14]，這些方法具有時(shí)間短、能耗低、效率高等優(yōu)點(diǎn)[15]。其中，超聲波法和纖維素酶法聯(lián)合用于提取植物多酚已被廣泛研究。在提取條件優(yōu)化方面，國內(nèi)外學(xué)者通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析等方法，對(duì)超聲輔助酶技術(shù)的參數(shù)（如溫度、時(shí)間、功率等） 進(jìn)行了深入研究。超聲輔助酶技術(shù)可有效改善植物多酚的提取效果，提高其抗氧化、抗菌、抗炎等活性，黃敏等[16]采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚，發(fā)現(xiàn)與單一條件提取相比，酶法聯(lián)合超聲波法可明顯提高多酚得率。但有關(guān)超聲波協(xié)同纖維素酶法提取核桃分心木多酚（walnut diaphragmpolyphenol，WDP） 的研究鮮有報(bào)道。本研究采用超聲—纖維素酶醇提法提取WDP，以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)WDP 的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，以期為WDP 的開發(fā)利用提供技術(shù)支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

核桃分心木（云南漾濞彝嶺山貨有限責(zé)任公司）；食品級(jí)纖維素酶（1×104 U/g，南寧龐博生物工有限公司）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma-Aldrich公司）；福林酚（Folin-Ciocalteus） 顯色試劑（北京鼎國昌盛生物科技有限公司）；抗壞血酸（優(yōu)級(jí)，美國Sigma-Aldrich 公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平FA100 （上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；低速離心機(jī)LC-401 （安徽中科中佳科儀器有限公司）；春霖超聲波清洗機(jī)CR-100 （深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司）；AL204-1C 752 型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 WDP 的提取

干燥好的核桃分心木經(jīng)多用途粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩后（含水量≤5%） 保存?zhèn)溆?。稱取定量核桃分心木干粉， 經(jīng)超聲輔助纖維素酶醇提一定時(shí)間后，90 ℃ 高溫滅酶活5 min，冷卻后4 000 r/min 離心20 min，取上清液冷藏待用。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》（GB/T 8313—2018）[17]配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品樣液，于波長760 nm 處測(cè)定吸光度（用蒸餾水調(diào)零），以吸光度值為縱坐標(biāo)、沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=0.012 1x+0.064 9，R2= 0.999 2。

1.2.3 多酚提取率的測(cè)定

按照1.2.2 節(jié)的方法測(cè)定提取液的質(zhì)量濃度，并按照公式計(jì)算WDP 的提取率（Y）：

Y =（C ×V×N／m×1000）×100%。

式中：C 為被測(cè)液體質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為試樣溶液體積，mL；N 為總稀釋倍數(shù)；m 為核桃分心木質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)，選擇超聲溫度45 ℃且不對(duì)其展開探究，分別考察不同纖維素酶添加量 （0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （40%、50%、60%、70%、80%）、料液比[1∶20、 1∶40、 1∶60、 1∶80、 1∶100 （g∶mL）]、超聲功率（120、240、360、480、600 W） 和超聲時(shí)間（25、35、45、55、65 min） 對(duì)WDP 提取率的影響，根據(jù)結(jié)果篩選WDP 最適提取條件范圍。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取對(duì)WDP 提取率影響較大的酶添加量（A）、料液比（B）、超聲功率（C）、超聲時(shí)間（D） 4 個(gè)因素為自變量，WDP 提取率（Y） 為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面分析（表1）。

1.2.6 多酚粗提物純化

按照優(yōu)化所得的提取條件制備提取液并將其真空濃縮、冷凍干燥為粗提物備用。將預(yù)處理過的D101 大孔樹脂與2 mg/mL 粗提物溶液按料液比1∶10 （g∶mL） 置于2.0 L 錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床（25 ℃，120 r/min） 上靜態(tài)吸附6 h；待充分吸附后，將其置于玻璃層析柱中，先用蒸餾水洗滌樹脂中未被吸附的雜質(zhì)，再用30% 乙醇溶液作為洗脫劑，對(duì)大孔樹脂進(jìn)行洗脫并收集洗脫液。洗脫液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得到WDP粉末，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.7 WDP 抗氧化活性的測(cè)定

（1） DPPH·自由基清除率的測(cè)定

參考蔣金龍等[18]和邵哲等[19]的方法，精確稱取3.100 mg DPPH 置于褐色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成0.079 mmol/L DPPH工作液。取DPPH 工作液2.0 mL 置于5 mL 離心管中，取不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL） 待測(cè)樣品0.5 mL 與工作液混合，暗處放置10 min，于517 nm 處測(cè)定試驗(yàn)組的吸光度。對(duì)照組中用等量甲醇代替DPPH 工作液，以DPPH 工作液為空白對(duì)照，以抗壞血酸為陽性對(duì)照。按照公式計(jì)算清除率：

清除率=［1-（"A1 - A／A0）］×100%。

式中：A1 為試驗(yàn)組的吸光度；A 為對(duì)照組的吸光度；A0 為空白對(duì)照的吸光度。

（2） ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參考胡霞等[20]的方法并略作改進(jìn)。在5 mL離心管中加入ABTS+工作液3.8 mL，取100 μL 不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL） 的WDP 樣液混合，暗反應(yīng)10 min，于517 nm 處測(cè)定試驗(yàn)組的吸光度。以等體積乙醇溶液代替ABTS+工作液為對(duì)照組，以ABTS+工作液為空白對(duì)照，以抗壞血酸為陽性對(duì)照。按照公式計(jì)算清除率，計(jì)算公式同1.2.7 節(jié)（1）。

（3） 還原鐵抗氧化能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21-23] 的方法并略作改進(jìn)。配制2，4，6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ） 工作液和硫酸亞鐵（FeSO4） 標(biāo)準(zhǔn)液，取標(biāo)準(zhǔn)液0.1 mL 于10 mL 離心管中，加入TPTZ 工作液3.0 mL，混勻，37 ℃水浴4 min，于593 nm 處測(cè)定吸光度，用乙酸溶液（300 mmol/L，pH3.6） 調(diào)零。以FeSO4 濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制FeSO4 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=0.000 4x+0.003 1 （R2=0.997 2）。將FeSO4 溶液替換為不同質(zhì)量濃度（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 g/mL） 的WDP 溶液測(cè)定其鐵還原能力，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其抗氧化能力，得到的鐵離子還原能力以Fe2+的摩爾數(shù)表示。以抗壞血酸為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均平行重復(fù)3 次， 利用SPSS 26.0 和Design-Expert V8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并利用Prism 8.0.2 進(jìn)行整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量

由圖1 可知：隨著纖維素酶添加量的增加，WDP 提取率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)酶添加量為0.6% 時(shí)，WDP 提取率達(dá)到峰值；當(dāng)酶添加量超過0.6% 時(shí)，提取率下降。這是因?yàn)樘砑舆^多酶不利于WDP 充分溶解，導(dǎo)致提取率降低。因此，以0.6% 為纖維素酶的最適添加量。

2.1.2 料液比

由圖2 可知：在料液比（g∶mL） 為1∶20～1∶80 的變化過程中，WDP 提取率隨之升高；當(dāng)料液比為1∶80 時(shí)，提取率達(dá)到峰值；之后，提取率隨著料液比的升高而下降。這是由于過量提取液會(huì)影響細(xì)胞壁中多酚的溶出。因此，選擇1∶80 （g∶mL） 為最適料液比。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

由圖3 可知：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)由30% 升高至70%，WDP 提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60% 時(shí)，提取率達(dá)到峰值，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率逐漸下降。其原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增加導(dǎo)致脂溶性雜質(zhì)增多，從而抑制多酚溶出，導(dǎo)致提取率降低。因此，60% 為最適乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.4 超聲功率

由圖4 可知：隨著超聲功率由120 W 升至600 W，多酚提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)槌暪β侍嵘?，使得超聲波的穿透性增?qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂增加，進(jìn)而溶劑更容易滲透到樣品中，從而提升多酚溶解率。當(dāng)超聲功率達(dá)到480 W 時(shí)，提取率達(dá)到峰值；當(dāng)超聲功率超過480 W 時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)。這是由于過大功率導(dǎo)致提取體系溫度升高，使多酚發(fā)生氧化分解反應(yīng)，提取率下降。因此，480 W 為最適提取超聲功率。

2.1.5 超聲時(shí)間

由圖5 可知：隨著超聲處理時(shí)間由25 min 升至65 min，多酚提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在55 min 時(shí)達(dá)到峰值，進(jìn)一步增加超聲時(shí)間后提取率下降。這是由于長時(shí)間機(jī)械波作用下多酚特殊基團(tuán)受到破壞，從而導(dǎo)致多酚提取率降低。因此，55 min 為最適超聲時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)WDP 提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。采用二次多元回歸擬合方法獲得WDP 提取率（Y）的回歸方程：Y=7.03+0.45A+0.37B+0.21C+0.73D?0.06AB?0.17AC?0.04AD?0.38BC?0.17BD+0.12CD?0.65A2?0.74B2?0.37C2?0.70D2。

由表3 可知：所選模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），模擬的F gt;1，Pgt;0.05，回歸模型的失擬項(xiàng)不顯著，R2 為0.955 2，說明該回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)的擬合程度較為接近，可用于預(yù)測(cè)WDP 的提取率。通過P 值和F 值的比較，得出影響WDP提取率的因素順序?yàn)椋撼晻r(shí)間（D）gt;酶添加量（A）gt;料液比（B）gt;超聲功率（C）。這表明在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4 個(gè)主要因素中，超聲時(shí)間和酶添加量對(duì)提取率的影響最顯著，液料比和超聲功率對(duì)提取率也有一定影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素之間的交互作用對(duì)WDP 提取率影響的響應(yīng)面結(jié)果（圖6） 顯示： 6 個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，表明存在極大值點(diǎn)，且響應(yīng)面曲線較為陡峭，說明各因素的變化對(duì)WDP 提取率均有影響，影響程度為BCgt;ACgt;BDgt;CDgt;ABgt;AD，表明料液比（B） 與超聲功率（C） 的交互作用對(duì)WDP 提取率的影響最顯著。

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

Design-Expert V8.0.6 預(yù)測(cè)WDP 最佳提取工藝為：酶添加量0.66%、料液比1∶82.34 （g∶mL）、超聲功率509.19 W、超聲時(shí)間60.13 min，WDP提取率為7.33%。結(jié)合實(shí)際情況將工藝參數(shù)調(diào)整為：酶添加量0.60%、料液比1∶80 （g∶mL）、超聲功率600 W、超聲時(shí)間60 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得WDP 提取率為7.26%，與預(yù)測(cè)值接近，相對(duì)誤差（0.96%） 較小。說明該回歸模型優(yōu)化的工藝條件可用于提取WDP。

2.3 WDP 的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH·自由基的能力

隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，WDP 對(duì)DPPH·自由基的清除率呈先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，IC50 為11.11 μg/mL （圖7）。當(dāng)WDP 質(zhì)量濃度達(dá)0.6 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的清除作用與抗壞血酸相近，說明WDP 有較強(qiáng)的DPPH·自由基清除能力。

2.3.2 清除ABTS+自由基的能力

隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，WDP 對(duì)ABTS+自由基的清除率呈先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，IC50值為183.12 μg/mL （圖8）。當(dāng)WDP 質(zhì)量濃度達(dá)0.6 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除能力基本與抗壞血酸持平，說明WDP 有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。

2.3.3 還原鐵抗氧化能力

由圖9 可知：隨著質(zhì)量濃度的增加，WDP對(duì)Fe3+的還原能力也隨之增加；不同質(zhì)量濃度的WDP 和抗壞血酸都可在一定程度上還原Fe3+，但WDP 的還原能力均小于抗壞血酸 （圖9）。

3 討論

作為核桃加工過程中的副產(chǎn)物，核桃分心木的潛在價(jià)值并未被忽視。近年來，中醫(yī)治療領(lǐng)域?qū)ζ浣o予了越來越多關(guān)注，原因在于其富含多種活性成分[23-25]，這些成分主要是多酚類物質(zhì)，具有顯著的抗氧化性能。若能有效地提取并利用這些化合物，不僅可以進(jìn)一步開發(fā)該資源，還能將其轉(zhuǎn)化為天然抗氧化劑的來源，為保障人類健康提供新途徑[26]。

相較于傳統(tǒng)植物多酚的提取工藝而言，超聲輔助酶法不僅安全、環(huán)保、高效，而且可以保護(hù)活性成分，是一種比較理想的天然產(chǎn)物活性成分提取方法[27-30]。本研究采用超聲波輔助纖維素酶提取WDP，效率高、過程環(huán)保，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。以多酚提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率600 W、超聲時(shí)間60 min、酶添加量0.6%、料液比1∶80 （g∶mL），在此參數(shù)條件下，WDP 提取率為7.26%。劉靜等[7]采用超聲輔助乙醇提取WDP，利用Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，提取率為6.98%。可見，與單一提取方法相比，超聲波輔助酶法可提高多酚提取率。

目前，市面上常用的抗氧化劑多為人工合成，在使用中存在安全隱患，也越來越受到限制，因此，研究開發(fā)植物中的天然抗氧化劑日益受到重視[31-32]。多酚是植物中的化合物，是天然抗氧化劑。目前常用的抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)有DPPH·自由基、ABTS+自由基和總還原能力等[33]，因此，本研究采用以上3 種指標(biāo)評(píng)價(jià)WDP 的抗氧化活性。研究結(jié)果表明：WDP 對(duì)DPPH·自由基和ABTS+自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且有一定質(zhì)量濃度依賴性；在同一質(zhì)量濃度處理下，WDP對(duì)鐵離子的還原能力為陽性對(duì)照的59.62%，表明WDP 具有較強(qiáng)的抗氧化性，可將其開發(fā)成為天然抗氧化劑。但本研究僅對(duì)超聲輔助纖維素酶法提取WDP 的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，該技術(shù)是否會(huì)影響WDP 的生物活性尚不清楚，在后續(xù)研究中，可對(duì)不同提取方法與生物活性間的關(guān)系進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

超聲輔助纖維素酶法提取核桃分心木多酚的最佳提取工藝為：超聲功率600 W、超聲時(shí)間60 min、酶添加量0.6%、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶80 （g∶mL），該條件下WDP 提取率為7.26%。此外，WDP 清除DPPH·自由基、ABTS+自由基以及還原鐵離子的能力較強(qiáng)，有望作為潛在的天然抗氧化劑。本研究結(jié)果為開發(fā)天然的抗氧化劑和云南核桃分心木多酚的深入研究奠定了基礎(chǔ)，并為從農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物中提取生物活性成分提供了實(shí)踐參考。

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責(zé)任編輯：何承剛

基金項(xiàng)目：云南省科技廳重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（202002AA100005，202102AE090027-2）；云南省科技廳云南綠色食品國際合作研究中心項(xiàng)目（2019ZG00905）。