【摘 要】目的：觀察miR-146a調(diào)控TLRs信號(hào)通路對(duì)活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的影響。方法：選取20例活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，對(duì)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分離培養(yǎng)，分為L(zhǎng)PS組

和LPS + miR-146a組；同時(shí)選取10例健康體檢者為健康對(duì)照組。采用MTT法測(cè)定吸光度，比較外周血單個(gè)核細(xì)胞變化，檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡情況。RT-PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、Toll樣受體2

（TLR2）、髓樣分化因子88（MyD88）mRNA表達(dá)。Western blot法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、

TLR2、MyD88蛋白表達(dá)。結(jié)果：LPS組較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2表達(dá)

明顯升高（P < 0.05）；LPS組較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a、TLR2、

MyD88 mRNA表達(dá)明顯升高（P < 0.05）；LPS組較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88蛋白表達(dá)明顯升高（P < 0.05）。結(jié)論：高表達(dá)miR-146a可能通過依賴

TLR2/MyD88信號(hào)通路，抑制活動(dòng)期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR2、MyD88表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；外周血單個(gè)核細(xì)胞；miR-146；Toll樣受體2；髓樣分化因子88

The Effect of miR-146a Regulating TLRs Signaling Pathway on Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients with Rheumatoid Arthritis

YAN Hui-ming，LIU He-hong，ZHANG Xue，ZHANG Li-xia，YAN Shi，XUE Yi-ping，SUN Ying-mei

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of miR-46 regulation of TLRs signaling pathway on peripheral blood mononuclear cells in patients with active rheumatoid arthritis.Methods：Twenty patients with

active rheumatoid arthritis were selected and divided into the LPS group and the LPS + miR-146a group，and peripheral blood mononuclear cells in them were isolated and cultured.At the same time，ten healthy examinees were selected as the healthy control group.MTT method was used to measure absorbance，changes in peripheral blood mononuclear cells were compared，and apoptosis of peripheral blood mononuclear cells was detected.

RT-PCR was used to detect the mRNA expression of miR-146a，TLR2，and MyD88 in peripheral blood mononuclear

cells.Protein immunoblotting was used to detect the protein expression of miR-146a，TLR2，and MyD88 in peripheral blood mononuclear cells.Results：The TLR2 expression rate of peripheral blood mononuclear cells in the LPS group was significantly increased compared to the healthy control group and the LPS + miR-146a group

（P < 0.05）;the expression of protein mRNA of miR-146a，TLR2，and MyD88 in peripheral blood mononuclear cells of the LPS group was significantly increased compared to the healthy

control group and the LPS + miR-146a

group（P < 0.05）;the protein levels of miR-146a，TLR2，and MyD88 in peripheral blood mononuclear cells were significantly increased in the LPS group compared to the healthy control group and the LPS + miR-146a group（P < 0.05）.Conclusion：High expression may inhibit the expression of TLR2 and MyD88 in peripheral blood mononuclear cells of patients with active rheumatoid arthritis by relying on the TLR2/MyD88 signaling pathway，reducing inflammatory response.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;peripheral blood mononuclear cells;miR-146a;TLR2;MyD88

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性破壞性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前未完全闡明，但與自身免疫異常引起的致炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等的釋放有關(guān)。目前研究證實(shí)，Toll樣受體（TLRs）主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，可識(shí)別病原體的分子結(jié)構(gòu)，并與之結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，以TLR2和TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在RA發(fā)病中有重要的作用。髓樣分化因子88（MyD88）存在于所有TLRs信號(hào)通路中，是TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵接頭蛋白。在RA活動(dòng)期，外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TLRs是增加的。miR-146是內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，可以與特異性靶結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或者抑制mRNA負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因，抑制其下游信號(hào)通路［1］。miR-146可能通過抑制TLRs信號(hào)通路中TRAF-6的產(chǎn)生和IRAK-1的磷酸化，抑制MyD88與IRAK結(jié)合與活化，從而抑制TLRs下游關(guān)鍵銜接分子MyD88產(chǎn)生，抑制TLRs活化，減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-2、MMP-3、MMP-13的分泌，最終減輕RA炎癥。因此，本研究擬探討miR-146a與TLRs信號(hào)通路的關(guān)系，為臨床治療或者診斷RA提供更有價(jià)值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021年1月至2022年1月在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的經(jīng)評(píng)估后處于活動(dòng)期RA患者20例，活動(dòng)期判定標(biāo)準(zhǔn)為既往確診RA，近1個(gè)月有關(guān)節(jié)腫脹、壓痛，紅細(xì)胞沉降率和C反應(yīng)蛋白增高。均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)［2］。其中男6例，女14例；年齡20～82歲，平均（37.85±11.23）歲。同時(shí)選取10例健康體檢者為健康對(duì)照組，男1例，女9例；年齡24～50歲，平均（30.26±6.28）歲。2組在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象均排除血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及其他自身免疫疾病等。本研究通過內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑與儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液、PBS、RPMI1640培養(yǎng)基、X-VIVO 15TM無(wú)血清培養(yǎng)基、Trizol試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒、脂多糖（LPS）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶-EDTA、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（大連寶生物公司，批號(hào)分別為2105332，2045322，2110232，2114732，207532，1942650，2004265，

2007313，00822820）；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試

劑（美國(guó)Pepro Tech公司，批號(hào)2211033）；熒光定量PCR循環(huán)儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)PIKOREAL96）；Western電泳儀（美國(guó)伯樂公司，型號(hào)E-Gel）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beekton Dickson公司，型號(hào)DxFLEX）。

1.3 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、培養(yǎng) RA患者及健康對(duì)照組均于清晨空腹時(shí)抽取5 mL靜脈血，肝素抗凝置于離心機(jī)以3000 r·min-1離心10 min，離心半徑15 cm。用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，收集0.5 mL于凍存管中置于-80 ℃冰箱備用。檢測(cè)前室溫凍融凍存管30 min，擦拭乙醇后放培養(yǎng)箱靜置4 h，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。然后鏡檢，記錄細(xì)胞狀態(tài)，傳代。待貼壁細(xì)胞密度超過80%，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，后棄上清，將37 ℃預(yù)熱PBS輕洗細(xì)胞培養(yǎng)板2遍，獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞。RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸（內(nèi)含100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清）細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106·mL-1，分為3組觀察，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。健康對(duì)照組：健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞，不給予干預(yù)。LPS組：選取10例RA活動(dòng)期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，給予100 ng·mL-1 LPS干預(yù)，用倒置相差顯微鏡觀察是否刺激成功。LPS +

miR-146a組：其余10例RA活動(dòng)期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，給予100 ng·mL-1 LPS干預(yù)成功后，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-146a，用熒光檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。LPS組和LPS + miR-146a組更換為含LPS的DMEM培養(yǎng)基，健康對(duì)照組為不含LPS的培養(yǎng)基，孵育24 h。

1.4 采用MTT法測(cè)定吸光度 配制MTT溶液為0.5 mg·mL-1，置于4 ℃冰箱避光保存。將培養(yǎng)好的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104～1×105個(gè)·mL-1。將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μL，每孔加入0.5 mg·mL-1 MTT溶液20 μL。將96孔板置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2氣體37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄細(xì)胞上清液，每孔加入100 μL DMSO裂解液，置于室振蕩器避光振搖10 min。將板孔放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置波長(zhǎng)為490 nm，讀取各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖率，比較單個(gè)核細(xì)胞增殖活力變化，檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 采用RT-PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞

miR-146a、TLR2及MyD88 mRNA表達(dá) Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的質(zhì)量。采用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。取RNA樣品5 μL，GAPDH為內(nèi)參基因，使用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min×1次；94 ℃ 30 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min×1次。溶解曲線：以60 ℃為初始溫度，每隔30 s升高0.5 ℃，至95 ℃。測(cè)定miR-146a、TLR2、MyD88 mRNA表達(dá)量。

1.6 采用Western blot法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88蛋白表達(dá) 用等量的蛋白樣本（50 μg）進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉過夜（4 ℃），棄封閉液。加入封閉液稀釋好的miR-146a、TLR2、MyD88及GAPDH抗體（1∶1000），TBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫下?lián)u蕩孵育2 h。然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。顯影液置膜上，凝膠成像儀成像。GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參蛋白，得出miR-146a/GAPDH、TLR2/GAPDH，MyD88/GAPDH的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2表達(dá)率比較 LPS組外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2表達(dá)率較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組明顯升高（P < 0.05）。見表2。

2.2 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88 mRNA表達(dá)比較 LPS組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88 mRNA的表達(dá)較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組明顯升高（P < 0.05）。見表3。

2.3 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88蛋白表達(dá)比較 LPS組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88蛋白表達(dá)較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組明顯升高（P < 0.05）。見表4。

3 討 論

近年來(lái)研究表明，TLRs在RA的發(fā)病過程中起著極其重要的作用，致病因子主要通過激活依賴于TLRs信號(hào)通路的不同傳導(dǎo)途徑，特別是MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。TLRs是主要表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞膜表面的結(jié)合蛋白，可識(shí)別病原體不同的分子結(jié)構(gòu)，并與之結(jié)合上調(diào)炎性細(xì)胞因子和趨化因子，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中以TLR2和TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在RA發(fā)病中有重要的作用［3］。MyD88存在于所有TLR信號(hào)中，是TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，MyD88死亡結(jié)構(gòu)域的缺失可導(dǎo)致下游IRAK的招募活動(dòng)受限，致使炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12及TNF-α作用明顯減弱，從而對(duì)TLRs和IL-1R信號(hào)起負(fù)性調(diào)控作用［4-5］。因此，筆者通過模擬外周血單個(gè)核細(xì)胞的炎癥過程，使其激活信號(hào)通路中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，再通過負(fù)反饋抑制細(xì)胞通路中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，降低炎癥反應(yīng)，試圖找到控制疾病的關(guān)鍵因子。

有研究認(rèn)為，早期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TLR2下降，當(dāng)TLR2受到刺激后可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，由此認(rèn)為，此時(shí)可能單個(gè)核細(xì)胞處于活化狀態(tài)，通過TLRs受體啟動(dòng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，合成和釋放大量炎癥因子。如果抑制TLR2，可以使模型小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度降低，骨破壞及炎癥反應(yīng)減輕［6］。本研究結(jié)果證明，LPS組TLR2表達(dá)率較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組明顯升高，TLR2作為TLRs細(xì)胞通路在RA中的關(guān)鍵通路，可能通過抑制TLRs通路，進(jìn)一步減輕炎癥過程。與上述部分研究結(jié)果一致。筆者推測(cè)可能在RA早期，外界因素對(duì)免疫細(xì)胞的刺激可能是間斷性的，使得外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TLR2忽高忽低，TLRs與配體結(jié)合程度疏松，易解離相應(yīng)的關(guān)節(jié)癥狀也是間斷性發(fā)作。

既往研究報(bào)道，處于活動(dòng)期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TLRs增加，高表達(dá)TLRs通過識(shí)別關(guān)節(jié)內(nèi)病原體相關(guān)分子與損傷相關(guān)分子活化

NF-κB/MAPK/IRF-3信號(hào)通路，觸發(fā)了多種炎癥因子和趨化因子，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎及骨破壞［7-8］。本研究LPS組TLR2表達(dá)率較LPS + miR-146a組和健康對(duì)照組高，可能是單個(gè)核細(xì)胞受到激活，免疫細(xì)胞表面產(chǎn)生TLR2增多，與國(guó)內(nèi)外研究一致。研究表明，miR-146作為內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過與腫瘤TRAF6和IRAK-1 mRNA的3'端非編碼區(qū)（3'-uTR）靶向性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或者抑制mRNA翻譯負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而抑制其下游信號(hào)通路［9］。本研究中LPS組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-146a、TLR2、MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)較健康對(duì)照組和LPS + miR-146a組高。LPS組外周血單個(gè)核細(xì)胞處于炎癥期，細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)miR-146a、TLR2、MyD88表達(dá)蛋白均增加，LPS + miR-146a組表達(dá)miR-146a、TLR2、MyD88量接近健康對(duì)照組。由此推測(cè)，過高的miR-146a通過抑制TLRs信號(hào)通路中TRAF-6的產(chǎn)生和IRAK-1的磷酸化，抑制MyD88與IRAK結(jié)合與活化，從而抑制TLRs下游關(guān)鍵銜接分子MyD88產(chǎn)生，抑制TLR2活化，減少炎癥因子的分泌，最終可能減輕炎癥反應(yīng)，與熊瑤等［10-11］的研究結(jié)果一致。

總之，RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究關(guān)于高表達(dá)miR-146a對(duì)活動(dòng)期RA患者TLR2/MyD88信號(hào)通路的抑制作用還處于探索階段，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。我們?cè)诮窈笱芯恐幸矔?huì)結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，積極尋找關(guān)于miR-146a和TLRs信號(hào)通路關(guān)系的確切聯(lián)系，進(jìn)一步闡明miR-146a在TLRs細(xì)胞通路中扮演的具體角色，希望能發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床治療或者診斷RA更有價(jià)值的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ MCINNES IB，SCHETT G.The pathogenesis of

rheumatoid arthritis［J］.N Engl J Med，2011，365（23）：2205-2219.

［2］ 蔡輝，姚茹冰.新編類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎手冊(cè)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2013：80-81.

［3］ 孔瑞娜.艾拉莫德調(diào)控miR-146a介導(dǎo)的IRAK1/TRAF6/JNK1通路治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究［D］.上海：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)，2020.

［4］ 趙創(chuàng)，李曉燕，陳春蘭，等.艾灸對(duì)CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎及miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-21表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2017，33（6）：60-64.

［5］ MORTAZAVI-JAHROMI SS，AHMADZADEH A，REZAIEYAZDI Z，et al.The role of β-d-mannuronic acid，as a new non-steroidal anti-inflammatory drug on expression of miR-146a，IRAK1，TRAF6，NF-κB and pro-inflammatory cytokines following a clinical trial in rheumatoid arthritis patients［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2020，42（3）：228-236.

［6］ 鐘麗紅，丘創(chuàng)華，彭紫元，等.miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中檢測(cè)的臨床意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2020，17（4）：447-451.

［7］ 馮佳，夏燕，陳安平，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a及miR-155的表達(dá)及臨床意義［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（10）：8-11

［8］ 黃勤，毛慧慧.miR-146干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的影響［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，40（6）：650-653，657.

［9］ 陳建華，陳利鋒，朱詩(shī)聰，等.miR-146a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的影響及機(jī)制研究進(jìn)展［J］.華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2019，33（7）：507-510.

［10］ 熊瑤.miR-146a、miR-155-5p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制研究［D］.泉州：華僑大學(xué)，2019.

［11］ 郭庭余，陳祝明，鄒尚瀏，等.TLRs受體及其在RA發(fā)病信號(hào)傳導(dǎo)的研究進(jìn)展［J］.系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2020，5（17）：196-198.

收稿日期：2023-11-26；修回日期：2024-01-09