【摘要】 目的：探討外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能預(yù)測人工周期-凍融胚胎移植結(jié)局的價(jià)值。方法：選取2021年1月—2023年12月于贛州市人民醫(yī)院行人工周期-凍融胚胎移植的患者108例，其中妊娠成功48例，妊娠失敗60例。觀察比較妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3、D-二聚體（D-D）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）和凝血酶原時(shí)間（PT）的差異，并分析外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指標(biāo)預(yù)測人工周期-凍融胚胎移植結(jié)局的價(jià)值。結(jié)果：妊娠成功患者外周血miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗患者，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗患者（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失敗的影響因素（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT預(yù)測妊娠失敗的受試者操作特征（ROC）曲線下面積分別為0.857、0.790、0.922和0.861。結(jié)論：人工周期-凍融胚胎移植成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT有所差異，且在預(yù)測妊娠結(jié)局方面有一定應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 miR-21-5p Foxp3 凝血功能 人工周期-凍融胚胎移植 預(yù)測價(jià)值

Value of Peripheral Blood miR-21-5p， Foxp3 and Coagulation Function in Predicting the Outcome of Artificial Cycle - Frozen Embryo Transfer/LEI Chengyong， LI Li， LUO Zhaoxia， HUANG Ying. //Medical Innovation of China， 2024， 21（18）： -143

[Abstract] Objective： To explore the value of peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer. Method： A total of 108 patients who underwent artificial cycle - frozen embryo transfer in Ganzhou People's Hospital from January 2021 to December 2023 were selected， of which 48 had successful pregnancy and 60 had failed pregnancy. The differences of miR-21-5p，

Foxp3， D-dimer （D-D）， activated partial thromboplastin time （APTT） and prothrombin time （PT） in peripheral blood of patients with successful and failed pregnancy were observed and compared. The value of miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function indexes in peripheral blood in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer was analyzed. Result： The peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 mRNA and D-D of the patients with successful pregnancy were higher than those of the patients with failed pregnancy， and APTT and PT were significantly longer than those of the patients with failed pregnancy （P<0.05）. miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT were the influential factors of pregnancy failure （P<0.05）. The receiver operator characteristic （ROC） area under the curve of miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT for predicting pregnancy failure were 0.857， 0.790， 0.922 and 0.861， respectively. Conclusion： miR-21-5p， Foxp3， D-D and PT in peripheral blood of patients with successful and failed artificial cycle - frozen embryo transfer are different， and they have certain application value in predicting pregnancy outcome.

[Key words] miR-21-5p Foxp3 Coagulation function Artificial cycle - frozen embryo transfer Predictive value

First-author's address： Department of Reproductive Medicine， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.18.032

凍融胚胎移植（frozen embryo transfer， FET）作為輔助生殖技術(shù)的一部分，已逐漸成為提高不孕不育夫婦妊娠率的重要策略。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國的不孕癥患病率為7%～10%，這不僅對育齡夫婦的身心健康構(gòu)成了嚴(yán)重影響，也對家庭和社會和諧造成了負(fù)面影響[1]。雖然FET具有周期短、胚胎利用率高和并發(fā)癥發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，但其成功率仍不夠高，據(jù)報(bào)道，我國FET的成功率為38.60%～68.42%，這一數(shù)據(jù)顯然還有提升的空間[2]。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）這一類非編碼小分子RNA在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，影響卵巢功能和子宮內(nèi)膜的容受性，從而可能影響到FET的成功率[3]。有研究證實(shí)，miR-21-5p在多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）大鼠中的表達(dá)降低，其高表達(dá)能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，這可能對FET的成功率有著潛在的影響[4]。此外，免疫系統(tǒng)在妊娠中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Foxp3作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的重要亞型，通過分泌的細(xì)胞因子如白介素-10，能顯著地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，降低免疫系統(tǒng)的過度活躍，從而維護(hù)正常妊娠[5]。有研究表明，F(xiàn)oxp3信使核糖核酸（Foxp3 messenger RNA，F(xiàn)oxp3 mRNA）在黃體期的低表達(dá)與反復(fù)植入失敗之間存在關(guān)聯(lián)[6]。凝血功能的平衡對胚胎著床至關(guān)重要，凝血功能障礙可能通過干擾胚胎著床進(jìn)而影響妊娠結(jié)果[7]。盡管凝血指標(biāo)在預(yù)測妊娠結(jié)局方面的作用受到認(rèn)可，但具體應(yīng)用哪些指標(biāo)來預(yù)測妊娠結(jié)局在學(xué)術(shù)界尚未形成共識?；诖?，本研究旨在綜合探討miRNA、免疫應(yīng)答及凝血功能對FET患者妊娠率的影響，以期為提高FET的成功率提供更為深入和全面的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—2023年12月于贛州市人民醫(yī)院行人工周期-FET的患者108例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～40歲；（2）內(nèi)分泌激素水平正常；（3）月經(jīng)周期規(guī)律，有優(yōu)勢卵泡；（4）近3個月未使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等子宮疾?。唬?）有吸毒等不良嗜好；（3）有精神疾??；（4）有腹部手術(shù)史。本次研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)?；颊呒凹覍僦橥?。

1.2 方法

1.2.1 人工周期-FET 在進(jìn)行子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備時(shí)，本研究采取激素替代療法。胚胎通過玻璃化冷凍法（Vitrolife公司，冷凍解凍試劑盒）進(jìn)行冷凍保存，并在移植當(dāng)日通過玻璃化解凍法（Vitrolife公司，冷凍解凍試劑盒）進(jìn)行解凍。通過B超技術(shù)，監(jiān)測子宮內(nèi)膜的厚度和形態(tài)，并根據(jù)需要調(diào)整雌激素的劑量，直至增殖期子宮內(nèi)膜厚度達(dá)到或超過8 mm。在子宮內(nèi)膜達(dá)到適宜厚度后的第4天，進(jìn)行胚胎移植。移植前，評估胚胎卵裂球的完整性，并將存活率達(dá)ymrrqBiUajywxRX5pbelmOFLBzdNr3RNtH4DJE1kttk=到或超過50%的卵裂球定義為健康的胚胎，以便進(jìn)行移植。妊娠成功標(biāo)準(zhǔn)：胚胎移植35 d后行陰道B超檢查，顯示子宮腔內(nèi)有妊娠囊及胎心搏動。

1.2.2 指標(biāo)檢測 （1）miR-21-5p?；颊呖崭?fàn)顟B(tài)下采集3 mL外周靜脈血樣，用北京天根公司提供的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，使用miRNA提取試劑盒從血液樣本中分離出總miRNA；接下來，應(yīng)用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；隨后，進(jìn)行miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析，使用針對miR-21-5p和內(nèi)參基因U6的專一性引物進(jìn)行。PCR反應(yīng)遵循的程序包括：先在95 ℃下預(yù)變性3 min，然后95 ℃下15 s、60 ℃下34 s，循環(huán)40輪。通過PCR獲得的循環(huán)曲線和循環(huán)閾值（Ct）來分析數(shù)據(jù)，以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt的方法來計(jì)算miR-21-5p的相對表達(dá)量。（2）Foxp3。采集患者4 mL的靜脈血樣本并使用乙二胺四乙酸作為抗凝劑，隨后以1︰1的比例使用PBS溶液進(jìn)行稀釋。接著，利用淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)進(jìn)行單核細(xì)胞的分離，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/L。取100 μL的細(xì)胞懸液，分別添加20 μL的CD4-PE和CD25-FITC標(biāo)記抗體，于室溫下暗處孵育20 min。之后，加入冷PBS進(jìn)行洗滌并進(jìn)行離心，去除上清并添加2 mL的細(xì)胞破膜液，在4 ℃暗處孵育1 h。經(jīng)過兩次洗滌后，加入2 μL的小鼠血清進(jìn)行封閉，孵育20 min。隨后加入20 μL的Foxp3抗體，在4 ℃暗處孵育30 min，再次洗滌兩次后，使用Beckman Coulter生產(chǎn)的CytoFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測。（3）凝血功能指標(biāo)。利用Sysmex CA-6000 Series全自動血液分析儀檢測D-二聚體（D-dimer，D-D）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin，APTT）和凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件。計(jì)量資料包括年齡、miR-21-5p等，用（x±s）表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異；計(jì)數(shù)資料包括不孕類型等，用率（%）表示，用字2檢驗(yàn)分析組間差異；預(yù)測妊娠失敗的價(jià)值采用受試者操作特征（ROC）曲線分析；妊娠失敗的影響因素采用logistic回歸分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠成功和失敗患者的臨床資料比較

本次研究妊娠成功48例，納為妊娠成功組，妊娠失敗60例，納為妊娠失敗組。兩組年齡、體重指數(shù)、不孕類型和病因比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指標(biāo)比較

妊娠成功組miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗組，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗組（P<0.05）；兩組TT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 多因素分析

將miR-21-5p（實(shí)測值）、Foxp3 mRNA（實(shí)測值）、D-D（實(shí)測值）、APTT（實(shí)測值）和PT（實(shí)測值）作為自變量，妊娠結(jié)局（成功=0，失敗=1）作為應(yīng)變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示：miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失敗的影響因素（P<0.05），見表3。

2.4 miR-21-5p、Foxp3及凝血功能預(yù)測妊娠結(jié)局的價(jià)值

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT預(yù)測妊娠失敗的ROC曲線下面積分別為0.857、0.790、0.922和0.861，見表4和圖1。

3 討論

在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，F(xiàn)ET是一種常見的臨床實(shí)踐，旨在提高妊娠成功率并改善生殖結(jié)局[8]。然而，F(xiàn)ET的成功率受多種生物學(xué)和臨床因素的影響，這些因素包括但不限于內(nèi)分泌狀態(tài)、胚胎質(zhì)量、免疫和凝血功能的變化。因此，尋找能夠預(yù)測FET成功率的生物標(biāo)志物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

在本研究結(jié)果中，妊娠成功組和妊娠失敗組年齡、體重指數(shù)、不孕類型和病因的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明這些因素不會對患者的妊娠結(jié)局產(chǎn)生顯著影響。另外，妊娠成功患者外周血

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗患者，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗患者（P<0.05），提示這些指標(biāo)可能與妊娠結(jié)局具有密切相關(guān)性。進(jìn)一步將miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D、APTT和PT作為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示這些變量（除APTT外）是妊娠失敗的獨(dú)立影響因素，這強(qiáng)化了單變量分析的發(fā)現(xiàn)，即這些變量可能直接或間接影響妊娠結(jié)局。由此，本研究通過ROC曲線分析發(fā)生，miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT在預(yù)測妊娠失敗方面顯示出較好的價(jià)值，這為臨床實(shí)踐中改進(jìn)妊娠結(jié)果提供了潛在的生物標(biāo)志物。

分析原因?yàn)椋琺iR-21已被發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡液內(nèi)表達(dá)異常，這種表達(dá)與顆粒細(xì)胞內(nèi)的游離睪酮和游離雄激素水平緊密相關(guān)[9-10]。李紅娟等[11]的研究表明，在PCOS大鼠模型中，miR-21-5p的表達(dá)水平顯著降低，而高表達(dá)miR-21-5p能夠有效抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，這一發(fā)現(xiàn)表明miR-21-5p在保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞、維持其正常功能方面具有重要作用。張麗等[12]的研究進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)miR-21-5p表達(dá)水平的降低與PCOS患者不孕發(fā)顯著相關(guān)。具體機(jī)制可能涉及以下幾個方面：首先，miR-21-5p表達(dá)降低會促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，而顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育和成熟過程中起著關(guān)鍵作用，其過度凋亡會影響卵泡的正常發(fā)育；其次，顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成部分，miR-21-5p的低表達(dá)可能通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育過程，導(dǎo)致排卵異常和不孕；最后，miR-21-5p的低表達(dá)可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良和卵泡數(shù)量減少，從而降低卵巢儲備功能，影響生育能力[13]。

Foxp3是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，主要在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中表達(dá)，對于T細(xì)胞的功能分化具有決定性的作用[14]。具體來說，F(xiàn)oxp3通過促進(jìn)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化并抑制Th1細(xì)胞的活性，建立一種抗炎和免疫耐受的環(huán)境，這對于胚胎免受母體免疫系統(tǒng)攻擊至關(guān)重要。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞釋放的抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β和IL-10進(jìn)一步促進(jìn)了這種耐受環(huán)境，幫助維持妊娠的穩(wěn)定。因此，F(xiàn)oxp3不僅是細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)器，也是維持妊娠所需免疫平衡的關(guān)鍵因素，對于確保母體對胚胎的免疫耐受、促進(jìn)妊娠的順利進(jìn)行具有重要意義。在文獻(xiàn)[15]的研究中指出，在體外受精及胚胎移植過程中不成功的患者，其外周血中的Foxp3的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，本研究結(jié)果與之一致。

D-D是纖維蛋白降解的產(chǎn)物，反映了體內(nèi)纖維蛋白的生成和降解情況。較高的D-D水平表明體內(nèi)有更活躍的纖維蛋白代謝，這在一定程度上反映了胚胎植入成功后對局部微血管的修復(fù)和重塑需求增加[16]。其次，成功妊娠需要一個良好的子宮內(nèi)膜環(huán)境，較高的D-D水平可能與更好的子宮內(nèi)膜血供和適應(yīng)性變化相關(guān)，可幫助支持胚胎植入和早期發(fā)育[17]。此外，D-D水平升高還與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，成功妊娠過程中，免疫系統(tǒng)需要在保護(hù)胚胎免受母體免疫攻擊和防止感染之間保持平衡，適度的凝血活動和纖溶系統(tǒng)的參與有助于這一過程[18]。最后，妊娠成功不僅依賴于局部子宮內(nèi)環(huán)境的變化，還涉及母體系統(tǒng)性適應(yīng)，包括血液凝固機(jī)制的調(diào)整，較高的D-D水平反映了母體對妊娠的適應(yīng)性反應(yīng)，如血液流變性的改變，以支持胎盤和胚胎的發(fā)育。PT是評價(jià)外源性凝血途徑和共同凝血途徑的一個指標(biāo)。妊娠移植失敗患者中，D-D水平較低，PT縮短主要反映凝血系統(tǒng)功能紊亂，這可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜對胚胎的支持不足，影響胚胎的正常植入和發(fā)育[19-20]。

綜上所述，人工周期-FET妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT指標(biāo)有所差異，且在預(yù)測妊娠結(jié)局方面有一定應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] LAWRENZ B，MELADO L，F(xiàn)ATEMI H M.Frozen embryo transfers in a natural cycle： how to do it right[J].Curr Opin Obstet Gynecol，2023，35（3）：224-229.

[2] ZHANG Y，F(xiàn)U X，GAO S，et al.Preparation of the endometrium for frozen embryo transfer： an update on clinical practices[J].Reprod Biol Endocrinol，2023，21（1）：52.

[3] ZHU Y，CAI Y，ZHENG B，et al.Alteration of lncRNA expression in mice placentae after frozen embryo transfer is associated with increased fetal weight[J].Reprod Biol，2022，22（2）：100646.

[4] CAO M， ZHAO Y， CHEN T，et al.Adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal microRNAs ameliorate polycystic ovary syndrome by protecting against metabolic disturbances[J].Biomaterials，2022，28（8）：121739.

[5]王貝貝，馬麗麗，曹宇新.孕晚期胎膜早破孕婦陰道內(nèi)菌群變化、外周血單個核細(xì)胞FoxP3、STAT5表達(dá)及妊娠結(jié)局[J].中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2022，30（12）：2816-2820.

[6]曾彬，于婉瑩，李翠，等.外周血自然殺傷細(xì)胞、Treg細(xì)胞和Foxp3表達(dá)與體外受精胚胎移植術(shù)不良結(jié)局的相關(guān)性及預(yù)測價(jià)值研究[J].中國醫(yī)刊，2021，56（1）：85-87.

[7]宋家美，陳靜思，鄧玉梅，等.不孕癥女性IVF助孕前后凝血四項(xiàng)及D二聚體變化與妊娠結(jié)局[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（1）：85-88.

[8]王春艷，王婕妤，程靜嫻，等.輔助生殖技術(shù)與子代安全[J].國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2023，42（3）：226-230.

[9] NAJI M，ALEYASIN A，NEKOONAM S，et al.Differential expression of miR-93 and miR-21 in granulosa cells and follicular fluid of polycystic ovary syndrome associating with different phenotypes[J].Sci Rep，2017，7（1）：14671.

[10]陳惠香，魏孫祥，王哲，等.基于miR-451a/miR-21-5p的表達(dá)量關(guān)系鑒別月經(jīng)血與外周血[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2022，37（5）：476-480，484.

[11]李紅娟，唐小珂，王雅莉.微RNA-21-5p靶向PDCD4基因?qū)Χ嗄衣殉簿C合征大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其分子機(jī)制研究[J]. 中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2019，25（4）：450-454.

[12]張麗，李友云，王永超，等.外周血miR-21-5p表達(dá)對多囊卵巢綜合征不孕患者人工授精結(jié)局的預(yù)測價(jià)值[J].分子診斷與治療雜志，2021，13（1）：87-90.

[13] QIU F，TONG H，WANG Y，et al.Inhibition of miR-21-5p suppresses high glucose-induced proliferation and angiogenesis of human retinal microvascular endothelial cells by the regulation of AKT and ERK pathways via maspin[J].Biosci Biotechnol Biochem，2018，82（8）：1366-1376.

[14]黃葉芳，朱博玉，王妍，等.銀甲片通過糾正外周血Th17/Treg平衡改善慢性輸卵管炎大鼠不孕[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2023，40（19）：2635-2642.

[15]李瑾然，吳瑛，高倩，等.外周血凝血功能指標(biāo)對凍融胚胎移植妊娠結(jié)局影響研究[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2023，39（9）：953-956.

[16]李蘭，李偉偉.β-HCG、Hcy、CA125、D-D及FIB聯(lián)合檢測在預(yù)測早期流產(chǎn)中的價(jià)值[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2021，42（3）：266-269.

[17]左延娟，劉艷麗，馬園園.孕早期D-D、AMH和P水平聯(lián)合預(yù)測先兆流產(chǎn)保胎結(jié)局的作用研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2021，29（1）：43-46.

[18]耿玲玲，邱建國，張文華，等.超聲多模態(tài)評分及sFlt-1、D-Dimer對原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)妊娠結(jié)局的預(yù)測[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，46（11）：1490-1495.

[19]李燕燕，李雄英.低分子肝素對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者凝血功能、血栓彈力圖的影響[J].中國性科學(xué)，2023，32（1）：52-55.

[20]蔡丹，黃向紅，張遠(yuǎn)芳，等.血栓彈力圖與常規(guī)凝血檢測評估早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者凝血功能及指導(dǎo)抗凝治療的預(yù)后比較[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2023，32（1）：55-60.

（收稿日期：2024-04-24） （本文編輯：陳韻）