張春艷 郭明飛 烏仁高娃 吳麗娟 烏吉木 胥向紅 劉萬全

摘要：目的? 研究蹄葉橐吾醇化乙酸乙酯萃取物（EEOLF）對金黃色葡萄球菌的抗菌消炎作用。方法? 測定EEOLF對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）；取正常培養(yǎng)的巨噬細胞RAW264.7為空白組，采用金黃色葡萄球菌作用于RAW264.7細胞建立體外實驗模型（模型組）。細胞活/死染色觀察EEOLF（劑量為5 μg/ml）作用于模型組后細胞的損傷情況，ELISA法測定EEOLF（劑量為1.25、2.5 及5 μg/ml）作用于模型組后IL-1β及TNF-α的釋放量。結果? EEOLF對金黃色葡萄球菌生長有抑制作用，最小抑菌濃度為1300 μg/ml；當金黃色葡萄球菌作用于RAW264.7細胞后，細胞發(fā)生嚴重損傷，同時IL-1β及TNF-α的分泌量增加（P<0.05）。對金黃色葡萄球菌感染的細胞給藥后，藥物濃度為1.25 μg/ml和2.5 μg/ml時，炎癥因子的分泌量沒有明顯減少（P>0.05），當藥物濃度為5 μg/ml時，炎性因子L-1β及TNF-α的分泌量下降（P<0.05），同時細胞損傷情況改善。結論? EEOLF能夠抑制金黃色葡萄球菌生長，也能緩解金黃色葡萄球菌引起的炎癥反應，其抗菌消炎作用值得深入研究。

關鍵詞：蹄葉橐吾醇化乙酸乙酯萃取物；金黃色葡萄球菌；抗菌消炎

中圖分類號：R259? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.12.019

文章編號：1006-1959（2024）12-0089-05

Study on the Antibacterial and Anti-inflammatory Effects of Ligulariafischeri Extract

on Staphylococcus Aureus

Abstract：Objective? To study the antibacterial and anti-inflammatory effects of ethanolic extract of ligulariafischeri （EEOLF） on Staphylococcus aureus.Methods? The minimum inhibitory concentration （MIC） of EEOLF against Staphylococcus aureus was determined. Normal cultured macrophages RAW264.7 were taken as blank group， and Staphylococcus aureus was applied to RAW264.7 cells to establish cell inflammation model group in vitro （model group）. The cell damage after EEOLF （5 μg/ml）? in the model group was detected by living/dead staining， and the release of IL-1β and TNF-αafter EEOLF （1.25， 2.5 and 5 μg/ml） in the model group was determined by ELISA.Results? EEOLF could inhibit the growth of Staphylococcus aureus， and the MIC was 1300 μg/ml. When Staphylococcus aureus acted on RAW264.7 cells， the cells were severely damaged， and the secretion of IL-1β and TNF-α was increased （P<0.05）. When the drug concentration was 1.25 μg/ml and 2.5 μg/ml， the secretion of inflammatory factors was not significantly reduced （P>0.05）. When the drug concentration was 5 μg/ml， the secretion of inflammatory factors L-1β and TNF-α was decreased （P<0.05）， and the cell damage was improved.Conclusion? EEOLF can inhibit the growth of Staphylococcus aureus and alleviate the inflammatory response caused by Staphylococcus aureus， and its antibacterial and anti-inflammatory effects are worthy for further study.

Key words：Ligulariafischerialcoholized ethyl acetate extract;Staphylococcus aureus;Antibacterial and anti-inflammatory

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起皮膚和軟組織感染的主要病原體之一[1]，若感染控制不佳可能造成大面積感染或菌血癥等不良后果?？股厥侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的首選藥物。但是隨著抗生素的應用，金黃色葡萄球菌的耐藥性逐漸增強，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus， MRSA）出現(xiàn)并在全球范圍內散播[2]，是導致乳腺炎以及醫(yī)院和社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病率、死亡率居高不下的主要原因，嚴重危害著社會公共衛(wèi)生[3]。目前，MRSA感染引起的相關疾病尚無最佳治療方案。如何治療耐藥性逐漸增高的金黃色葡萄球菌引起的感染是目前研究的熱點之一。中藥對細菌感染的治療作用被認為類似于抗生素的作用[4-6]，從中草藥中尋找新型藥物用來抵抗或治療耐藥菌株引起的感染已成為解決細菌耐藥性的有效途徑。蹄葉橐吾（Ligulariafischeri， LF）為菊科（compasitae）蹄葉橐吾屬（Ligularia）多年生草本植物，多生長于海拔1400～3300米的河流、山川及森林[7]。LF的根、莖、葉及全草均有很強的藥用價值。其根和根莖可用于于治療慢性支氣管炎、咽喉炎癥、肺癰咳血等，已收入吉林省藥材標準，全草用于治療丹毒性炎癥和關節(jié)膿腫，地上部分外敷用于捻挫傷，水煎服可治療痔疾[8]。LF葉片提取物在抗炎，抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價值[9-11]。根據(jù)中國《中藥材記錄》記載，LF除了上述作用外還有抗菌作用[12]，但關于LF抗菌作用的研究較少，EEOLF是否對細菌生長有抑制作用還有待于進一步確認。因此，本研究初步探究EEOLF對金黃色葡萄球菌的生長的作用，并建立金黃色葡萄球菌感染的小鼠巨噬細胞RAW264.7模型，探討EEOLF對金黃色葡萄球菌感染的功效，為解決金黃色葡萄球菌的臨床耐藥性問題提供新思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑? 細胞小鼠巨噬細胞RAW264.7購于北京協(xié)和醫(yī)學院。菌種金黃色葡萄球菌（ATCC29213）為華中農業(yè)大學周銳教授饋贈。藥品LF為齊齊哈爾醫(yī)學院李濤教授在延邊市安圖縣采摘并饋贈。試劑包括：FBS胎牛血清（美國Hyclone公司），乙二胺四乙酸（EDTA，美國Sigma公司），四甲基二乙胺（TEMED，美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基干粉（美國Gibco公司），L-1β及TNF-α ELISA試劑盒（博士德生物科技有限公司），活死染色試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2儀器? DY5000X倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司），BIO-RAD 680全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司），超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），VS-1300L-U凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3方法

1.3.1 EEOLF制備? 干燥的LF葉片8.5 kg，粉碎后，室溫下，每次用無水乙醇15 L浸泡3 d后過濾，重復3次，合并醇提液，減壓濃縮至小體積（約1.0 L），加水1.5 L，用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯1.5 L，合并乙酸乙酯層濃縮至恒重，得率為0.61%，減壓濃縮，真空干燥，每克相當于10 g生藥。使用時DMSO溶解后用PBS稀釋，濾過除菌，并分裝儲存。

1.3.2抗菌藥物最低抑菌濃度試驗（MIC）? 將EEOLF制成10400 μg/ml的原液，增菌后的對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌液用生理鹽水或LB肉湯培養(yǎng)基校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1×108～2×108 CFU/ml。取無菌試管6支，排成一排，除第1管加入1.6 ml LB肉湯外，其余每管加入LB肉湯1 ml，依次倍比稀釋，第6管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為5200、2600、1300、650、325、0? μg/ml。然后在每管內加入上述制備好的接種物各1 ml，使每管最終菌液濃度約為5×105 CFU/ml。將接種好的稀釋管塞好塞子，置37 ℃搖床培養(yǎng)16～20 h后用分光光度計測定OD600。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及分組處理? 取RAW264.7巨噬細胞在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)2 d、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，經(jīng)1×PBS清洗2次，每次3 ml，用刮刀刮取細胞，并用細胞培養(yǎng)液吹打混勻，于細胞計數(shù)板上計數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104個/ml，接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待巨噬細胞處于對數(shù)生長期且形成致密融合單層后分組處理。先前研究采用噻唑藍比色法（MTT法）測得EEOLF作用于密度為5×104個/ml的RAW264.7細胞24 h后，藥物對細胞的無毒濃度為5 μg/ml，故本實驗采用的最大藥物濃度為5 μg/ml?？瞻讓φ战M，加入不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；模型組，先加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)7 h（感染復數(shù)MOI為4），建立感染模型；EEOLF處理組，向模型組加入EEOLF（終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)5 h。

1.3.4活/死染色試驗? 取空白對照組、模型組及EEOLF處理組（終濃度為5 μg/ml），根據(jù)試劑盒說明書對細胞進行活/死（綠/紅）染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞活力，綠色表示活細胞，紅色表示死細胞[1]。

1.3.5細胞因子檢測? 取空白對照組、模型組、EEOLF處理組（終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml），用ELISA試劑盒檢測上清TNF-α和IL-1β分泌情況。將8、400、200、100、50、25、12.5 pg/ml的標準品各100 μl依次加入孔中，另取1孔只加細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，每個濃度設置3個復孔；酶標板加上封板膜，37 ℃反應90 min；依次加入生物素抗小鼠IL-1β抗體100 μl；酶標板加上封板膜，37 ℃反應60 min；洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1 min左右（每孔洗液至少300 μl）；將準備好的ABC工作液按每孔100 μl依次加入；酶標板加上封板膜，37 ℃反應30 min；洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1～2 min左右（每孔洗液至少300 μl）。分別加入顯色劑A和B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；加終止液，在酶標儀450 nm處測量各孔的吸光度A。

1.4統(tǒng)計學方法? 通過 GraphPad Prism 5.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 EEOLF對金黃色葡萄球菌的抑制作用? 在金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)基中加入不同濃度的EEOLF后培養(yǎng)，置37 ℃搖床培養(yǎng)16～20 h后用分光光度計測定OD600，發(fā)現(xiàn)在藥物濃度為1300 μg/ml時OD600值降低，說明EEOLF對金黃色葡萄球菌的生長有抑制作用，且最小抑菌濃度為1300 μg/ml，見表1。

2.2 EEOLF減輕金黃色葡萄球菌感染造成的RAW264.7細胞損傷? 對細胞進行活/死染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細胞損傷較少，見圖1A～圖1C；金黃色葡萄球菌刺激后（模型組）細胞損傷較為嚴重，見圖1D～圖1F；加入終濃度為5 g/ml的EEOLF后，細胞損傷減輕，說明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌感染造成的細胞損傷，見圖1G～圖1I。

2.3 EEOLF降低金黃色葡萄球菌感染導致的炎癥反應? 與空白對照組相比，模型組TNF-α和IL-1β的分泌量升高（P<0.05）。加入終濃度分別為1.25、2.5、5 μg/ml的EEOLF分別作用于模型組的RAW264.7細胞后，發(fā)現(xiàn)5 μg/ml組TNF-α和IL-1β的分泌量減少（P<0.05），表明EEOLF能降低炎癥細胞中TNF-α和IL-1β的釋放，見圖2。

3討論

抗生素耐藥性問題對于全球公共衛(wèi)生來說是一項巨大的威脅和挑戰(zhàn)，特別是MRSA的出現(xiàn)給社會造成了重大的經(jīng)濟損失[13]。金黃色葡萄球菌肺炎是一種流行的社區(qū)和醫(yī)院獲得性傳染病，發(fā)病率和死亡率都很高[14]。因此，現(xiàn)亟需替代療法來對抗耐藥細菌的感染。

中藥可通過破壞細菌結構、抑制細菌的群體感應系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)或毒力因子降低細菌致病性；在與抗生素聯(lián)用下，中藥通過改變細胞膜結構、減弱外排泵外排作用等增強抗生素功效；此外，中藥通過消除炎癥反應提高機體免疫功能而抗細胞感染[15，16]。所以，從中草藥中挖掘新型抗菌消炎藥物已成為解決當今細菌的耐藥性問題有效途徑。

LF為我國傳統(tǒng)中藥，主要分布在我國東北長白山、內蒙古等地，因其藥理作用廣泛、廉價易采摘等優(yōu)勢而具有很大的開發(fā)價值[9]。研究發(fā)現(xiàn)LF地上部分乙醇提取物可通過JNK、p38MAPK通路和NF-κB等通路達到抗炎的作用[17-20]。除此以外，LF對機體免疫系統(tǒng)也有一定的調節(jié)作用，如通過抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，增加小鼠血清溶血素含量，促進脾淋巴細胞增殖從而增強體液免疫功能[21]。

根據(jù)我國《中藥材》專著描述LF還具有抗菌作用[12]，但是目前關于LF在這方面的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)EEOLF對金黃色葡萄球的生長有抑制作用，MIC為1300 μg/ml，說明LF地上部分具有抑菌作用，具體作用機制還有待于進一步研究。

巨噬細胞是炎癥反應的重要參與者，介導了炎癥過程中各種免疫病理的發(fā)展，金黃色葡萄球菌感染巨噬細胞后，會導致細胞損傷并釋放各種炎性因子[22]。TNF-α位于炎癥瀑布的上游，可誘導巨噬細胞產(chǎn)生并聚集多種炎性因子和氧自由基，促進T細胞浸潤，參與局部炎癥反應，TNF-α釋放量的多少直接反應炎癥的輕重[23]。IL-1一般產(chǎn)生于炎癥早期，具有介導炎癥產(chǎn)生的作用[9]。本研究通過活/死染色實驗發(fā)現(xiàn)EEOLF濃度為5 μg/ml時，細胞損傷情況有所好轉，說明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌引起的小鼠巨噬細胞損傷。通過ELISA檢測濃度為1.25、2.5、5μg/ml的EEOLF作用于金黃色葡萄球菌感染的細胞時，TNF-α和IL-1的釋放量，發(fā)現(xiàn)5 μg/ml的藥物能夠抑制TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，說明EEOLF能夠減輕金黃色葡萄球菌引起的小鼠巨噬細胞炎癥反應。。

先前研究已測得EEOLF作用于密度為5×104個/ml的RAW264.7細胞24 h后，藥物對細胞的無毒濃度為5 μg/ml[17]，因而本研究選擇的最大藥物濃度為5 μg/ml，在此劑量下，EEOLF不具備抑菌作用，主要發(fā)揮抗炎作用，如何使EEOLF更好的發(fā)揮抑菌消炎雙重作用還有待于進一步研究。

綜上所述，EEOLF不但可以通過抑制炎性因子的釋放減輕金黃色葡萄球菌引起的感染，而且對細菌的生長有抑制作用。

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