徐健 李雪萍

【摘?? 要】?? 從珍稀瀕危植物掌葉木中克隆了一個V-ATP酶C亞基（HbVATP_C）基因，對其生物信息學特征進行了分析，利用熒光定量技術檢測了該基因在不同組織和干旱及鹽脅迫下的表達模式。結果顯示，該基因開放閱讀框全長1128 bp，編碼 375個氨基酸，蛋白分子量是42.57 kD，等電點為5.44，為親水性蛋白。HbVATP_C具有典型的V-ATP_C結構域，與其他植物同源性較高。HbVATP_C在掌葉木根、莖和葉等不同組織中均有表達，在幼葉中表達水平顯著高于其他部位。干旱脅迫下，該基因表達水平均高于對照，鹽脅迫下變化不明顯，說明該基因能響應干旱脅迫。為進一步研究該基因在掌葉木中的功能奠定了基礎。

【關鍵詞】?? 掌葉木；V-ATP酶C亞基；基因克??；表達模式

Cloning and Expression Analysis of a V-ATPase_C Subunit Gene

from Handeliodendron Bodinieri

Xu Jian， Li Xueping*

（Henan University of Science & Technology， Luoyang 471023， China）

【Abstract】??? This study cloned a V-ATPase C subunit gene （HbVATP_C） from the rare and endangered plant Handeliodendron bodinieri， analyzed its bioinformatic characteristics， and used qPCR technology to detect the expression pattern of HbVATP_C in different tissues and under drought and salt stress. The results showed that the open reading frame of HbVATP_C is 1128 bp in length， encoding 375 amino acids. The protein has a molecular weight of 42.57 kD， with an isoelectric point of 5.44， and is a hydrophobic protein. HbVATP_C has a typical V-ATP_C domain structure and shows high homology with other plant homologs. HbVATP_C is expressed in various tissues such as roots， stems， and leaves of H. bodinieri. The expression level is significantly higher in young leaves compared to other tissues. The expression level of this gene is higher than that in the control of drought and salt stress， indicating that the gene can respond to environmental stresses. This study lays a foundation for further research on the function of? HbVATP_C in H. bodinieri.

【Key words】???? Handeliodendron bodinieri; V-ATPase-HbVATP_C? subunit; gene cloning; expression Pattern

〔中圖分類號〕 Q943????????????? ???? ????? ???〔文獻標識碼〕? A????? ???????????? 〔文章編號〕 1674 - 3229（2024）02- 0066 - 06

[收稿日期]?? 2024-03-25

[基金項目]?? 國家自然科學基金（31600530）

[作者簡介]?? 徐?。?990- ），男，碩士，河南科技大學園藝與植物保護學院助理實驗師，研究方向：植物生物學。

[通訊作者]?? 李雪萍（1980- ），女，博士，河南科技大學園藝與植物保護學院副教授，研究方向：園林植物發(fā)育生物學、園林植物種質資源收集與瀕危植物保護。

0???? 引言

Handeliodendron bodinieri?（Lévl.） Rehd.是Sapindaceae科、Handeliodendron屬的單種，為中國特有的珍稀瀕危物種，被列為國家一類保護植物，主要分布在中國西南部廣西和貴州交界海拔500～900米的喀斯特林區(qū)［1］。掌葉木為落葉闊葉喬木，樹形優(yōu)美、材性優(yōu)良，是建筑和家具制造的好材料；葉片含有木脂素和類黃酮苷，具有藥用價值［2］；花果顏色鮮艷可作觀賞；種子脂肪含量高，有極高的營養(yǎng)價值與很好的低溫流動性，兼具食用價值和工業(yè)價值，有望開發(fā)為高端食品和生物質柴油［3-4］。囊泡型H+ATPase（V-ATPase）主要存在于真核生物液泡膜系統(tǒng)中，是一個由ATP驅動的質子泵，它利用ATP水解的能量轉化為電化學勢能，介導氫離子的跨膜轉運［5］，使液泡酸化并執(zhí)行重要的細胞功能。V-ATP酶是具有活性的多聚體復合酶，C亞基是其中一個重要的單元［6］，主要參與調控V-ATPase活性和微絲骨架的結合［7-8］，因此被廣泛關注。

干旱和鹽脅迫是植物生長發(fā)育過程中嚴重的非生物脅迫因子，V-ATPase是維持細胞內膜不同區(qū)塊pH差異以保證細胞正常完成生化功能重要因子［9］，研究其在逆境脅迫下的調控特性具有一定理論價值。本研究從掌葉木中克隆了一個液泡膜ATPase亞基基因HbVATP_C，對其進行了生物信息學分析和進化分析，并利用實時熒光定量技術檢測了該基因在干旱和鹽脅迫情況下的表達情況，為后續(xù)深入研究該基因功能提供前期基礎。

1???? 材料和方法

1.1?? 植物材料

本研究所用掌葉木種子由河南科技大學園林實驗中心提供，種子處理方法參照前人研究［10］。種子萌發(fā)一周后，將幼苗移栽到草炭土中培養(yǎng)6周，期間用霍格蘭營養(yǎng)液澆灌。6周后取幼苗的根（主根和側根）、葉（幼嫩葉、成熟葉和葉柄）、莖（韌皮部和木質部）等不同部位，用于分析目的基因在不同組織表達情況。分別選取長勢一致的6周齡幼苗用20% PEG6000和200 mM NaCl澆灌進行干旱和鹽脅迫處理，并分別于0 h、12 h、24 h、48 h和72 h收集葉片材料，每個時間點取3個生物學重復。所有材料取材后液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?? RNA提取、反轉錄與基因擴增

將收集的植物材料研磨成粉末后分別稱取100 mg，利用植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司）提取總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，然后利用cDNA反轉錄試劑盒（Takara）合成cDNA第一鏈。

基于前期研究的掌葉木轉錄組數據（未發(fā)表）篩選V-ATP酶C亞基候選基因，獲取其cDNA基因全長序列。利用Primer Premier 5.0軟件設計目的基因CDS（編碼序列）全長克隆引物（HbVATP_C-f： 5-ATGGCATCTAGATACTGGGC-3和HbVATP_C-r：5

-TCAAACAAGATTGATTGTGAAG-3）。以未處理材料的根、莖和葉混合樣本cDNA 為模板，采用PrimeSTAR HS高保真聚合酶（Takara，R010Q）進行擴增。擴增體系25 μL，包含1 μL cDNA模板，12.5 μL PrimeSTAR HS，各0.5 μL正反向引物，10.5 μL ddH2O。PCR反應條件：98 ℃ 預變性 1 min；98 ℃ 變性10 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，對符合預期大小的片段進行切膠純化回收，連接至pTOP克隆載體，轉化后挑取克隆搖菌，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序得到的序列與模板序列進行比對，分析其相似性。

1.3?? 生物信息學分析

利用Expasy server （https：//www.expasy.org/）的ProtParam和 ProScale工具分析蛋白的分子量（Molecular weight）、等電點（Theoretical pI）、親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）、不穩(wěn)定指數（Instability index）等。利用 SMART（http：//smart.embl-Heidelberg.de） 在線網站預測該蛋白的功能結構域。利用SOPMA工具［11］進行蛋白質二級結構預測，SWISS models（https：//swissmodel. expasy. org/）進行蛋白質三級結構預測［12］。

1.4?? 同源性分析

利用植物基因組網站Phytozome（V13）（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）BLASTP工具（登陸日期：2024年2月25日），基于目標基因蛋白序列在苔蘚（Physcomitrium patens）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米（Zea mays）等不同進化地位的物種基因組中進行同源序列檢索并下載相應序列，使用 MEGA6軟件［13］進行序列相似性比對，并使用鄰接法（neighbor-joining）構建系統(tǒng)樹，分析掌葉木V-ATP酶C亞基基因的系統(tǒng)進化地位。

1.5?? 表達分析

根據測序結果，設計HbVATP_C基因的熒光定量引物（RT-HbVATP_C-f： 5-AGCTAAACAGAGGGG

AAA-3， RT-HbVATP_C-r： 5-GAAGACACCGCCCA

GTATC-3），以Actin為內參基因（RT-Actin-f： 5

-CGATGAATCTGGGCCAGCTAT-3，RT-Actin-r： 5

-TAAACCGGAGCTGACCAAACT-3）。以脅迫后12 h、24 h、 48 h、72 h掌葉木葉片材料cDNA為模板，0 h材料為對照，利用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq熒光定量試劑盒（北京聚合美，MF787）進行表達量檢測。每個樣品3次生物學重復。反應體系和程序參照說明書進行，根據2-ΔΔCt法計算掌葉木HbVATP_C基因在干旱脅迫后的相對表達變化。

2???? 結果與分析

2.1?? HbVATP_C基因克隆

以掌葉木未處理葉片樣品的cDNA為模板，利用基因全長克隆引物進行 PCR擴增，電泳分析結果顯示擴增條帶約為 1100 bp（圖1），測序結果顯示該基因全長1128 bp，編碼 375個氨基酸，將其命名為HbVATP_C。

2.2?? HbVATP_C生物信息學分析

使用ExPASy在線工具對HbVATP_C蛋白進行理化性質分析，結果顯示，HbVATP_C蛋白的分子量是42.57 kD，等電點為5.44，為酸性蛋白。不穩(wěn)定指數（instability index）是51.17（＞40），屬于不穩(wěn)定蛋白。親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.307，說明該蛋白為親水性蛋白（圖2-A）。信號肽主要由疏水性氨基酸組成，運用SignalP4.1 server進行HbVATP_C信號肽分析，發(fā)現該序列不存在信號肽，TMHMM Serverv 2.0預測結果表明HbVATP_C無跨膜區(qū)（圖未顯示）。蛋白二級結構預測分析顯示（圖2-C），HbVATP_C蛋白二級結構中，α螺旋（Alpha helix）區(qū)域占比最高，為全部氨基酸的58.67%（220個）；48個氨基酸參與形成延伸鏈（Extended strand），占比的12.8%；β轉角（β turn）占4.27%；不規(guī)則卷曲（Random coil）共計91個，占比24.27%?；谕唇５腟WISS model預測顯示（圖2-B）HbVATP_C蛋白質三級結構與模板（V-type proton ATPase subunit C，SMTL ID： 7uw9.1.2）之間的序列同源性為 88.27%，且以α螺旋和不規(guī)則卷曲為主要結構。利用NCBI網站保守結構域分析工具（Conserved Domain Search）分析HbVATP_C蛋白的保守結構域，結果顯示，該蛋白具有V-ATP_C保守結構域（圖2-D），表明該蛋白屬于V-ATP類蛋白家族成員。

2.3?? HbVATP_C序列相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取苔蘚植物、單子葉植物和雙子葉植物等不同進化水平的12種代表性物種，利用同源檢索方法下載選定物種中的同源基因的氨基酸序列并進行多重序列比對，結果如圖3所示。掌葉木HbVATP_C蛋白與其他物種VATP-C具有較高的一致性，整體相似度為85.52%，說明這些蛋白在進化上非常保守，暗示它們在植物進化過程中發(fā)揮重要的作用。其中，與桃（Prunus persica）Prupe.3G312200.1.p、棉花（Gossypium hirsutum）Gohir.D11G067700.1.p、楊樹Populus trichocarpa）Potri.017G061100.1和葡萄（Vitis vinifera）VIT_214s0068g01280.2的相似度分別為87.77%、87.2%、86.97%、86.13%，說明它們可能執(zhí)行相似的功能。利用MEGA6.0軟件將上述同源蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建和遺傳距離分析，結果如圖4所示。13個參試物種VATP-C基因編碼蛋白經聚類可分為兩大分支，小立碗蘚（Physcomitrium patens）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）被分為一類，掌葉木和其他物種被聚在另外一個分支，說明它們親緣關系較近，與苔蘚植物和單子葉植物水稻、玉米等同源性較遠。

2.4?? HbVATP_C基因表達模式分析

利用熒光定量PCR分析HbVATP_C基因在掌葉木幼苗根（主根和側根）、葉（幼嫩葉、成熟葉和葉柄）、莖（韌皮部和木質部）等部位的相對表達量，結果表明，HbVATP_C在各部位均有表達，但在葉片中表達量明顯高于其他部位，幼嫩葉片中表達量最高（圖5）。為了探究HbVATP_C基因對干旱和鹽脅迫的響應，對掌葉木在干旱、鹽脅迫條件下的表達響應模式進行分析。結果如圖6-A所示，干旱處理后，HbVATP_C表達量顯著提高，在12小時時表達量上調到2.6倍，48小時后達到最高值4.7倍。在鹽脅迫條件下，HbVATP_C表達量變化趨勢不明顯，在12小時達到對照組的1.6倍（圖6-B）。

3???? 結論與討論

V-ATP酶分布廣泛且結構復雜，首次被發(fā)現是在酵母液泡膜上，是一種運輸質子的ATP酶，對細胞的生理功能有重要作用，參與細胞的生長、細胞內酸化調節(jié)和物質的轉運［14-15］以及多種信號傳導的過程［16］。目前，編碼V型 ATP酶復合體的12個基因均已被識別［17］，其中C亞基主要參與調控V型ATP酶活性和微絲骨架的結合，一直是關注熱點。

本研究基于轉錄組數據，利用PCR技術擴增獲得掌葉木HbVATP_C基因，編碼375個氨基酸，蛋白的分子量是42.57 kD，等電點為5.44。HbVATP-C無信號肽，為親水性蛋白。該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，二級結構原件包括α螺旋（58.67%）、延伸鏈（12.8%）和β轉角（4.27%），不規(guī)則卷曲（24.27%），α螺旋和不規(guī)則卷曲是二級結構的主要元件。該蛋白在植物中具有較高的保守性，序列比對顯示該蛋白與桃、棉花、楊樹和葡萄同源蛋白的相似度非常高，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示它們具有較近的親緣關系。

為對HbVATP_C的表達情況進行確定分析，利用熒光定量技術進行檢測。結果顯示，該基因在掌葉木的主根、側根、韌皮部、木質部、葉、葉柄等不同部位均有表達，但在嫩葉中表達量最高，說明該基因具有時空表達差異性。V-ATP_C對逆境脅迫響應靈敏，在脅迫發(fā)生后，其轉錄水平迅速提高［18］，說明V-ATP酶C亞基可能在逆境脅迫中起重要作用。研究發(fā)現，在干旱脅迫后的12小時，HbVATP_C表達水平即提升為對照組的2倍以上，并在48小時內保持高水平表達；在鹽脅迫下，HbVATP_C表達水平也有適當上調，12小時后，轉錄水平提高到對照組的1.6倍。這些結果初步說明，HbVATP_C基因可能參與掌葉木應答干旱和鹽脅迫，但其參與的途徑和方式有待進一步研究。

［參考文獻］

［1］ 熊志斌， 冉景丞， 譚成江，等. 瀕危植物掌葉木種子生態(tài)特征［J］. 生態(tài)學報，2003，23（4）：820-825.

［2］ 張娜， 郭志勇， 李在留， 等. 掌葉木葉化學成分研究［J］. 三峽大學學報（自然科學版）， 2015，37（3）：96-99.

［3］ 郭松， 李在留， 薛建輝， 等. 掌葉木不同種源種子的經濟性狀［J］. 林業(yè)科學， 2019，55（4）：84-96.

［4］ 曹麗敏. 珍稀特有植物掌葉木的研究進展［J］. 安徽農業(yè)科學， 2009，37（3）：1043-1045.

［5］?? Beyenbach K W， Wieczorek H. The V-type H+ ATPase： molecular structure and function， physiological roles and regulation［J］. Journal of Experimental Biology， 2006，209（4）：577-589.

［6］ Cipriano D J， Wang Y， Bond S， et al. Structure and regulation of the vacuolar ATPases［J］. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Bioenergetics， 2008，1777（7-8）：599-604.

［7］? Vitavska O， Wieczorek H， Merzendorfer H. A novel role for subunit C in mediating binding of the H+-V-ATPase to the actin cytoskeleton［J］. Journal of Biological Chemistry， 2003，278（20）：18499-18505.

［8］? Drory O， Frolow F， Nelson N. Crystal structure of yeast V-ATPase subunit C reveals its stator function［J］. EMBO reports， 2004，5（12）：1148-1152.

［9］? Hong-Hermesdorf A， Brüx A， Grüber A， et al. A WNK kinase binds and phosphorylates V-ATPase subunit C［J］. FEBS letters， 2006，580（3）：932-939.

［10］ 李櫻花， 郭松， 李在留， 等. 掌葉木種皮障礙及種子各部位內源抑制活性的研究.［J］. Guihaia， 2016，36（4）： 443-448+470.

［11］ Geourjon C， Deleage G. SOPMA： significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments［J］. Bioinformatics， 1995，11（6）：681-684.

［12］? Blom N， Gammeltoft S， Brunak S. Sequence and structure-

based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites［J］. Journal of molecular biology， 1999，294（5）：1351-1362.

［13］Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0［J］. Molecular biology and evolution， 2013，30（12）：2725-2729.

［14］Parra K， Chan C. Yeast phosphofructokinase-1 subunit Pfk2p? is? necessary? for ph homeostasis?? and? glucose-

dependent V-ATPase reassembly： The role of glycolysis［J］. BBA-Bioenergetics， 2014（1837）：e113.

［15］ Schumacher K， Krebs M. The V-ATPase： small cargo， large effects［J］. Current opinion in plant biology， 2010，13（6）：724-730.

［16］ Parra K J， Chan C， Chen J. Saccharomyces cerevisiae vacuolar [H+] -ATPase regulation by disassembly and reassembly： one structure and multiple signals［J］. Eukaryotic cell， 2014，13（6）：706-714.

［17］ Seidel T， Kluge C， Hanitzsch M， et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar [H+]-ATPase in living plant cells［J］. Journal of biotechnology， 2004，112（1-2）：165-175.