陳冬梅等

摘要：從巴什拜羊外周血多形核粒細胞（PMN）中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增出巴什拜羊BPI基因片段，將其克隆至pPIC9K載體中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pPIC9K-BPI，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中并用甲醇誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE鑒定重組BPI蛋白的表達，通過微量肉湯稀釋法檢測重組BPI蛋白的抑菌活性。結(jié)果表明：RT-PCR擴增獲得597 bp巴什拜羊BPI基因；經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定證實成功構(gòu)建BPI基因的真核表達載體，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，重組BPI蛋白成功表達，通過抑菌試驗表明表達的重組BPI蛋白具有明顯抑菌活性。

關(guān)鍵詞：巴什拜羊；殺菌性；通透性增加蛋白；畢赤酵母；基因克??；真核表達

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0039-04

收稿日期：2014-09-16

我國是養(yǎng)羊大國，新疆維吾爾自治區(qū)是我國主要的綿羊生產(chǎn)基地，巴什拜羊是新疆乃至國內(nèi)外不可多見的綿羊地方優(yōu)良品種，具有特殊的生物學(xué)特性[1]，原產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)裕民縣。該羊具有生長發(fā)育速度快、生產(chǎn)性能高、抗病力強等特征，其羔羊成活率達95%以上，是發(fā)展我國重要的羊品種資源[2]。殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）主要存在于人、哺乳動物的多形核粒細胞（PMN）嗜天青顆粒中，是PMN的主要抗菌成分[3-5]，具有殺菌、中和內(nèi)毒素以及促進補體活化增強調(diào)理功能的作用。Vander等發(fā)現(xiàn)，BPI蛋白可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的凋亡，抑制血管生成，在體外血管生成試驗中，在1.8 μmol/L濃度下作用24 h后BPI蛋白能夠抑制81%的血管生成，這一發(fā)現(xiàn)使BPI蛋白有望用于治療癌癥或與血管形成有關(guān)的疾病[6]。BPI蛋白在抗真菌感染[7]、抗弓形蟲感染[8]等領(lǐng)域也有非常重要的意義。2005年，美國食品藥品管理局批準rBPI21/rBPI23進行Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗，該臨床試驗主要研究兒童急性腦膜炎菌血癥、出血、腹腔感染、肝切除以及膽囊纖維化導(dǎo)致的嚴重感染，還有其他革蘭氏陰性菌、內(nèi)毒素進入血液循環(huán)而造成的致病、致死等癥狀 [9]。Levy證實了rBPI21不僅可以降低病死率，顯著降低血液IL-6的水平，還可以減少感染性并發(fā)癥和成人呼吸窘迫綜合征的發(fā)生率[10]。周紅等從豬PMN 中提取了豬源BPI 蛋白，發(fā)現(xiàn)豬源性BPI 蛋白具有中和內(nèi)毒素、殺滅革蘭氏陰性菌的作用[11] 。朱璟研究BPI基因?qū)ωi抗F18大腸桿菌感染的功能及機理[12]。2004年，Alexander等用腺病毒介導(dǎo)的BPI轉(zhuǎn)基因小鼠模型進行體內(nèi)外試驗，均顯示腺病毒為載體的重組BPI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化可以進行細胞外分泌，且分泌的BPI蛋白可以中和脂多糖LPS，并且減少致炎細胞因子TNF-α和巨噬細胞炎癥蛋白-2（MIP-2）的產(chǎn)生[13]。但有關(guān)羊BPI基因的功能還未見報道。本試驗從巴什拜羊外周血中提取多形核粒細胞PMN總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得BPI目的基因片段，構(gòu)建巴什拜羊BPI真核表達載體，并對其表達產(chǎn)物進行生物活性檢測，旨在為進一步深入研究巴什拜羊重組BPI蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗動物、菌株與載體

本試驗所用的5只巴什拜羊由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院試驗站提供。巴斯德畢赤酵母GS115菌株及表達載體pPIC9K為新疆農(nóng)墾科學(xué)院獸醫(yī)研究所薄新文研究員饋贈，DH5ɑ菌株由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院生化實驗室保存。抑菌試驗所用的大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、沙門氏菌（Salmonella spp.）ATCC14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）ATCC25923均為石河子大學(xué)動物科技學(xué)院中獸醫(yī)實驗室饋贈。

1.2主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自天根生化科技有限公司；蛋白marker購自Fermentas公司；酵母基因組DNA快速提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker DL 2501、DNA Marker DL 2503購自上海捷瑞生物工程有限公司；D-山梨醇、酵母氮堿（YNB）、G418、生物素均購自北京索萊寶科技有限公司；普通肉湯培養(yǎng)基中的蛋白胨、酵母提取物購自上海坤肯生物化工有限公司；中性粒細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.3目的片段的擴增及重組表達質(zhì)粒pPIC9K-BPI的構(gòu)建

巴什拜羊BPI基因cDNA全長序列由筆者所在實驗室通過cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）獲得，登錄號為KF523344。根據(jù)該基因的ORF設(shè)計活性段表達引物，上游引物為5′-TACGTA ATGACCAACCCAGGCATCGTG-3′，下游引物為5′-GCGGCCGCTCATAGTTTGGTTGTCACTGGCAG-3′。通過頸靜脈采集巴什拜羊血液，用肝素抗凝，按照中性粒細胞分離液說明書方法分離外周血中性粒細胞。用Trizol法抽提巴什拜羊中性粒細胞總RNA。提取的總RNA用無菌DEPC水溶解，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以提取的PMN總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。用 NotⅠ、SnaBⅠ分別對巴什拜羊BPI基因及pPIC9K表達載體進行雙酶切，用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過夜，將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于100 μL感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含有 100 mg/L 氨芐青霉素的LB瓊脂板上，于37 ℃恒溫箱中靜止過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落，接種于5 mL含有 100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。取2～3 mL菌液，提取質(zhì)粒，進行雙酶切、PCR鑒定，同時將 1 mL 菌液和5 μL質(zhì)粒送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-BPI。

1.4重組表達質(zhì)粒pPIC9K-BPI的轉(zhuǎn)化與鑒定

按Riffault等的方法[14]制備感受態(tài)酵母菌GS115，取80 μL 感受態(tài)GS115與20 μL線性化的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-BPI混合，電擊轉(zhuǎn)化后涂布于MD平板上，28 ℃孵育3 d，每天觀察菌落的生長情況。挑取單菌落，用酵母基因組DNA快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以其為模板，分別用表達引物和用酵母載體上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′、3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）進行基因型、表型鑒定。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)擴增片段的大小判斷酵母染色體中是否有目的基因片段插入。基因型鑒定中PCR的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。若能夠擴增出1條目的條帶，再進行表型鑒定，表型鑒定的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃ 保存。在表型鑒定中，若能擴增出2條帶，一條是含有目的基因片段的擴增條帶，另一條是野生型AOX1基因的擴增帶，約為 2.2 kb，則為陽性轉(zhuǎn)化子即Mut+（甲醇利用野生型）表型特征。

1.5重組菌株GS115/pPIC9K-BPI的表達與SDS-PAGE分析

將PCR鑒定正確的重組酵母菌GS115/pPIC9K-BPI接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)至D值為4時，6 000 r/min離心3 min，收集菌體。將富集的菌體轉(zhuǎn)接于250 mL BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h加入終濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達。同時按0、24、48、72、96、108 h分別取1 mL菌液樣品，離心收集上清、菌體，并將上清、菌體分別進行SDS-PAGE鑒定。

1.6抑菌試驗檢測表達產(chǎn)物的活性

1.6.1不同濃度的重組BPI蛋白對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用在配好的普通肉湯培養(yǎng)基中加入重組BPI蛋白，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL，將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌稀釋至濃度為0.01億CFU/mL，取30 μL接種于含有各種濃度重組蛋白的肉湯培養(yǎng)基中。另外在不含重組BPI蛋白的肉湯培養(yǎng)基中分別加入30 μL大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為陽性對照，不含細菌也不含有重組蛋白的普通肉湯培養(yǎng)基設(shè)為陰性對照。在96孔板中以微量稀釋法測定重組BPI蛋白的抑菌活性，37 ℃培養(yǎng)12 h后使用酶標儀在600 nm波長下進行觀察并記錄其D值[15]。重復(fù)3次，取平均值（下同）。

1.6.23個不同濃度重組BPI蛋白對大腸桿菌的抑制作用在普通肉湯培養(yǎng)基中加入重組BPI蛋白，使其終濃度為20、40、80 μg/mL，將30 μL大腸桿菌加入其中。陰性對照與陽性對照設(shè)置同上。37 ℃下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 h，設(shè)置酶標儀在600 nm波長下，對96孔板進行掃描，測定D值，保存數(shù)據(jù)。

1.7數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 13.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行Two-way ANOVA方差分析，比較重組BPI蛋白的抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1RNA的完整性與純度

從巴什拜羊PMN中提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見明顯的28S、18S、5S條帶（圖1），說明提取總RNA基本沒有降解，具有較好的完整性。對其進行紫外分光光度分析得出D260 nm/D280 nm的值>1.8，表明RNA具有較高的純度，符合反轉(zhuǎn)錄要求。

2.2重組表達質(zhì)粒pPIC9K-BPI的PCR與雙酶切鑒定

重組表達型質(zhì)粒pPIC9K-BPI經(jīng)Not、SnaBⅠ雙酶切和PCR鑒定，均得到了大小為597 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符合（圖2、圖3）。測序結(jié)果正確，表明目的片段已正確插入到真核表達載體中。

2.3重組菌株GS115/pPIC9K-BPI的PCR鑒定

挑取YPD-G418平板上的單個菌落，以重組菌株的

DNA為模板，分別進行基因型、表型鑒定。在基因型鑒定中可見陽性轉(zhuǎn)化子條帶大小為597 bp，與預(yù)期條帶大小相符合（圖4）。在表型鑒定中，用酵母通用引物進行PCR 擴增鑒定，可見陽性轉(zhuǎn)化子能擴增出2條帶，一條是含有目的基因片段的擴增條帶，約597 bp，另一條是野生型AOX1基因的擴增帶，約2.2 kb，為Mut+（甲醇利用野生型）表型PCR鑒定特征（圖5）。

2.4重組菌株GS115/pPIC9K-BPI表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將重組菌株GS115/pPIC9K-BPI經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后，分別收集上清、菌體，上清經(jīng)過SDS-PAGE分析，在約43 ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期目的蛋白分子量相符，在空載質(zhì)粒對照組和0 h表達載體未見有條帶，表明BPI蛋白成功表達（圖6），收集的菌體沒有表達出目的蛋白。

2.5抑菌試驗檢測重組BPI的蛋白活性

表1表明，各試驗組細菌的陽性對照組（肉湯培養(yǎng)基中

分別加入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）D值基本一致，陰性對照組（肉湯培養(yǎng)基）的D值也基本一致。當?shù)鞍诐舛葹?、10 μg/mL時， 大腸桿菌組、沙門氏菌組與金黃色葡萄球菌組的D值差異不顯著。當?shù)鞍诐舛葹?0 μg/mL時，大腸桿菌組、沙門氏菌組的D值顯著低于金黃色葡萄球菌組。當?shù)鞍诐舛葹?0、80 μg/mL時，大腸桿菌、沙門氏菌組的D值極顯著低于金黃色葡萄球菌組。由此可見，重組BPI蛋白的濃度在20 μg/mL以上可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌的生長，對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。

3結(jié)論與討論

本試驗選用pPIC9K表達載體，并在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)進行表達。pPIC9K載體可以快速篩選高拷貝整合轉(zhuǎn)化子，并且具有來自轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素耐藥基因，能夠根據(jù)基因劑量效應(yīng)，對G418的抗性水平快速篩選出高拷貝的轉(zhuǎn)化子，高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子能夠提高外源基因的表達量[16]。本試驗中，筆者充分利用該載體的特性，先進行高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子篩選，然后再進行表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白表達量高達28 mg/mL。巴斯德畢赤酵母作為真核表達系統(tǒng)，具有嚴格調(diào)控外源蛋白的表達、加工修飾表達產(chǎn)物、表達量高、營養(yǎng)要求低等優(yōu)點。此外，巴斯德畢赤酵母中表達產(chǎn)物可分泌至胞外，有利于表達產(chǎn)物的分離純化[17]。本試驗選用pPIC9K表達載體，構(gòu)建pPIC9K-BPI表達質(zhì)粒，并在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)進行表達，結(jié)果表明，用此技術(shù)表達重組蛋白高效、穩(wěn)定、表達產(chǎn)物易于純化。天然BPI蛋白由456個氨基酸殘基組成的堿性蛋白，含N端、C端、中間連接單位3部分組成，經(jīng)蛋白酶水解后可裂解為N端片段、C端片段，N端功能片段具有天然BPI的完整殺菌、中和細菌脂多糖（LPS）等活性[18]。目前有2種BPI蛋白獲取方法，但使用柱層析法獲得的BPI蛋白工作量大，獲取量低，成本高。而Gazzno-Santoro等用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法獲得分子量為23 ku的重組蛋白rBPI23，由于具有較高的活性，且容易獲取，廣泛應(yīng)用于臨床試驗，將人的BPI N-末端的 cDNA 擴增轉(zhuǎn)入細胞載體后通過田倉鼠卵細胞中表達重組蛋白[19]。由于目前國內(nèi)外采用基因工程方法在豬、鼠、兔和牛上都獲得了重組BPI蛋白。在此之前，筆者所在實驗室通過RACE技術(shù)獲得了巴什拜羊BPI基因全長cDNA序列（GenBank登錄號為KF523344），本試驗根據(jù)此序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，克隆出巴什拜羊BPI N-端序列，并在巴斯德畢赤酵母中成功表達出43 ku的含有199個氨基酸的重組BPI蛋白，經(jīng)過抑菌試驗檢測該重組蛋白具有明顯的抑菌活性，為研究綿羊BPI蛋白的其他生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。PMN細胞內(nèi)諸多抗菌成分中，BPI是唯一能夠直接對革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用和中和內(nèi)毒素作用的抗菌物質(zhì)，被譽為“超級抗生素”[20]。本試驗中巴什拜羊重組BPI蛋白對G-菌均具有殺菌活性，但對G+無明顯效果。研究發(fā)現(xiàn)，BPI的N端、C端均含有1個非極性的脂質(zhì)結(jié)合口袋，該非極性口袋為BPI與LPS相互作用的位點。BPI分子N端的堿性氨基酸殘基比酸性氨基酸殘基多16個，而C端的堿性氨基酸殘基比酸性氨基酸殘基少2個。BPI蛋白分子N端和C端電荷的不對稱分布促使的帶正電荷的N端更加能夠促進BPI分子與G-菌細胞壁上帶負電荷的LPS之間的結(jié)合而起殺菌作用[21]。

參考文獻：

[1]決肯·阿尼瓦什. 巴什拜羊生物學(xué)特性及其遺傳多樣性研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[2]決肯·阿尼瓦爾，韓業(yè)東，李齊發(fā)，等. 巴什拜羊微衛(wèi)星標記多態(tài)性及其與生長指標關(guān)聯(lián)性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（16）：3425-3432.

[3]Domingues M M，Castanho M A，Santos N C. rBPI（21） promotes lipopolysaccharide aggregation and exerts its antimicrobial effects by （Hemi）fusion of PG-containing membranes[J]. PLoS One，2009，4（12）：e8385.

[4]Elsbach P，Weiss J. Role of the bactericidal/permeability-increasing protein in host defence[J]. Current Opinion in Immunology，1998，10（1）：45-49.

[5]Marra M N，Wilde C G，Collins M S，et al. The role of bactericidal/permeability-increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin[J]. Journal of Immunology ，1992，148（2）：532-537.

[6]Vander S D，Toebes E A，Haseman J R，et al. Bactericidal/permeability increasing protein inhibit sangiogenesis via induction of apopotosis invascular endothelial cells[J]. Blood，2000，96（1）：176-181.

[7]de Lucca A J，Walsh T J. Antifungal peptides：novel therapeutic compounds against emerging pathogens[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1999，43（1）：1-11.

[8]Arnold H，Horwitz，Paul M，et al. Fungicidal peptides from bactericidal/permeability-increasing protein（BPI） act synergystically with fluconazole on a variety of candida strains[M]. Toronto：ICAAC，1997：928-1001.

[9]程玉磊，祁克宗，潘玲，等. 殺菌性/通透性增加蛋白的生物學(xué)功能及其應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2005，26（3）：16-18.

[10]Levy O. A neutrophil-derived anti-infective molecule：bactericidal/permeability-increasing protein[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（11）：2925-2931.

[11]周紅，鄭江，肖光夏. 豬源殺菌性/通透性增加蛋白對革蘭陰性菌的作用[J]. 中華傳染病雜志，1999，17（1）：47-48.

[12]朱璟.BPI基因?qū)嗄套胸iF18大腸桿菌抗性的功能分析[D]. 揚州：揚州大學(xué)，2012.

[13]Alexander S，Bramson J，F(xiàn)oley R，et al. Protection from endotoxemia by adenoviral-mediated gene transfer of human bactericidal/permeability-increasing protein[J]. Blood，2004，103（1）：93-99.

[14]Riffault S，Carrat C，van Reeth K，et al. Interferon-α-producing cells are localized in gut-associated lymphoid tissues in transmissible gastroenteritis virus（TGEV） infected piglets[J]. Veterinary Research，2001，32（1）：71-79.

[15]徐紅，陳裕充，溫海，等. Neo-Sensitab紙片法與微量稀釋法檢測常見酵母菌對酮康唑敏感性的比較[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2004，19（5）：385-386.

[16]Scorer C A，Clare J J，Mccombie W R，et al. Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign gene expression[J]. Biotechnology，1994，12（2）：181.

[17]Yamada M，Azuma T，Matsuba T，et al. Secretion of human intracellular aspartic proteinase cathepsin E expressed in the methylotrophic yeast，Pichia pastoris and characterization of produced recombinant cathepsin E[J]. Biochimica et Biophysica acta，1994，1206（2）：279-285.

[18]周宇麒. 殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）研究和進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2001，7（10）：588-590.

[19]Gazzano-Santoro H，Parent J B，Grinna L，et al. High-affinity binging of the bactericidal/permeability-increasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of lipopolysaccharide[J]. Infection and Immunity，1992，60（11）：4754-4761.

[20]Gray P W，F(xiàn)laggs G，Leong S R，et al. Cloning of the cDNA of a human neutrophil bactericidal protein，structural and functional correlations[J]. Journal of Biological Chemistry，1989，264（16）：9505-9509.

[21]Bülow E，Gullberg U，Olsson I. Structural requirements for intracellular processing and sorting of bactericidal/permeability-increasing protein（BPI）：comparison with lipopolysaccharide-binding protein[J]. Journal of Leukocyte Biology，2000，68（5）：669-678.