韓衛(wèi)南 石露露 韓博

摘要? 目的：探討丹參酮ⅡA保護(hù)癲癇模型大鼠神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制。方法：將126只成年雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、紅藻氨酸注射組（KA組）、假手術(shù)＋丹參酮ⅡA組（Sham＋TA組）、KA＋丹參酮ⅡA組（KA＋TA組）、KA＋丹參酮ⅡA＋二硫代氨基甲酸二乙酯（DDC）組（KA＋TA＋DDC組）、KA＋50 mg/kg氯喹（CQ）組（KA-CQ組）。采用免疫熒光染色評(píng)價(jià)海馬CA3區(qū)中心區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元染色反應(yīng)，檢測(cè)大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性。提取大鼠的海馬區(qū)組織，采用蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測(cè)SOD1、SOD2、微管相關(guān)蛋白輕鏈Ⅰ/Ⅱ（LC3Ⅰ/Ⅱ）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：免疫熒光檢測(cè)顯示，KA組NeuN＋細(xì)胞的免疫反應(yīng)水平明顯低于Sham組和Sham＋TA組，尤其是在海馬CA3區(qū)；KA＋TA組NeuN（＋）細(xì)胞的免疫反應(yīng)水平明顯高于KA組。雙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KA組大鼠海馬CA3區(qū)LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)明顯增加，KA＋TA組神經(jīng)元LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)水平降低。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KA組SOD1和SOD2蛋白表在水平明顯低于Sham組，KA＋TA組SOD1和SOD2蛋白水平高于KA組，Beclin1表達(dá)低于KA組。與Sham組相比，KA組和KA＋TA＋DDC組大鼠海馬CA3區(qū)NeuN（＋）細(xì)胞較少。與Sham組相比，KA＋TA＋DDC組LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白水平明顯高于Sham組和KA組。KA＋TA組大鼠海馬區(qū)PI3K蛋白表達(dá)水平明顯高于KA組和KA＋TA＋DDC組，而KA＋TA＋DDC組大鼠海馬區(qū)PI3K蛋白表達(dá)水平低于KA組和KA＋TA組。結(jié)論：丹參酮ⅡA預(yù)處理對(duì)KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，這可能是通過激活PI3K/AKT和MAPK通路調(diào)節(jié)自噬活性相關(guān)。

關(guān)鍵詞? 癲癇；丹參酮ⅡA；神經(jīng)元損傷；紅藻氨酸；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；絲裂原活化蛋白激酶；超氧化物歧化酶；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.008

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，其引起的神經(jīng)毒性可導(dǎo)致海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷［1］。注射紅藻氨酸（kainic acid，KA）誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型可導(dǎo)致類似于顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）病人的行為發(fā)作和神經(jīng)病理損害。丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取出來的一種有效成分，具有清熱解毒、活血化瘀、散結(jié)的功效。有研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA對(duì)帕金森病、神經(jīng)行為障礙、神經(jīng)興奮劑毒性和腦缺血損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療，同時(shí)具有一定保護(hù)神經(jīng)元損傷的作用［2］。癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激在癲癇的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。在癲癇發(fā)作期間，大腦中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生會(huì)明顯增加，ROS的大量積累可以直接破壞蛋白質(zhì)等大分子，降解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。自噬是一種分解代謝過程，通過細(xì)胞內(nèi)溶酶體的作用降解物質(zhì)，在神經(jīng)元損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］，ROS廣泛參與了自噬的誘導(dǎo)，作為一

基金項(xiàng)目? 河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2019539）

引用信息? 韓衛(wèi)南，石露露，韓博.丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT及MAPK信號(hào)通路保護(hù)癲癇大鼠神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（11）：1967-1975.

種獨(dú)特的信號(hào)分子發(fā)揮作用，而丹參酮ⅡA具有一定的清除氧自由基的效應(yīng)。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可通過誘導(dǎo)正核因子-E2相關(guān)因子2（Nrf2）依賴的血紅素加氧酶-1（HO-1）活化來抑制氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)元損傷，其神經(jīng)保護(hù)作用是通過調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的［5］。雖然丹參酮ⅡA具有抗癲癇損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，但其潛在的機(jī)制仍不清楚。因此，本研究探討丹參酮ⅡA對(duì)癲癇大鼠模型神經(jīng)元損傷的潛在作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

126只8～10周成年雄性美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）大鼠購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2021-002，體質(zhì)量（270±10）g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2）℃，光/暗周期為12 h。可自由獲得食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。丹參酮ⅡA（純度≥98%）由上海源葉生物科技有限公司（中國上海）提供。紅藻氨酸（KA）、二硫代氨基甲酸二乙酯（DDC）和氯喹（CQ）由揚(yáng)州科能生物科技有限公司（揚(yáng)州）提供。將大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組（Sham組）、KA注射組（KA組）、假手術(shù)＋丹參酮ⅡA組（Sham＋TA組）、KA＋丹參酮ⅡA組（KA＋TA組）、KA＋丹參酮ⅡA＋DDC組（KA＋TA＋DDC組）、KA＋50 mg/kg CQ組（KA-CQ組）。Sham＋TA組、KA＋TA組和KA＋TA＋DDC組均于手術(shù)前給予50 mg/kg丹參酮ⅡA灌胃，連續(xù)灌胃3 d。KA＋TA＋DDC組于手術(shù)前7 d腹腔注射DDC 700 mg/kg。KA-CQ組于手術(shù)前7 d腹腔注射50 mg/kg的CQ。大鼠麻醉滿意后，拔除頭頂毛發(fā)，固定于定位器。對(duì)頭頂進(jìn)行消毒，并對(duì)皮膚進(jìn)行縱向或橫向切割，以定位前穹窿。然后定位Bregma點(diǎn)，用于將頭部固定螺釘定位在相對(duì)于Bregma 1.0 mm腹側(cè)0.22 mm、深度3.0 mm的位置。用微量注射器注射KA，把注射器放在定位器上，小心地將針放到頭蓋骨上洞下面3 mm的位置進(jìn)行注射，之后將針固定在原地3 min，然后緩慢退出以確保KA的適當(dāng)吸收。注射后，所有大鼠都被移到籠子里。30 min后評(píng)估大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，按改進(jìn)的Racine（1975）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，0級(jí)：處于安靜和平狀態(tài)；1級(jí)：抽搐、眨眼、咀嚼、流涎；2級(jí)：有節(jié)律性點(diǎn)頭、似濕狗抖動(dòng)；3級(jí)：單側(cè)前肢陣攣；4級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣和站立；5級(jí)：全身強(qiáng)直痙攣、持續(xù)站立、墜落等；6級(jí)：奔騰、尖叫或死亡。24 h后處死動(dòng)物。

1.2? 免疫組化染色

大鼠完全麻醉后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）經(jīng)心灌流15 min，再用4%多聚甲醛經(jīng)心灌流15 min。用手術(shù)鉗取出腦組織，在4%多聚甲醛中后處理6 h，然后在30%蔗糖中浸泡過夜。最后，用低溫恒溫儀將大腦連續(xù)切成30 μm的冠狀切片，并將這些冠狀切片轉(zhuǎn)移到4 ℃含PBS的6孔板上。腦切片依次用0.3%過氧化氫在PBS中處理20 min，然后將切片與稀釋的兔抗神經(jīng)元特異核蛋白（NeuN）在4 ℃下孵育過夜。第2天孵育二抗，通過在0.01 mol/L的PBS中加入3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽進(jìn)行顯色。為確定染色的特異性，用血清代替一抗進(jìn)行了陰性對(duì)照試驗(yàn)。陰性對(duì)照證實(shí)所有結(jié)構(gòu)中均無免疫反應(yīng)。用光密度（OD）評(píng)價(jià)NeuN的染色強(qiáng)度。

1.3? 免疫熒光染色

將腦切片在0.5%Triton X-100中浸泡10 min，然后在含有0.2%Triton X-100和5%BSA的PBS中浸泡1 h，然后分別與兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈Ⅰ/Ⅱ（LC3Ⅰ/Ⅱ）、鼠抗NeuN、鼠抗Beclin和兔超氧化物歧化酶（SOD）-2共同孵育12 h，而后分別與羊抗鼠抗體和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔抗體孵育2 h，在PBS中清洗兩次后密封。用AxioM1光學(xué)顯微鏡捕拍攝海馬體的熒光圖像，使用圖像分析系統(tǒng)（Optimas 6.5軟件）在靠近海馬CA3區(qū)中心的區(qū)域內(nèi)觀察神經(jīng)元染色反應(yīng)。

1.4? SOD活性檢測(cè)

提取大鼠的海馬區(qū)組織，在4 ℃下保存過夜，然后將組織按1∶9的比例加入生理鹽水中，在3 000×g、4 ℃的條件下離心10 min，獲得上清。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，利用WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SOD活性。

1.5? 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)

從大鼠大腦中取出海馬體，組織勻漿后提取蛋白質(zhì)，然后使用二喹啉甲酸（BCA）方法進(jìn)行定量。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，與5%牛血清白蛋白孵育1 h。然后，將膜與兔SOD-1、SOD-2、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1抗體在4 ℃下孵育過夜。用羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）孵育2 h。Western Blot結(jié)果用Quantity One Analysis軟件（BioRad）進(jìn)行分析，確定相對(duì)光密度（Rod），以百分比為單位校準(zhǔn)Rod比率。通過計(jì)算目的蛋白灰度值與β-肌動(dòng)蛋白灰度值的比值來評(píng)價(jià)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 海馬CA3區(qū)NeuN免疫反應(yīng)神經(jīng)元、NeuN、LC3Ⅰ/Ⅱ免疫熒光檢測(cè)

免疫熒光檢測(cè)顯示，KA組NeuN＋細(xì)胞的免疫反應(yīng)水平明顯低于Sham組和Sham＋TA組，尤其是在海馬CA3區(qū)；KA＋TA組NeuN（＋）細(xì)胞的免疫反應(yīng)水平明顯高于KA組。采用雙染色法觀察TA對(duì)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元內(nèi)聚集的自噬小體數(shù)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KA組大鼠海馬CA3區(qū)LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)明顯增加，表明KA致癇后神經(jīng)元LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)百分率明顯增加；相反，與KA組相比，KA＋TA組神經(jīng)元的LC3Ⅰ/Ⅱ水平降低。表明50 mg/kg的TA預(yù)處理減輕了KA致癇后海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷，并伴有LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)減少。詳見圖1～圖3。

（與Sham組比較，＊P＜0.01；與KA組比較，#P＜0.01）

2.2? 海馬CA3區(qū)SOD1、SOD2、LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KA組SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平明顯低于Sham組（P＜0.01），KA＋TA組SOD1和SOD2蛋白水平高于KA組（P＜0.01）。表明TA預(yù)處理提高了KA致癇神經(jīng)元損傷后海馬區(qū)的抗氧化指標(biāo)水平。KA組自噬相關(guān)蛋白C3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)水平高于Sham組（P＜0.01），而KA＋TA組海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白C3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)水平低于KA組（P＜0.01）。表明TA預(yù)處理降低了KA致癇損傷后的自噬水平。詳見圖4～圖6。

（與Sham組比較，＊P＜0.01；與KA組比較，#P＜0.01）

2.3? DDC干預(yù)后海馬區(qū)Neu免疫反應(yīng)神經(jīng)元及海馬CA3區(qū)LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平

DDC是一種有效的SOD活性抑制劑。DDC干預(yù)后，與Sham組相比，KA組和KA＋TA＋DDC組大鼠海馬CA3區(qū)NeuN（＋）細(xì)胞較少。此外，KA＋TA＋DDC組LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯高于Sham組和KA組（P＜0.01）。表明TA對(duì)KA致癇神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用與抗氧化酶表達(dá)增強(qiáng)介導(dǎo)的自噬減弱密切相關(guān)。詳見圖7～圖9。

（與Sham組比較，＊P＜0.01；與KA組比較，#P＜0.01）

2.4? DDC干預(yù)后海馬CA3區(qū)PI3K/AKT和MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KA組PI3K蛋白表達(dá)、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK比值均明顯低于Sham組（P＜0.01）；而KA＋TA＋DDC組大鼠海馬區(qū)PI3K蛋白表達(dá)、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK比值低于KA組和KA＋TA組（P＜0.01），P-AKT/AKT和p-MAPK/MAPK蛋白比值與PI3K表達(dá)變化一致。表明TA對(duì)KA誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用與激活PI3K、AKT和MAPK通路有關(guān)。詳見圖10、圖11。

（與Sham組比較，＊P＜0.01；與KA組比較，#P＜0.01；與KA＋TA組比較，△P＜0.01）

2.5? CQ干預(yù)后海馬CA3區(qū)Neu免疫反應(yīng)神經(jīng)元及LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白水平

CQ是一種自噬小體-溶酶體融合抑制劑。與Sham組相比，KA組海馬CA3區(qū)NeuN（＋）陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少；與KA組相比，KA＋TA組和KA-CQ組NeuN（＋）陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白水平均明顯降低（P＜0.01）。表明TA對(duì)KA所致癲癇神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用與減少自噬有關(guān)。詳見圖12～圖14。

（與Sham組比較，＊P＜0.01；與KA組比較，#P＜0.01）

3? 討? 論

本研究分析TA在KA誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中的干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg的TA對(duì)KA誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用。這與之前的研究發(fā)現(xiàn)TA保護(hù)神經(jīng)元免受損傷和皮質(zhì)神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性的影響是一致的。本研究表明，50 mg/kg的TA可減輕KA誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型中海馬區(qū)CA3區(qū)神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活與神經(jīng)元死亡密切相關(guān)的細(xì)胞毒物質(zhì)的釋放有關(guān)［6］。在癲癇的發(fā)病機(jī)制中，增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌過量的有害物質(zhì)，可能損害神經(jīng)元［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，在KA誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。TA可明顯抑制KA誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。有研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物包括利培酮和阿司匹林-氫楊醇復(fù)合物，可通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖，在神經(jīng)元中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［7］。本研究中，海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活減弱可能與TA對(duì)KA所致癲癇神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。癲癇引起的神經(jīng)元損傷與腦組織中的ROS有關(guān)［8］。抗氧化劑作為一種潛在的治療藥物，減輕ROS引起的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用［9］。目前的結(jié)果表明，50 mg/kg的TA維持海馬區(qū)SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平。同樣，一些抗氧化劑，如2-環(huán)丙基亞氨基-3-甲基-1，3-噻唑啉鹽酸鹽，對(duì)神經(jīng)元損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。另一方面，先前的研究發(fā)現(xiàn)，SOD水平的下降明顯加速了沙土鼠海馬齒狀回神經(jīng)元損傷［10］。在不同的SOD亞型中，SOD1存在于細(xì)胞質(zhì)中，而SOD2存在于線粒體基質(zhì)中。線粒體自噬在神經(jīng)元存活中起關(guān)鍵作用，線粒體自噬的過度表達(dá)可以導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，這種死亡可以通過使用抗氧化應(yīng)激療法來減輕，這有助于恢復(fù)自噬的保護(hù)作用［11］。因此，提高抗氧化劑水平和減少過度激活的自噬水平對(duì)神經(jīng)元的生存至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明TA可以通過提高SOD水平來抑制過度激活的線粒體自噬。因此，海馬CA3區(qū)SOD水平的升高可能與TA對(duì)癲癇所致神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

自噬通過清除細(xì)胞內(nèi)的廢物來維持細(xì)胞的正常新陳代謝，這是細(xì)胞生存所必需的［12］。自噬標(biāo)志物的水平升高，包括LC3和Beclin1，表明自噬被激活。自噬在細(xì)胞中扮演著兩個(gè)截然不同的角色，其效果嚴(yán)重依賴于疾病進(jìn)展的不同階段、細(xì)胞微環(huán)境的變化和治療措施的不同［13］。在正常情況下，自噬在大多數(shù)細(xì)胞中發(fā)生的水平相對(duì)較低。外部因素的刺激可以啟動(dòng)清除受損線粒體所需的自噬過程，從而保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步損害。然而，自噬的過度激活也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。自噬參與了癲癇引起的神經(jīng)元損傷過程，而自噬的缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元變性或死亡［14］。自噬過程的過度激活也可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。癲癇發(fā)作尤其是癲癇狀態(tài)對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷機(jī)制復(fù)雜多樣。自噬調(diào)節(jié)因子，包括微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（LC3）和Beclin1，可以促進(jìn)大鼠腦神經(jīng)元自發(fā)性癲癇的發(fā)生［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，TA通過減少過度激活的自噬水平，對(duì)癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，因此，TA具有細(xì)胞保護(hù)作用，部分是通過維持氧化應(yīng)激和自噬之間的平衡。先前的研究表明，ROS的積累可導(dǎo)致神經(jīng)元的自噬。同時(shí)，癲癇損傷會(huì)導(dǎo)致ROS的過度積累，這可能會(huì)導(dǎo)致隨后誘導(dǎo)自噬，試圖清除受影響的細(xì)胞成分。包括SOD在內(nèi)的抗氧化酶的增強(qiáng)和維持可以降低自噬水平，并保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，TA明顯增加海馬區(qū)SOD表達(dá)，而降低自噬相關(guān)蛋白如LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1水平。而當(dāng)DDC抑制SOD活性時(shí)，LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin1水平明顯升高。因此，本研究結(jié)果表明，TA對(duì)KA誘導(dǎo)的癲癇神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用與抗氧化酶生成增加而導(dǎo)致的自噬降低密切相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與KA組相比，KA-CQ組NeuN（＋）細(xì)胞數(shù)量急劇增加。表明通過給予自噬抑制劑CQ來抑制自噬，能夠提供類似于TA預(yù)處理后的保護(hù)作用，以對(duì)抗KA誘導(dǎo)的癲癇損傷，而抑制自噬可以保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。此外，增加抗氧化劑水平可以減少自噬引起的神經(jīng)元損傷。因此，在KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型中，抗氧化劑水平的增加和自噬水平的降低可能與TA的神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。PI3K/AKT和MAPK通路對(duì)癲癇損傷后神經(jīng)元的存活至關(guān)重要［16］。AKT的激活可以抑制神經(jīng)元的自噬，促進(jìn)神經(jīng)元的增殖和存活，有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可以抑制神經(jīng)元損傷［17］。在本研究中，預(yù)先給予50 mg/kg的TA可通過激活PI3K/AKT通路來保護(hù)神經(jīng)元免受癲癇損傷和氧化應(yīng)激。此外，MAPK通路被證實(shí)參與了有害的應(yīng)激刺激（高滲透壓、氧化應(yīng)激、低滲透壓），在ROS和自噬過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。先前的研究表明，ROS介導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK通路的磷酸化上調(diào)抑制了自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，TA預(yù)處理上調(diào)了PI3K/AKT和MAPK通路相關(guān)蛋白水平，而下調(diào)了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。然而，在DDC干預(yù)后，TA對(duì)PI3K/AKT或MAPK通路相關(guān)蛋白水平都沒有影響。因此，TA通過激活PI3K/AKT和MAPK通路來抑制癲癇所致的神經(jīng)元損傷。

綜上所述，TA預(yù)處理對(duì)KA誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。此外，TA的神經(jīng)保護(hù)作用可能與通過激活PI3K/AKT和MAPK通路維持抗氧化水平和自噬密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2022-11-07）

（本文編輯郭懷?。?/p>