張莉 崔洋洋 張萍 陳璐

摘要? 目的：探討葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制。方法：采用高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）建立細(xì)胞損傷模型，葛花總黃酮處理高糖誘導(dǎo)的HUVECs；利用試劑盒檢測丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）法檢測miR-155-5p的mRNA表達(dá)量；anti-miR-NC、anti-miR-155-5p分別轉(zhuǎn)染至HUVECs后加入含有30 mmol/L葡萄糖處理24 h，miR-NC、miR-155-5p mimics分別轉(zhuǎn)染至HUVECs后加入含有100 mg/L葛花總黃酮與30 mmol/L葡萄糖處理24 h，采用上述方法分別檢測細(xì)胞凋亡率、MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性；Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表達(dá)水平用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）法進(jìn)行檢測。結(jié)果：葛花總黃酮處理后，高糖誘導(dǎo)的HUVECs中MDA水平、凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9表達(dá)和凋亡率下降（P＜0.05），miR-155-5p表達(dá)量降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性；轉(zhuǎn)染anti-miR-155-5p后，MDA水平、凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9表達(dá)、凋亡率、SOD、GSH-Px的活性呈現(xiàn)出葛花總黃酮處理組相同的趨勢（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics可減弱葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激及凋亡的作用。結(jié)論：葛花總黃酮可以抑制miR-155-5p表達(dá)，減輕細(xì)胞氧化損傷和凋亡，減輕高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞? 葛花總黃酮；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；miR-155-5p；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.009

糖尿病血管并發(fā)癥是常見的一種疾病類型，我國糖尿病發(fā)病率逐年上升，體內(nèi)血糖水平持續(xù)升高可導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生［1-2］。高糖可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞［3-4］，因此，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷將有助于減緩糖尿病血管病變的發(fā)展進(jìn)程。葛花是豆科植物野葛的花，研究表明葛花總黃酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制炎性因子有關(guān)［5］。但葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷影響尚未可知。微小RNA（miRNA）屬于單鏈小RNA分子，其可通過阻止靶基因的翻譯及表達(dá)從而發(fā)揮作用，有研究指出，神經(jīng)細(xì)胞損傷可上調(diào)miR-155-5p表達(dá)，抑制其表達(dá)可減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞

引用信息? 張莉，崔洋洋，張萍，等.葛花總黃酮通過調(diào)控miR-155-5p對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（11）：1975-1980.

損傷［6］。miR-155-5p在高糖環(huán)境下的表達(dá)及作用研究較少。本研究將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）暴露于高糖環(huán)境，探討葛花總黃酮是否通過調(diào)控miR-155-5p的表達(dá)影響高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

葛花購自西安匯林生物科技有限公司；HUVECs購自上海弘順生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生化；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；一抗Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9及其二抗均購自美國CST。

1.2? 方法

1.2.1? 制備葛花總黃酮

精確稱量5 g葛花粗粉，分別加入30%、50%、70%、90%乙醇，超聲提取時(shí)間分別為40、60、80、100 min，提取2次后過濾，收集濾液后減壓回收至得到葛

花提取物，將葛花提取物放置在25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解定容后測量總黃酮含量（5.16%），加入二甲基亞砜（DMSO）溶解葛花總黃酮，稀釋濃度至10、30、100 mg/L［7］。

1.2.2? 實(shí)驗(yàn)分組

HUVECs接種于6孔板（1×105個(gè)/孔），加入含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs 24 h［8］，作為HG組。加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs 24 h，作為Con組。加入含有不同濃度葛花總黃酮（10、30、100 mg/L）與30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs 24 h，分別作為HG＋葛花總黃酮-低組、HG＋葛花總黃酮-中組、HG＋葛花總黃酮-高組。采用anti-miR-NC、anti-miR-155-5p、miR-NC、miR-155-5p mimics分別轉(zhuǎn)染至HUVECs，轉(zhuǎn)染成功后加入含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM，或加入含有100 mg/L葛花總黃酮與30 mmol/L葡萄糖的DMEM，培養(yǎng)HUVECs 24 h，分別作為HG＋anti-miR-NC組、HG＋anti-miR-155-5p組、HG＋葛花總黃酮＋miR-NC組、HG＋葛花總黃酮＋miR-155-5p組。

1.2.3? 檢測MDA水平和SOD、GSH-Px活性

收集各組HUVECs，按照對應(yīng)指標(biāo)的試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀在對應(yīng)檢測波長下檢測MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.2.4? 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集各組HUVECs，嚴(yán)格按照試劑盒說明，采用人膜聯(lián)蛋白V-異硫氨酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）雙染色法，避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測待檢。

1.2.5? 測定miR-155-5p水平

收集各組HUVECs加入裂解溶液后室溫孵育5 min，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后依次分別加入氯仿、異丙醇，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，充分洗滌RNA沉淀，離心后棄上清得到RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μL與10 μL SYBR Green Master Mix、0.8 μL正反向引物和ddH2O（補(bǔ)足體系）配制20 μL的qRT-PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用美國ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（循環(huán)40次）的反應(yīng)條件下，檢測miR-155-5p基因表達(dá)。

1.2.6? 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）法檢測凋亡蛋白表達(dá)

收集HUVECs細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，測定濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟完成后，加入一抗Cleaved-Caspase 3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase 9（1∶1 000），內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1∶3 000），4 ℃孵育12 h，加入二抗（1∶5 000），孵育2 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，以蛋白條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采取t檢驗(yàn)，單因素方差分析用于多組間比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Con組比較，HG組MDA水平升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px的活性降低（P＜0.05）；與HG組比較，HG＋葛花總黃酮-低組、HG＋葛花總黃酮-中組、HG＋葛花總黃酮-高組MDA水平降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px的活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。詳見表1。

2.2? 葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

與Con組比較，HG組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平上升（P＜0.05）；與HG組比較，HG＋葛花總黃酮-低組、HG＋葛花總黃酮-中組、HG＋葛花總黃酮-高組細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。詳見表2及圖1。

2.3? 葛花總黃酮對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞miR-155-5p表達(dá)的影響

HG組miR-155-5p的表達(dá)量較Con組升高（P＜0.05）；HG＋葛花總黃酮-低組、HG＋葛花總黃酮-中組、HG＋葛花總黃酮-高組miR-155-5p的表達(dá)量較HG組降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。詳見表3。

2.4? 干擾miR-155-5p表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

HG＋anti-miR-155-5p組MDA水平較HG＋anti-miR-NC組下降（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)（P＜0.001），細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白和凋亡率水平下降（P＜0.05）。詳見圖2、圖3及表4。

2.5? 上調(diào)miR-155-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)葛花總黃酮（100 mg/L）對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用

與HG＋葛花總黃酮＋miR-NC組比較，HG＋葛花總黃酮＋miR-155-5p組MDA升高，SOD、GSH-Px活性下降（P＜0.001）；細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白和凋亡率水平升高（P＜0.001）。詳見圖3及表5。

3? 討? 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥的主要病理改變，隨著疾病惡化可加重心血管疾病的發(fā)生，高糖可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的發(fā)生從而加重細(xì)胞損傷，研究表明，中醫(yī)藥具有抗氧化、抗炎等作用從而減緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展［9］。miRNA在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，有作為糖尿病血管并發(fā)癥治療靶點(diǎn)的潛力［10-11］。但miRNA是否可作為中醫(yī)藥治療糖尿病血管并發(fā)癥的潛在靶點(diǎn)尚未闡明。

葛花總黃酮是葛花的主要活性成分之一，其具有清除活性氧的能力，還具有抗氧自由基的作用，研究表明，葛花總黃酮可抑制炎癥細(xì)胞因子浸潤及細(xì)胞凋亡從而減輕心肌缺血再灌注損傷［12］。葛花總黃酮可通過增強(qiáng)大鼠視網(wǎng)膜抗氧化能力從而減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展進(jìn)程［13］。但葛花總黃酮與糖尿病血管并發(fā)癥相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MDA水平上升，SOD、GSH-Px活性下降，與之前的文獻(xiàn)研究結(jié)果［14］相近，葛花總黃酮處理后MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性升高，且呈劑量依賴性，提示葛花總黃酮可引導(dǎo)高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化平衡。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9和凋亡率水平升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［15］相似，葛花總黃酮能夠以濃度依賴性方式降低細(xì)胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平，提示葛花總黃酮可抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

miR-155-5p在草酸及一水草酸鈣（COM）誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）損傷中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可抑制COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化損傷［16］。在缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞中，miR-155-5p表達(dá)增加，干擾miR-155-5p可緩解心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷［17］。抑制miR-155-5p表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激及炎性，減緩高糖誘導(dǎo)疾病的發(fā)生發(fā)展［18］。本研究結(jié)果顯示，HG組miR-155-5p的表達(dá)上調(diào)，葛花總黃酮可使miR-155-5p表達(dá)下調(diào)，提示葛花總黃酮減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的途徑可能通過下調(diào)miR-155-5p表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-155-5p表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力及抑制細(xì)胞凋亡，而miR-155-5p過表達(dá)后，葛花總黃酮抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡作用消失。提示葛花總黃酮通過抑制miR-155-5p的表達(dá)而減緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-155-5p表達(dá)水平升高，葛花總黃酮可抑制miR-155-5p的表達(dá)，減輕高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡，進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷，認(rèn)為miR-155-5p有作為葛花總黃酮減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷治療靶點(diǎn)的潛力。

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（收稿日期：2022-09-28）

（本文編輯王雅潔）