薛宇鑫 于闊躍 董高緣 袁穎 呂艷芳 季廣仁 李穎暢

摘要：為確定酶-超聲波輔助提取海蜇膠原蛋白的最佳工藝，采用單因素實驗和響應面實驗對工藝進行優(yōu)化，考察胃蛋白酶添加量、提取時間、超聲時間、超聲功率對海蜇膠原蛋白得率的影響，并對膠原蛋白的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明，酶-超聲波輔助提取海蜇膠原蛋白的最佳條件為胃蛋白酶添加量1%、提取時間48 h、超聲時間32 min、超聲功率318 W，此時海蜇膠原蛋白得率為38.03%。甘氨酸是海蜇膠原蛋白中的主要氨基酸，為24.96%，海蜇膠原蛋白的紫外吸收峰位于235 nm處。在酰胺A、B帶以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶中，有海蜇膠原蛋白的典型紅外光譜特征吸收峰。該研究為海蜇深加工提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海蜇；膠原蛋白提??；胃蛋白酶；超聲波

中圖分類號：TS254.9

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0070-07

Extraction of Collagen from Jellyfish Using Enzyme-Ultrasound Assisted

Extraction Method and Analysis of Its Composition

XUE Yu-xin¹， YU Kuo-yue¹， DONG Gao-yuan¹， YUAN Ying¹，

LYU Yan-fang¹， JI Guang-ren²， LI Ying-chang^1*

（1.National & Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， College of Food Science and

Engineering， Bohai University， Jinzhou 121013， China; 2.Jinzhou Bijiashan

Food Co.， Ltd.， Jinzhou 121007， China）

Abstract： To determine the optimal process of enzyme-ultrasound assisted extraction of collagen from jellyfish， the process is optimized using single factor experiment and response surface experiment. The effects of pepsin addition amount， extraction time， ultrasound time and ultrasound power on the yield of jellyfish collagen are studied， and the composition of amino acids and structure of collagen are analyzed. The results show that the optimal conditions for enzyme-ultrasound assisted extraction of collagen from jellyfish are 1% pepsin， extraction time of 48 h， ultrasound time of 32 min and ultrasound power of 318 W， at this time， the yield of jellyfish collagen is 38.03%. Glycine is the main amino acid in jellyfish collagen， and the content is 24.96%. The UV absorption peak of jellyfish collagen is at 235 nm. There are typical infrared spectral characteristic absorption peaks of jellyfish collagen in amide A and B bands as well as Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ bands. This study has provided a theoretical basis for the deep processing of jellyfish.

Key words： jellyfish; collagen extraction; pepsin; ultrasound

收稿日期：2023-12-11

基金項目：基層科普行動計劃項目（JCKPXDJH2023）；遼寧省區(qū)域創(chuàng)新聯(lián)合基金（2020-YKLH-25）

作者簡介：薛宇鑫（2000—），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者：李穎暢（1973—），女，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。

被譽為“海產(chǎn)八珍”之一的海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）屬于暖水性水母類，為白色、青色或微黃色，具有藥食兩用的功效，有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值^[1-3]。海蜇蛋白質(zhì)占總干重質(zhì)量的50%，其中膠原蛋白含量最高^[4]。膠原蛋白主要來源于陸生動物，但由于這類膠原蛋白可能會引起人畜共患病，研究人員將目光轉(zhuǎn)向水產(chǎn)類膠原蛋白。當前市場上已涌現(xiàn)出多種以魚肉和魚皮為原料的膠原蛋白產(chǎn)品^[5-6]。膠原蛋白的提取方法主要分為酸法提取、酶法提取、堿法提取、熱水提取、鹽溶液提取。酸法提取容易破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，堿法提取會使蛋白質(zhì)發(fā)生消旋現(xiàn)象^[7]。其他提取膠原蛋白的方法會導致膠原組織分解不徹底，膠原蛋白得率較低。超聲波是一種頻率介于20 kHz～100 MHz之間的機械波，低強度的超聲波作為一種安全高效的物理輔助方式，可以引起溶液的機械振動，使溶劑更好地進入物質(zhì)內(nèi)部，引發(fā)串聯(lián)式作用，促進反應快速發(fā)生^[8-9]。衣程遠等^[10]采用低強度超聲波輔助提取大豆蛋白，蛋白得率優(yōu)于堿溶酸沉法。李朝蕊等^[11]也發(fā)現(xiàn)超聲處理可促進蛋白溶解，在蛋白乳化中也可發(fā)揮作用。本研究采用低強度超聲波和酶法輔助提取海蜇膠原蛋白，以期提高海蜇膠原蛋白得率，并對所得海蜇膠原蛋白組成進行分析，為海蜇的深加工提供了理論基礎(chǔ)，拓寬了水產(chǎn)膠原蛋白的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蜇皮（食用級）：錦州市林西水產(chǎn)市場；乙酸（36%，分析純）、羥脯氨酸試劑盒：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胃蛋白酶（≥3 000 U/mg）：上海麥克林生化科技股份有限公司；透析袋：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Scientz-ⅡD超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FreeZone 2.5 L真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；UV-2550紫外可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日立高新技術(shù)有限公司；8H-3數(shù)顯磁力加熱攪拌器 錦州藥業(yè)（集團）器化玻有限公司；Scimitar 2000傅里葉變換紅外光譜儀 美國安捷倫公司；MS105DU電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Thermo X1R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海蜇皮前處理

將鹽漬海蜇皮用自來水反復沖洗，沖洗后的海蜇皮浸泡在超純水中12 h，每3 h換一次水，將超純水浸泡后的海蜇皮瀝干水分，放入密封袋中置于4 ℃冰箱中備用。將脫鹽處理后的海蜇皮放入0.1 mol/L NaOH溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌3 d，攪拌過程中每8 h更換一次氫氧化鈉溶液，之后將海蜇皮撈出，用蒸餾水反復清洗至中性，切分成2 cm×2 cm×0.5 cm大小方塊后瀝干備用。

1.3.2 海蜇膠原蛋白提取方法

將上述處理后的海蜇皮浸泡在0.5 mol/L乙酸溶液中，料液比為1∶1，加入一定量胃蛋白酶進行消解后離心，以10 000 r/min離心20 min（4 ℃），隨后將上清液裝入透析袋中，于0.02 mol/L Na₂HPO₄溶液中進行透析，透析液的量為透析袋內(nèi)溶液體積的15～20倍，透析過程中每6 h更換一次透析液，透析3 d后以10 000 r/min離心，棄上清液，將沉淀復溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，凍干后于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3 海蜇中膠原蛋白含量的測定

膠原蛋白中含有一種獨特的氨基酸，即羥脯氨酸。因此通常采用羥脯氨酸的含量來確定膠原蛋白的含量。羥脯氨酸含量采用羥脯氨酸試劑盒測定。海蜇膠原蛋白得率計算公式如下：

海蜇膠原蛋白得率（%）=提取物干重（g）×羥脯氨酸含量（%）×11.1海蜇干重（g）×100%。

式中：11.1為膠原蛋白水解為羥脯氨酸的系數(shù)。

1.3.4 單因素實驗

在海蜇膠原蛋白提取實驗中，分別設置胃蛋白酶添加量為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，提取時間為0，12，24，36，48，60 h，超聲時間為0，10，20，30，40，50 min，超聲功率為0，100，200，300，400，500 W，平行3次，以海蜇膠原蛋白得率為指標分析胃蛋白酶添加量、提取時間、超聲時間、超聲功率對海蜇膠原蛋白得率的影響。

1.3.5 響應面優(yōu)化

基于Box-Behnken實驗設計，選取酶添加量（A）、提取時間（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）4個因素對海蜇膠原蛋白提取工藝進行優(yōu)化，響應面實驗設計見表1。

1.3.6 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016中食品氨基酸檢測方法^[12]，將上述制備好的海蜇膠原蛋白試樣取40 mg溶于15 mL 6 mol/L鹽酸溶液中，加苯酚3滴，置于蒸煮袋內(nèi)真空密封，放入110 ℃的環(huán)境中振蕩22 h，振蕩結(jié)束后取出，然后用氨基酸自動分析儀對其進行分析。

1.3.7 紫外光譜分析

將凍干的海蜇膠原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液中，得到膠原蛋白溶液，以 10 000 r/min離心5 min，收集上清液。用紫外分光光度計在 200～400 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，以乙酸溶液為空白對照。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Zhu等^[13]的方法，將制備的海蜇膠原蛋白樣品與經(jīng)過干燥處理的溴化鉀粉末磨碎混合，用壓力機將其壓成薄片，置于傅里葉變換紅外光譜儀中，在500～4 000 cm^-1的波長范圍內(nèi)進行掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，并用Origin軟件制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量對海蜇膠原蛋白得率的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，海蜇膠原蛋白得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當酶添加量為1%時，膠原蛋白得率最高，達到32.38%；當酶添加量超過1%并持續(xù)增加時，酶對膠原蛋白非螺旋區(qū)域產(chǎn)生作用，造成膠原蛋白得率略有降低，所以酶添加量初步確定為0.75%～1.25%。

2.2 提取時間對海蜇膠原蛋白得率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，海蜇膠原蛋白得率增加，48 h后膠原蛋白得率趨于平衡。由于膠原蛋白溶出過程是溶質(zhì)、溶劑雙向傳遞過程，未達到平衡前，溶劑中膠原蛋白含量隨著時間的延長而不斷增加，達到平衡后，一部分膠原蛋白和酶相互作用水解成膠原蛋白多肽，使得率略有降低，在48 h時膠原蛋白得率高達33.1%。所以，提取時間初步確定為36～60 h。

2.3 超聲時間對海蜇膠原蛋白得率的影響

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，膠原蛋白得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。超聲時間為10 min時膠原蛋白得率顯著升高，表明超聲波能提高膠原蛋白得率并縮短提取時間。同時，超聲波作用30 min時得率最高，此時海蜇膠原蛋白幾乎全部溶解于提取液中；超聲時間持續(xù)增加所引起的熱效應造成局部高溫狀態(tài)，促使膠原蛋白水解成多肽，使海蜇膠原蛋白得率呈降低趨勢，所以超聲時間可初步確定為20～40 min。

2.4 超聲功率對海蜇膠原蛋白得率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，海蜇膠原蛋白得率基本呈增加趨勢。超聲功率從0 W上升到100 W的過程中膠原蛋白得率升高最快，海蜇膠原蛋白多數(shù)已經(jīng)溶解在提取液中。隨著超聲功率不斷增加，膠原蛋白得率上升緩慢，超聲功率達到300 W時膠原蛋白得率最高，達到32.38%，所以超聲功率初步確定為200～400 W。

2.5 響應面實驗設計與結(jié)果

采用響應面分析法對海蜇膠原蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，并基于Box-Behnken實驗設計，選取酶添加量（A）、提取時間（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）4個因素進行四因素三水平響應面實驗。響應面實驗設計和結(jié)果見表2。

回歸方程方差分析結(jié)果見表3。

通過Design-Expert 10.0.3軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到海蜇膠原蛋白得率的二次多項回歸方程：Y=37.209 9－0.069 166 7A+1.339 92B+2.563 32C+2.752 87D－1.597 6AB+0.976 022AC+0.810 054AD－4.526 59BC－1.819 01BD－2.498 28CD－2.741 91A²－4.085 04B²－5.055 12C²－6.210 55D²。

F值代表各變量對響應值的影響程度，且變量和響應值之間的關(guān)系為正相關(guān)。模型的F=28.16，P<0.01，表明建立的模型達到極顯著水平；在顯著性檢驗概率P＜0.05的情況下，得出模型具有統(tǒng)計學意義。失擬項的F=3.86，P=0.102 5>0.05，失擬項不顯著，表明二次多項模型的擬合程度良好。其中，該模型中的一次項C、D，交互項BC、CD，二次項A²、B²、C²、D²對海蜇膠原蛋白得率的影響極顯著；一次項B、交互項AB、BD對海蜇膠原蛋白得率的影響顯著。由表3可知，4個因素對海蜇膠原蛋白得率的影響程度排序為D>C>B>A，即超聲功率>超聲時間>提取時間>酶添加量。模型的決定系數(shù)R²為0.965 7，表明該模型具有較高顯著性，回歸方程有較好的相關(guān)性；變異系數(shù)R_Adj²=0.931 4，表明該回歸模型中93.14%的響應值隨自變量發(fā)生變化，且與預測相關(guān)系數(shù)R_Pred²接近，說明此實驗模型與真實數(shù)據(jù)的擬合程度良好，具有實踐指導意義，由此可以采用該模型分析和預測得率最優(yōu)的提取工藝。

2.6 響應面分析

由圖5可知，酶添加量和提取時間的交互作用對膠原蛋白的得率影響趨勢表現(xiàn)為拋物曲面，曲面總體縱向跨度大，等高線表現(xiàn)為明顯的橢圓形，說明兩者交互作用顯著影響膠原蛋白得率。膠原蛋白得率隨著酶添加量和提取時間的增加均呈先上升后下降變化趨勢。酶添加量為0.875%～1.125%、提取時間為48～54 h時可顯著提高膠原蛋白得率。

由圖6可知，提取時間和超聲時間的交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形，3D曲面縱向跨度較大，說明提取時間和超聲時間的交互作用對膠原蛋白得率的影響顯著。在提取時間低于48 h的情況下，膠原蛋白得率和提取時間呈正相關(guān)關(guān)系；當提取時間超過48 h后，它們之間的相關(guān)關(guān)系出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，取臨界最佳工藝參數(shù)，當提取時間接近48 h時，膠原蛋白得率最高，同理膠原蛋白得率最高臨界最佳工藝參數(shù)約為30～35 min。

由圖7可知，提取時間和超聲功率的交互作用對膠原蛋白得率的影響呈拋物曲面，二者交互作用顯著，超聲功率是影響膠原蛋白得率的敏感因子，隨著超聲功率和超聲時間的提高，膠原蛋白得率呈先上升后下降的趨勢，提取時間為42～54 h、超聲功率為300～350 W時對膠原蛋白得率的提高有利。

由圖8可知，超聲時間和超聲功率的交互作用響應曲面陡峭趨勢明顯，二者交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明超聲時間與超聲功率均對海蜇膠原蛋白得率有顯著影響，隨著超聲時間的延長和超聲功率的增大，膠原蛋白得率先升高后降低。超聲時間30～40 min、超聲功率300～350 W時可顯著提高膠原蛋白得率。

采用Design-Expert 10.0.3軟件對海蜇膠原蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，得出在酶添加量、提取時間、超聲時間和超聲功率這4個因素相互影響下，海蜇膠原蛋白得率最優(yōu)的提取工藝為酶添加量1.014%、提取時間47.916 h、超聲時間32.171 min和超聲功率318.219 W。在該條件下，預測模型的膠原蛋白得率為37.733%。

根據(jù)上述模型預測結(jié)果及海蜇膠原蛋白實際工藝操作可行性，采用酶添加量1%、提取時間48 h、超聲時間32 min、超聲功率318 W為海蜇膠原蛋白提取條件。進行3次平行實驗，海蜇膠原蛋白平均得率為38.03%，與模型的預測結(jié)果高度吻合，表明基于該響應面模型優(yōu)化海蜇膠原蛋白提取工藝有效可行。

2.7 氨基酸組成分析

由表4可知，海蜇膠原蛋白所含的氨基酸種類較多，主要有纈氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和亮氨酸7種必需氨基酸。主要氨基酸為甘氨酸，占海蜇膠原蛋白氨基酸總量的24.96%。甘氨酸的側(cè)鏈由單獨的氫原子組成，存在于海蜇膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的中間位置，促使膠原蛋白的3個螺旋纏繞形成超螺旋結(jié)構(gòu)，對超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用^[14]。研究表明，膠原蛋白中的羥脯氨酸可在鏈間通過羥基形成氫鍵，同時與同為亞氨基酸的脯氨酸在限制肽鏈二級結(jié)構(gòu)變化中發(fā)揮重要作用^[15]，更好地維持海蜇膠原蛋白超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.8 紫外光譜分析

由圖9可知，海蜇膠原蛋白的最大吸收峰在235 nm處，這主要與海蜇膠原蛋白中含有的羰基、羧基基團有關(guān)^[16-18]，且膠原蛋白中肽鏈彎曲會導致由CO引起的吸收峰發(fā)生紅移；與其他來源的水產(chǎn)類膠原蛋白的吸收特征一致。另外，在275 nm處有一微弱吸收峰，與氨基酸分析相結(jié)合，推測是膠原蛋白分子中所含酪氨酸殘基上共軛雙鍵造成的^[19]。

2.9 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

由圖10可知，酰胺A帶位于3 279.61 cm^-1處，表明海蜇膠原蛋白中存在氫鍵，氮氫鍵的伸縮振動范圍為3 390～3 420 cm^-1，當與膠原蛋白中羰基結(jié)合形成氫鍵后，其波數(shù)會移至3 300 cm^-1附近。酰胺B帶位于2 923.15 cm^-1處，是碳氫鍵的不對稱伸縮振動導致的。此外，海蜇膠原蛋白的氨基酸序列和三螺旋結(jié)構(gòu)與酰胺Ⅰ、Ⅱ帶和Ⅲ帶的伸縮振動密切相關(guān)^[20]。在1 645.21 cm^-1處酰胺Ⅰ帶表現(xiàn)出最強的吸收能力，這是由于海蜇膠原蛋白處于交聯(lián)狀態(tài)時，肽鏈中碳氧雙鍵的伸縮振動導致的^[21]。

酰胺Ⅱ帶位于1 550～1 600 cm^-1處^[22]，酰胺Ⅱ帶位于1 543.17 cm^-1處，是由氮氫鍵的彎曲振動以及碳氮鍵的耦合引起的。酰胺Ⅲ帶位于1 000～1 400 cm^-1處，酰胺Ⅲ帶呈現(xiàn)出明顯的特征峰，而在酰胺A、B帶以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶中，可以觀察到海蜇膠原蛋白的典型紅外光譜特征吸收峰。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和響應面優(yōu)化確定了海蜇膠原蛋白提取的最佳實驗條件為酶添加量1%、提取時間48 h、超聲時間32 min、超聲功率318 W，此時海蜇膠原蛋白得率為38.03%。氨基酸分析結(jié)果表明，海蜇膠原蛋白中含有纈氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸7種必需氨基酸，主要氨基酸為甘氨酸，占氨基酸總量的24.96%；紫外光譜與傅里葉紅外光譜結(jié)果表明海蜇膠原蛋白結(jié)構(gòu)具有典型的膠原蛋白特征。海蜇膠原蛋白的提取過程采用胃蛋白酶-超聲輔助提取方法，提高了海蜇膠原蛋白得率，提升了海蜇的應用價值。

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