于迪 李優(yōu)優(yōu) 姜東華 孔繁磊 皮亦華

摘要：高蛋白肉制品在熱處理中容易生成稠環(huán)芳烴雜環(huán)胺，其中PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine）是日常家庭烹飪中含量較高且有致癌風險的一種極性雜環(huán)胺。葛仙米為我國一種珍貴的野生藍藻生物，是含有多種活性物質(zhì)的一種新食品原料。該實驗在苯丙氨酸和肌酐為前體物質(zhì)的模型體系中，分別加入0，30，50，100，150μg的葛仙米多糖提取物進行反應，利用UPLC-MS/MS對模型體系中反應前體物質(zhì)苯丙氨酸和肌酐、中間產(chǎn)物苯乙醛及產(chǎn)物PhIP進行鑒定并監(jiān)測含量變化，實驗結(jié)果表明，葛仙米多糖提取物能較好地抑制雜環(huán)胺PhIP的生成，模型體系中苯丙氨酸、肌酐和苯乙醛含量均呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢。在葛仙米多糖提取物添加量為50μg時，對模型反應體系中PhIP的抑制效果最好，抑制率為84.9%。推測葛仙米多糖提取物作用機制是通過抑制苯丙氨酸降解生成苯乙醛，阻礙其與肌酐發(fā)生反應，最終抑制PhIP的生成。該研究為利用葛仙米多糖提取物抑制食品熱加工中PhIP的生成奠定了理論基礎(chǔ)，有利于進一步開發(fā)具有葛仙米特殊風味的功能性調(diào)味品，為調(diào)味品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：葛仙米多糖提取物；苯丙氨酸；肌酐；苯乙醛；PhIP；抑制機制

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0009-06

Study on Inhibitory Effect of Nostoc sphaeroides Polysaccharide

Extracts on PhIP in Model System

YU Di ^1，2， LI You-you¹， JIANG Dong-hua¹， KONG Fan-lei¹， PI Yi-hua^2*

（1.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China;

2.Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-incidence

Infectious Diseases with Integrative Medicine， Nanning 530200， China）

Abstract： High-protein meat products are prone to generate polycyclic aromatic heterocyclic amines during heat treatment， among which， PhIP （2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine） is a polar heterocyclic amine with high content in daily home cooking and a risk of cancer. Nostoc sphaeroides is a type of precious wild cyanobacteria in China， which is a new food raw material containing many kinds of active substances. In this experiment， 0， 30， 50， 100， 150μg Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts are added into the model system with phenylalanine and creatinine as the precursor substances for reaction. UPLC-MS/MS is used to identify the precursor substances for reaction such as phenylalanine and creatinine， the intermediate product phenylacetaldehyde and the product PhIP in the model system and monitor the content changes. The results show that Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts could inhibit the generation of heterocyclic amine PhIP， and the content of phenylalanine， creatinine and phenylacetaldehyde in the model system decreases firstly and then increases. The inhibition effect on PhIP in the model reaction system is the best when the addition amount of Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts is 50μg， with the inhibition rate is speculated that the mechanism of Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts is inhibiting the degradation of phenylalanine to produce phenylacetaldehyde， hindering its reaction with creatinine， and finally inhibiting the generation of PhIP. This study has laid a theoretical foundation for inhibiting the generation of PhIP in heat treatment of food by Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts， which is conducive to further developing functional condiments with special flavor of Nostoc sphaeroides， and has provided a new idea for the development of condiment industry.

Key words： Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts; phenylalanine; creatinine; phenylacetaldehyde; PhIP; inhibitory mechanism

收稿日期：2023-11-21

基金項目：國家自然科學基金（32060576）；廣西中醫(yī)藥大學“桂派杏林青年英才”（2022C026）；廣西中醫(yī)藥大學校級科研課題（2023MS013）；廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室開發(fā)課題（KJT20007）；廣西中醫(yī)藥大學‘桂派中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新團隊資助項目：農(nóng)作物廢棄物藥用研究創(chuàng)新團隊（2022A005）

作者簡介：于迪（1982—），男，副教授，博士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通信作者：皮亦華（1977—），女，講師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。 of 84.9%. It

肉類富含蛋白質(zhì)且味道鮮美，是人體獲取多種營養(yǎng)元素的重要來源之一，然而在高溫加工過程中肉類獨特風味形成的同時會通過美拉德反應與自由基反應等形成一些致癌、致畸的有害物質(zhì)如雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）^[1-3]。在家庭烹飪中含量最高的一種雜環(huán)胺是PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine），基于不同類型雜環(huán)胺的致癌性，國際癌癥研究機構(gòu)將PhIP劃分為2B類潛在致癌物^[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PhIP會誘發(fā)機體突變，提高乳癌和大腸癌的發(fā)病率，同時隨著PhIP攝入量的增加，患癌幾率增高，在攝入雜環(huán)胺而致癌的風險中，有半數(shù)是由PhIP引起的，對人體健康造成極大的威脅^[5-7]。

目前抑制PhIP的形成有很多途徑，在自身加工方面，選擇合適的加工方法、合理控制加工的溫度和時間等可以一定程度上抑制PhIP的生成。Gibis等^[8]在煎烤豬肉片時發(fā)現(xiàn)溫度控制在150～170 ℃比在200～220 ℃條件下生成的雜環(huán)胺含量減少一半。趙電波等^[9]對比發(fā)現(xiàn)鹵煮-油炸工藝使雜環(huán)胺的種類和生成量增加。添加外源性成分也是抑制PhIP的常用方法，在抑制PhIP形成的基礎(chǔ)上能改善肉制品的風味。此外，抑制PhIP形成的方法還有外源性添加劑，例如香辛料、植物提取物和抗氧化劑等。研究表明，黑胡椒粉能夠降低魚肉制品中雜環(huán)胺的生成^[10]。余甘子提取物對模型反應體系中PhIP有良好的抑制效果，含量達到8.0 mg/mL時，抑制率可達83.1%^[11]。Rounds等^[12]將蘋果皮、洋蔥、辣椒和孜然等天然植物提取物加入到牛肉餅中，發(fā)現(xiàn)這些植物提取物都非常有效地抑制了PhIP的生成。

2002年，Zochling等^[13]發(fā)現(xiàn)苯乙醛作為中間體與苯丙氨酸、肌酐等前體物質(zhì)和PhIP共同存在于模擬體系和烤肉等肉制品中。經(jīng)Strecker降解反應后，苯丙氨酸分解產(chǎn)生苯乙醛，苯乙醛與肌酐經(jīng)羥醛縮合反應生成丁間醇醛，再經(jīng)一系列反應最后生成PhIP^[14]。

葛仙米（Nostoc sphaeroides）屬于藍藻門（Cyanophyta）、藍藻綱（Cyanophyceae）的擬球狀念珠藻，俗稱天仙米、天仙菜、水木耳等，學名為球狀念珠藻（Nostoc sphaeroides Kützing），是我國一種傳統(tǒng)且珍貴的藥食兩用藍藻^[15-16]。葛仙米性寒，具有清熱、益氣、明目等功效，主治夜盲癥、脫肛；外用可治燒燙傷^[17]。葛仙米營養(yǎng)成分豐富，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、脂肪酸、多種維生素、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)^[18-19]，其中多糖有一定的生物活性，添加植物多糖可以改變?nèi)忸惖钠焚|(zhì)特性，并抑制雜環(huán)胺的生成^[20]。研究表明葛仙米多糖主要為葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖，具有較強的抗補體活性，有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗高脂血癥和抗動脈粥樣硬化等作用^[21-24]。葛仙米口感脆嫩、味道清甜，將其開發(fā)成健康的特殊風味調(diào)味品，不僅利于豐富調(diào)味品的種類，而且為調(diào)味品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的思路。

本文參考于迪^[25]的研究，將苯丙氨酸與肌酐作為合成PhIP模型的反應前體物質(zhì)。將不同含量的葛仙米多糖提取物加入肌酐與苯丙氨酸構(gòu)成的模型體系中反應，利用液質(zhì)聯(lián)用儀監(jiān)測葛仙米多糖提取物含量對反應物、中間產(chǎn)物和生成物雜環(huán)胺PhIP的影響，為后期推測PhIP的反應抑制機理研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛仙米：中南林業(yè)科技大學合作實驗室；甲醇（質(zhì)譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；肌酐、L-苯丙氨酸（均為分析純，99%）：阿拉丁生化科技有限公司；PhIP標準品（分析純，98%）、苯乙醛（分析純，95%）、甲酸（質(zhì)譜純，≥99%）、鄰苯二胺（分析純，98%）：麥克林生化科技有限公司；乙醇（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204分析天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋鞏義市予華儀器有限責任公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海煜南儀器有限公司；TG16WS臺式高速離心機 湖南邁達儀器有限公司；BPMJ-250F霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；Agilent 1290 Infinity Ⅱ-6470超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技（中國）有限公司；不銹鋼反應釜、聚四氟乙烯反應管廣西中醫(yī)藥大學食品質(zhì)量與安全實驗室自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 葛仙米多糖的提取、分離與純化

稱取20 g葛仙米干粉于燒杯中，加入600 mL水，放入90 ℃恒溫水浴鍋中加熱3 h，將提取液高速離心15 min。按以上步驟，反復提取2次，取上清液并混合。在上清液中添加3倍體積的95%乙醇后，高速離心15 min。取下層沉淀用水溶解后，使用截留分子量為3 500 Da的透析袋進行透析。將多糖溶液減壓濃縮后冷凍干燥，即得到葛仙米多糖提取物，得率為16.6%。

1.3.2 模型體系的制備

空白組PhIP模型體系的制備：分別精密稱取0.6 mmol苯丙氨酸和0.6 mmol肌酐于燒杯中，加入去離子水10 mL，超聲使其充分溶解后，倒入聚四氟乙烯反應管中，將反應管裝入特制反應釜中，充分密封后在180 ℃下反應。3 h后取出并立即冰水浴降溫，用可調(diào)式混勻儀進行充分搖勻，獲得空白模型反應液。取1 mL反應液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm的微孔濾膜進行過濾，得到的溶液在低溫下進行貯存。

對照組PhIP-葛仙米多糖提取物模型體系的制備：分別精密稱取4份0.6 mmol苯丙氨酸和0.6 mmol肌酐，分別加入30，50，100，150 g葛仙米多糖提取物，加入10 mL去離子水，置于聚四氟乙烯反應管中，再將反應管裝入不銹鋼反應釜中，充分密封，在180 ℃下反應3 h。取出并冰水浴降溫后，用可調(diào)式混勻儀進行充分搖勻，獲得模型反應液。取1 mL反應液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm 的微孔濾膜進行過濾，得到的溶液在低溫下進行貯存。

1.3.3 苯乙醛衍生反應液的制備

準確稱取1 mg鄰苯二胺，加入1 mL PBS緩沖溶液，制成濃度為1 mg/mL的鄰苯二胺溶液。取1 mL鄰苯二胺溶液，加入1 mL苯乙醛，放置在25 ℃培養(yǎng)箱中衍生12 h，使其生成苯并咪唑（2-PB）。取1 mL該溶液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm的微孔濾膜進行過濾，得到的溶液在低溫下進行貯存。

取1 mL模型體系反應液，加入1 mg/mL鄰苯二胺1 mL，混勻后放置在25 ℃培養(yǎng)箱中衍生12 h，生成苯并咪唑（2-PB）。取1 mL反應液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm注射器式過濾器過濾，將所得溶液置于低溫下保存。

1.3.4 色譜條件

Welch Ultimate UHPLC AQ-C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；進樣量3μL；柱溫（25±5.0） ℃；流速0.25 mL/min；流動相A為甲醇，流動相 B為0.1%甲酸-水；梯度洗脫：0～1 min 5% A，1～3 min 5%～30% A，3～9 min 30%～100% A，9～10 min 100% A，10～13 min 100%～5% A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：10～500 amu；離子源溫度300 ℃；噴霧電壓500 V；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓3 500 V。

2 結(jié)果與分析

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），以模型體系中的前體物質(zhì)苯丙氨酸和肌酐、中間產(chǎn)物苯乙醛及產(chǎn)物 PhIP為研究對象，進行定性與定量分析。

2.1 模型體系中成分定性分析

由圖1可知，苯丙氨酸標準品的保留時間為3.8 min，模型體系中在保留時間為3.8 min時出現(xiàn)一個單峰（見圖2）。以10 eV的碰撞能將模型體系中該峰對應的物質(zhì)擊碎，由圖3可知，在正離子模式下母離子m/z=166與二級碎片離子m/z=120，103，可定性該物質(zhì)為苯丙氨酸。

由圖4可知，肌酐標準品的保留時間為1.2 min，模型體系中在保留時間為1.2 min時出現(xiàn)一個單峰。以20 eV碰撞能將模型體系中該峰對應的物質(zhì)擊碎，由圖5可知，在正離子模式下母離子m/z=114與二級碎片離子m/z=86，72，可定性該物質(zhì)為肌酐。

由圖6可知，PhIP標準品的保留時間為5.8 min，模型體系中在保留時間為5.8 min時出現(xiàn)一個單峰（見圖7）。以40 eV碰撞能將模型體系中該峰對應的物質(zhì)擊碎，由圖8可知，在正離子模式下母離子m/z=225與二級碎片離子m/z=210，183，與文獻[20]的結(jié)果一致，可定性該物質(zhì)為PhIP。

首先測定苯乙醛與鄰苯二胺溶液生成的2-PB，確定反應體系中衍生后該物質(zhì)的保留時間。由圖9可知，2-PB的保留時間為5.7 min，在多反應監(jiān)測模式下發(fā)現(xiàn)模型體系中在保留時間為5.7 min時出現(xiàn)一個單峰。以30 eV碰撞能將模型體系中該峰對應的物質(zhì)擊碎，由圖10可知，在正離子模式下母離子m/z=209與二級碎片離子m/z=131，91，與文獻[20]的結(jié)果一致，可定性該物質(zhì)為2-PB。

2.2 模型體系中成分定量分析

通過苯丙氨酸-肌酐-葛仙米多糖提取物模型反應體系發(fā)現(xiàn)，反應模型中的前體物質(zhì)都隨著葛仙米多糖提取物添加量的增加先減少后增多，添加量達100μg后都緩慢減少但是都比空白模型含量高。由圖11可知，苯丙氨酸含量先緩慢減少，當葛仙米多糖提取物添加量達到50μg時，苯丙氨酸含量達最低后急劇增多，100μg時苯丙氨酸含量最高，且超過未添加葛仙米多糖提取物的空白模型中苯丙氨酸的含量，此后苯丙氨酸含量緩慢減少。由圖12可知，肌酐與苯丙氨酸含量變化趨勢接近，其含量先緩慢減少，當葛仙米多糖提取物添加量達到50μg時，肌酐含量達最低后急劇增多，100μg時肌酐含量最高，且超過未添加葛仙米多糖提取物的空白模型中肌酐的含量，此后肌酐含量緩慢減少。

對反應模型中生成物PhIP含量進行分析，由圖13和圖14可知，將葛仙米多糖提取物加入模型體系中反應，雜環(huán)胺PhIP的生成量明顯減少，當葛仙米多糖提取物添加量為50μg時PhIP含量最低，此后PhIP含量略微上升且趨于平緩。當葛仙米多糖提取物添加量分別為30，50，100，150μg時，其抑制率分別為48.8%、84.9%、83.1%、82.1%，可見葛仙米多糖提取物添加量為50μg時，葛仙米多糖提取物對雜環(huán)胺PhIP的抑制效果最好，其抑制率可達到84.9%。

為了進一步推測葛仙米多糖提取物與反應物之間的關(guān)系，觀察模型體系中經(jīng)過衍生后苯乙醛含量的變化情況，據(jù)此來推測葛仙米多糖提取物對苯乙醛的影響。由圖15可知，隨著葛仙米多糖提取物的增加，2-PB含量在該范圍內(nèi)呈先下降后上升的趨勢，但均低于未加入葛仙米多糖提取物的模型，當葛仙米多糖提取物添加量為100μg時2-PB含量最低，此后2-PB含量緩慢增加。

綜上所述，模型體系中雜環(huán)胺PhIP的生成量隨著葛仙米多糖提取物的增加而逐漸減少，當葛仙米多糖提取物添加量為50μg時對PhIP的抑制效果最好，其抑制率達到84.9%，表明葛仙米多糖提取物對PhIP具有良好的抑制效果。葛仙米多糖提取物添加量大于50μg時，PhIP含量存在輕微升高的現(xiàn)象，而前體物質(zhì)肌酐和苯丙氨酸的含量卻大幅升高，且明顯大于空白模型中的含量，造成這種現(xiàn)象可能是因為葛仙米多糖提取物中多糖成分復雜，在高溫環(huán)境下葛仙米多糖提取物含量足夠多時，導致葛仙米多糖提取物的自身反應劇烈，且在反應體系中占據(jù)主導地位，分解產(chǎn)物可能少量參與了生成雜環(huán)胺PhIP的反應，使得PhIP含量略微增加但仍遠低于空白模型中的含量，同時也抑制了苯丙氨酸生成苯乙醛的反應，進而阻礙了前體物質(zhì)肌酐與苯乙醛的反應，造成了兩種前體物質(zhì)含量的升高。而當葛仙米多糖提取物添加量為100μg時，體系中反應前體物質(zhì)苯丙氨酸和肌酐的含量均達到最大，且中間產(chǎn)物苯乙醛含量達最低值，可能是因為葛仙米多糖提取物在此時抑制苯丙氨酸分解成苯乙醛的效率達最高值，故苯丙氨酸含量較空白模型中的含量更高，且苯乙醛含量最低。葛仙米多糖提取物添加量大于100μg時，推測葛仙米多糖提取物分解產(chǎn)物與苯乙醛競爭性參與生成雜環(huán)胺PhIP，導致苯乙醛含量有小幅上升但仍低于空白模型中的含量。

3 結(jié)論

綜合實驗數(shù)據(jù)分析，葛仙米多糖提取物對苯丙氨酸-肌酐模型體系中PhIP的生成具有一定的抑制效果，抑制途徑可能是通過抑制苯丙氨酸降解使體系中的苯乙醛含量降低，使得參與雜環(huán)胺PhIP合成的反應物含量降低，最終導致PhIP的生成量減少。但由于葛仙米多糖提取物結(jié)構(gòu)較復雜，目前還未推斷出葛仙米多糖提取物中干預苯丙氨酸降解的具體活性成分，且由于多糖分解還會帶來較小促進作用，后期還需對葛仙米多糖提取物添加量做更詳細精確的研究。本文通過葛仙米多糖提取物抑制PhIP的化學機理研究，能夠為多糖類物質(zhì)在高蛋白食品加工中抑制PhIP形成的相關(guān)研究提供理論支撐，有利于進一步開發(fā)具有葛仙米特殊風味的功能性調(diào)味品，可為葛仙米等具有中國特色的傳統(tǒng)食品提供新的利用途徑，為調(diào)味品產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新的思路。

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