邵天人,吳善博,張雅芳,謝靜靜,趙利杰,孫露露,邊嘯坤,王榮軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是僅次于輪狀病毒感染引起2歲以下兒童腹瀉和死亡的第二大病因,對(duì)免疫抑制病人也具有很大的威脅,是艾滋病檢測指標(biāo)之一[1]。動(dòng)物普遍感染隱孢子蟲,可導(dǎo)致幼齡動(dòng)物嚴(yán)重腹瀉和死亡,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展[2]。隱孢子蟲屬內(nèi)具有廣泛遺傳多態(tài)性,已鑒定出47個(gè)有效種及70多個(gè)隱孢子蟲基因型,其中微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)是最為重要的人獸共患蟲種[3-4]。目前,治療隱孢子蟲病尚未有特效藥物或疫苗,只有硝唑尼特被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用,但僅能緩解中度感染的兒童和免疫正常人群的癥狀,對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)感染者無效[5]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在大量非蛋白質(zhì)編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,即所謂的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)。這些非編碼RNA種類繁多,根據(jù)表達(dá)和功能可分為2類,即管家非編碼RNA和調(diào)控性非編碼RNA。管家非編碼RNA是細(xì)胞生存所必需的,含量較為恒定,呈組成型表達(dá),也稱為組成型非編碼RNA[6]。調(diào)控性非編碼RNA主要可分為3類,即內(nèi)源性的微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA),其表達(dá)具有明顯的時(shí)空特異性,通常呈短暫表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程起調(diào)節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn),宿主上皮細(xì)胞ncRNA在防御隱孢子蟲感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,包括抗菌肽的產(chǎn)生、細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)、上皮細(xì)胞源外泌體的釋放、免疫同型趨化酶的反饋調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等[8]。本文綜述了宿主上皮細(xì)胞miRNA、lncRNA和circRNA在防御隱孢子蟲感染過程中的作用機(jī)制。

1 miRNAs

miRNA是一類長度約20～23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,可與靶標(biāo)mRNA結(jié)合并使mRNA降解或阻礙其翻譯,從而抑制靶基因的表達(dá)[9]。芯片分析及RNA-sequencing分析顯示,C.parvum感染誘導(dǎo)上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變,且miRNA在對(duì)抗C.parvum感染的先天免疫防御過程中發(fā)揮重要功能[10]。

1.1 Let-7i

研究表明,let-7家族成員let-7i在抗隱孢子蟲感染過程中通過各種調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行精密調(diào)控。例如,C.parvum感染以MyD88/NF-κB依賴的方式降低宿主細(xì)胞let-7i表達(dá),這一過程參與了C.parvum感染誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)表達(dá)上調(diào)以促進(jìn)TRL4介導(dǎo)的抗C.parvum的防御反應(yīng)[11]。O'Hara S P等[12]利用培養(yǎng)的膽管上皮細(xì)胞(H69),發(fā)現(xiàn)C.parvum感染在降低let-7i表達(dá)和啟動(dòng)子活性的同時(shí)促進(jìn)調(diào)控序列中NF-κB 亞單位p50-C/ ebp β沉默子復(fù)合體的形成,從而阻遏復(fù)合體結(jié)合到let-7i啟動(dòng)子并促進(jìn)組蛋白h3去乙?；４送?let-7i下調(diào)可緩解miRNA介導(dǎo)的NAD 依賴性去乙?；竤irtuin-1(SIRT1)翻譯抑制以調(diào)節(jié)NF-κB的活化[13]。這些均提示let-7i表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在上皮細(xì)胞抵御隱孢子蟲感染的先天性免疫反應(yīng)中的新作用。

1.2 miRNA-98

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Src同源蛋白2(CIS)是新興的胞內(nèi)蛋白家族,已成為各類細(xì)胞中細(xì)胞因子反應(yīng)的關(guān)鍵生理調(diào)節(jié)因子[14]。Hu G等[15]在C.parvum感染的H69細(xì)胞中檢測到miR-98表達(dá)下調(diào)并賦予H69細(xì)胞CIS表達(dá),并通過CIS過表達(dá)和siRNA干擾試驗(yàn)證明CIS可增強(qiáng)人NF-κB抑制蛋白α(IκBα)降解,促進(jìn)C.parvum感染后H69細(xì)胞中NF-κB的活化。由此表明,miRNA 對(duì)CIS表達(dá)的調(diào)節(jié)可能在上皮細(xì)胞對(duì)微生物挑戰(zhàn)反應(yīng)的TLR/NF-κB信號(hào)的反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

1.3 miRNA-513

炎癥刺激下H69細(xì)胞可表達(dá)幾種B7共刺激分子,其中B7-H1是一種新發(fā)現(xiàn)的B7成員,在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[16]。Gong A Y等研究表明,miR-513參與促炎細(xì)胞因子IFN-γ誘導(dǎo)的膽管細(xì)胞中B7-H1表達(dá);在C.parvum感染的H69細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-513表達(dá)下調(diào)并緩解miRNA介導(dǎo)的B7-H1翻譯抑制,且B7-H1的表達(dá)參與了膽管細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互作用[17]。因此,miR-513在膽管細(xì)胞中對(duì)C.parvum誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能與C.parvum感染相關(guān)的膽汁免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。

1.4 miRNA-27b

一氧化氮(NO)曾被證明在上皮細(xì)胞對(duì)C.parvum的防御過程中發(fā)揮作用[18]。研究表明,C.parvum感染后以NF-κB依賴的方式誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生NO,并參與miRNA介導(dǎo)的誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)mRNA的穩(wěn)定[19]。具體而言,C.parvum感染可引起宿主上皮細(xì)胞iNOS mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng),從而促進(jìn)感染細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。有趣的是,iNOS mRNA穩(wěn)定的潛在機(jī)制與KH型剪接調(diào)節(jié)蛋白(KSRP)的抑制有關(guān),且miR-27b可靶向KSRP 3'UTR導(dǎo)致翻譯抑制使C.parvum感染負(fù)荷降低。由此表明,miR-27b通過靶向KSRP調(diào)節(jié)C.parvum感染后iNOS mRNA穩(wěn)定性可能與一般上皮細(xì)胞抗微生物防御的調(diào)節(jié)有關(guān)。

1.5 miR-424-503

miR-424和miR-503是由X染色體上miR-424-503基因位點(diǎn)編碼的成熟形式[20]。組蛋白去乙?；?HDAC)具有免疫調(diào)節(jié)活性,在宿主抗微生物防御過程中發(fā)揮重要作用[21]。趨化因子CX3CL1(也稱為fractalkine)是CX3C家族的獨(dú)特成員,它僅與其受體 CX3CR1結(jié)合,并且是其受體的獨(dú)特配體。Zhou R等[22]的研究揭示了HDACs和NF-κB信號(hào)在C.parvum感染后上皮細(xì)胞趨化因子CX3CL1在表達(dá)調(diào)控中的新作用,即HDACs和NF-κB信號(hào)通過抑制miR-424-503基因調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞表達(dá)CX3CL1的表達(dá),以促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞對(duì)C.parvum感染的防御。

1.6 miR-942-5p

研究表明,miR-942-5p的差異表達(dá)參與調(diào)節(jié)C.parvum感染后宿主上皮細(xì)胞免疫應(yīng)答,且C.parvum依賴TLR2/TLR4-NF-κB信號(hào)通路上調(diào)人結(jié)直腸腺癌(HCT-8)細(xì)胞中miR-942-5p的表達(dá)[10,23]。為探索miR-942-5p在C.parvum誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)介導(dǎo)的HCT-8細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用,Xie F等[24]在C.parvum感染早期檢測到miR-942-5p表達(dá)上調(diào)且緩解了miRNA介導(dǎo)的IFI27翻譯抑制,而IFI27下調(diào)通過TRAIL依賴途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡從而影響C.parvum感染負(fù)荷。該研究結(jié)果揭示了一種新的miRNA在宿主體內(nèi)抗C.parvum感染的上皮細(xì)胞防御反應(yīng)機(jī)制。

1.7 miR-181d

微陣列分析結(jié)果顯示,miR-181d在C.parvum感染的HCT-8細(xì)胞中差異表達(dá)[10]。Feng R等[25]在C.parvum感染早期HCT-8細(xì)胞中檢測到miR-181d表達(dá)顯著下調(diào),而TLR2、TLR4、NF-κB和參與TLR/NF-κB信號(hào)通路的myD88顯著上調(diào)。為了更深入研究宿主miRNA在C.parvum感染固有免疫反應(yīng)中的作用,qPCR和Western blot證實(shí)C.parvum通過p50亞基依賴的TLR2/ TLR4-NF-κB信號(hào)通路下調(diào)HCT-8細(xì)胞中miR-181d的表達(dá)。

2 LncRNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄而來的副產(chǎn)物,主要以RNA的形式參與X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾以及轉(zhuǎn)錄激活和干擾等多種重要的調(diào)控過程[26]。研究發(fā)現(xiàn),一些lncRNA可在先天性免疫細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá),且很可能在先天防御的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。目前有關(guān)lncRNA在寄生蟲領(lǐng)域的作用機(jī)制研究較少,因此進(jìn)一步深入了解其相關(guān)作用機(jī)制十分重要。

2.1 LncRNA-NR_045064

鑒于lncRNA在腸上皮細(xì)胞抗微生物防御中的作用,Li等[28]對(duì)C.parvum感染后腸上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜進(jìn)行測序,其中由NF-κB信號(hào)控制的lncRNA NR_045064顯著上調(diào)。另外在功能上,誘導(dǎo)NR_045064表達(dá)可增強(qiáng)感染細(xì)胞中部分防御基因的轉(zhuǎn)錄并抑制C.parvum感染負(fù)荷,且表觀遺傳組蛋白修飾和p300/MLL相關(guān)染色質(zhì)重塑均參與該過程。因此,lncRNA可能代表了腸上皮細(xì)胞抗C.parvum感染防御機(jī)制的一種新型調(diào)節(jié)臂。

2.2 LncRNA-XR_001779380

全基因組轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果顯示,C.parvum感染的IEC4.1細(xì)胞中表現(xiàn)出lncRNA表達(dá)譜的顯著改變,其中IncRNA XR_001779380是上調(diào)差異最為顯著的基因之一[28]。IFN-γ是上皮細(xì)胞抗C.parvum防御的關(guān)鍵效應(yīng)分子[29]。PRDM1作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,可與活化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(signal transducer and activator of transcription,STAT1)的蛋白抑制劑相互作用,調(diào)節(jié)STAT1介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[30]。研究顯示,XR_001779380與PRDM1的相互作用減弱了IFN-γ誘導(dǎo)的STAT1/SWI/SNF相關(guān)染色質(zhì)重塑,從而抑制了IFN-γ介導(dǎo)的新生兒腸上皮細(xì)胞防御[31]。這些結(jié)果表明,XR_001779380是IFN-γ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和年齡相關(guān)的腸上皮細(xì)胞抗C.parvum防御的重要調(diào)節(jié)因子。

2.3 LncRNA-NR_033736

有研究揭示了隱孢子蟲感染腸上皮可引起強(qiáng)烈的Ⅰ型IFN反應(yīng)[32]。同時(shí),Li等[33]在C.parvum感染的腸上皮細(xì)胞中鑒定出lncRNA NR_033736可組裝成ISGF3復(fù)合物并抑制Ⅰ型IFN介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。有趣的是,NR_033736本身的上調(diào)是由Ⅰ型IFN信號(hào)觸發(fā)的,且NR_033736可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞抗隱孢子蟲防御。由此表明,上調(diào)NR_033736通過抑制Ⅰ型IFN控制的基因轉(zhuǎn)錄對(duì)Ⅰ型IFN信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),從而有助于上皮細(xì)胞對(duì)微生物感染的固有防御做出微調(diào)。

3 CircRNA

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種不含5′帽或3′polyA尾的共價(jià)閉環(huán)分子,不同于傳統(tǒng)線性RNA,它主要在細(xì)胞中充當(dāng)海綿體吸附miRNA,從而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用[34]。宿主circRNA的差異表達(dá)是由各種病原體感染所引起,包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等[35]。研究表明,隱孢子蟲感染可誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞中circRNA表達(dá)譜顯著變化,這一發(fā)現(xiàn)具有深遠(yuǎn)意義[36]。然而,卻很少有研究報(bào)道有關(guān)circRNA在隱孢子蟲感染中的調(diào)控機(jī)制。

微陣列分析結(jié)果顯示,C.parvum感染后HCT-8細(xì)胞中共178個(gè)circRNA差異表達(dá),其中hsa_circ_0001946_CBC1(ciRS-7,也稱為CDR1as)顯著上調(diào)近8倍[37]。RelA(也稱為p65)是NF-κB信號(hào)通路的一個(gè)亞基,可防止上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡從而有益于寄生蟲繁殖[38]。另一研究顯示,miR-1270是ciRS-7高度匹配的miRNA并直接靶標(biāo)relA,且ciRS-7通過調(diào)節(jié)miR-1270/relA軸影響NF-κB通路以促進(jìn)C.parvum繁殖[39]。這些研究均為實(shí)施針對(duì)隱孢子蟲感染的調(diào)控策略提供了新視角。

4 展望

ncRNA是生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最迅速的前沿領(lǐng)域之一,其中miRNA、lncRNA、circRNA被稱為“RNA三寶”,受到研究者們廣泛關(guān)注。近些年來,宿主上皮細(xì)胞ncRNA在防御隱孢子蟲感染的先天免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制不斷被報(bào)道,但多數(shù)研究集中于miRNA,有關(guān)lncRNA和circRNA的研究較少。隨著研究的不斷深入,終將闡明上皮細(xì)胞ncRNA調(diào)控隱孢子蟲感染的分子機(jī)制,揭開lncRNA、miRNA、circRNA、mRNA之間相互作用以及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的神秘面紗,為設(shè)計(jì)開發(fā)隱孢子蟲診斷試劑、抗隱孢子蟲病藥物和疫苗等提供新的理論基礎(chǔ)。