王蒙蒙,金 鑫

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林延吉 133002)

新城疫(Newcastle disease,ND)于1926年首次發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞,同年在英國新城發(fā)現(xiàn)病例[1]。該病是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染禽類動物的一種高度接觸性傳染病,以感染雞、火雞為主,也可感染人。其典型特征是病程短、常呈急性敗血癥經(jīng)過、發(fā)病率和病死率高,對呼吸道、消化道損傷明顯,有時伴隨神經(jīng)癥狀出現(xiàn)。ND的流行不僅對養(yǎng)雞業(yè)造成毀滅性打擊,也會對國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重的威脅[2]。1946年我國首次分離出ND毒株并證實(shí)此前ND就已經(jīng)在國內(nèi)流行[3]。在經(jīng)過國內(nèi)外科研人員不斷努力下,ND疫苗研發(fā)已經(jīng)取得了一些科研成果,本綜述將對ND商業(yè)化疫苗的研究進(jìn)展分別介紹,以期為商業(yè)化ND疫苗的研究提供參考。

表1 全球新城疫流行歷史

1 雞新城疫病毒分子流行病學(xué)

新城疫病毒(NDV)是一種有囊膜的非片段線性單股負(fù)鏈RNA病毒,屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)禽腮腺炎病毒1型(Avianorthoavulavirus1)。目前NDV基因組有3種長度的堿基數(shù),分別是15 186 nt、15 192 nt、15 198 nt[4],編碼6種類型的特異性結(jié)構(gòu)蛋白見圖1,2種非結(jié)構(gòu)蛋白分別是V蛋白與W蛋白,基因組結(jié)構(gòu)為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′[5]。依據(jù)雞胚(embryonated chicken eggs,ECEs)平均死亡時間和腦內(nèi)致病性指數(shù),NDV的致病性可以分為緩發(fā)型、中發(fā)型、速發(fā)型。根據(jù)基因組的大小以及對F基因序列的演變進(jìn)化分析,已知目前分離的NDV毒株分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩大類,其中基因型多達(dá)21種[6]。中國、韓國等亞洲國家流行的強(qiáng)毒株主要是ClassⅡ中的基因Ⅶ型,基因Ⅸ型為我國特有的毒株基因型,非洲主要流行基因Ⅱ型、Ⅵ型和Ⅶ型[7]。

圖1 新城疫病毒的分子結(jié)構(gòu)

NDV具有多嗜性,主要存在于組織器官中。NDV感染宿主細(xì)胞的過程大致如以下幾個步驟:吸附、膜融合或內(nèi)吞、轉(zhuǎn)錄翻譯、修飾釋放(圖2)。病毒的囊膜表面的HN蛋白具有生物活性,可與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體吸附識別[4,8-9]。NDV致病機(jī)制復(fù)雜,感染宿主細(xì)胞的同時也會引起其他疾病繼發(fā)感染,這種混合感染模式較為復(fù)雜,對疫苗的研究帶來了巨大挑戰(zhàn)。

圖2 NDV感染宿主細(xì)胞的機(jī)制

2 雞新城疫的臨床特征

雞在感染NDV后,由于毒株毒力、日齡等因素,在臨床上會呈現(xiàn)出發(fā)病速度、病死率等差別。典型的ND癥狀分為最急性型、急性型、亞急性或慢性型,其中最急性型常發(fā)生于流行早期,主要癥狀為突然性死亡,無明顯癥狀;急性型較為常見,主要癥狀為高溫、精神萎靡、雞冠發(fā)紺等,個別病雞會出現(xiàn)內(nèi)臟、呼吸道、消化道等方面的疾病特征;亞急性或慢性常見于流行后期,主要特征為產(chǎn)蛋下降、腹瀉等。非典型ND的臨床癥狀主要為病死率低;雛雞癥狀明顯,多數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)、呼吸道疾病以及產(chǎn)蛋量下降;癥狀不明顯,故很難做到及時醫(yī)治。ND的流行不受季節(jié)影響;傳播能力強(qiáng),傳播速度快;混合感染與非典型臨床癥狀等特點(diǎn)都會為疫情監(jiān)測、防控和清除工作帶來巨大挑戰(zhàn)。在嚴(yán)峻復(fù)雜的防控形勢下,除了制定嚴(yán)格的預(yù)防措施外還需要進(jìn)一步重視免疫疫苗的研制,接種ND疫苗仍是控制疫情流行的有效措施之一。近年來,隨著分子免疫學(xué)和疫苗學(xué)的發(fā)展,ND疫苗在給藥途徑、佐劑等方面取得一定的成果,我國的ND流行也得到了一定的控制,但免疫失敗的現(xiàn)象依然發(fā)生,因此研發(fā)安全有效的商業(yè)化疫苗至關(guān)重要。

3 商業(yè)化疫苗

3.1 滅活疫苗

目前對商業(yè)化ND疫苗已經(jīng)取得一定的進(jìn)展,ND載體疫苗、滅活疫苗以及減毒活疫苗是目前市場上應(yīng)用廣泛的ND疫苗。滅活疫苗(inactivated vaccine)通常是指為誘導(dǎo)高水平的體液免疫,將ECEs內(nèi)接種毒株的尿囊液利用福爾馬林或β異內(nèi)醇反復(fù)多次滅活,使其能夠保持免疫原性,再與佐劑結(jié)合而制成的疫苗[10]。ND滅活疫苗是目前應(yīng)用較為廣泛的一類疫苗,具有安全性高,免疫持續(xù)時間長,儲存方便等優(yōu)點(diǎn)。目前ND滅活疫苗的研究主要集中在Ⅰ系Mukteswar等中等毒株、Ⅳ系La Sota等弱毒株,基因Ⅶ型A-Ⅶ株,Queensland V4和Ulster 2C等毒株上(表2)。在我國,接種疫苗后,機(jī)體內(nèi)病毒脫落顯著減少是測試ND疫苗有效性的重要指標(biāo)。我國高校團(tuán)隊(duì)研發(fā)出基因Ⅶ型ND滅活疫苗(A-Ⅶ株),接種后21 d機(jī)體內(nèi)HI抗體效價標(biāo)準(zhǔn)提高顯著,保護(hù)率相較于普通ND疫苗株明顯提高,同時機(jī)體脫毒減少,免疫次數(shù)減少,免疫應(yīng)激減輕,有效解決了基因匹配問題同時生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益得到保證[11]。由韓國團(tuán)隊(duì)開發(fā)的滅活疫苗KBNP-C4152R2L株(基因型Ⅶ型)接種后,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)作用優(yōu)于La Sota株[12]。滅活毒株生產(chǎn)的疫苗需要在佐劑的配合下使用,因?yàn)樽魟┬纬傻馁A庫效應(yīng)可以延緩免疫原在機(jī)體內(nèi)的釋放速度,持續(xù)刺激機(jī)體,增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答,最終達(dá)到免疫效果[13-14]。近些年,應(yīng)用較為廣泛的佐劑主要是白油佐劑、蜂膠和鋁鹽佐劑等。白油佐劑是一種油包水型淡黃色乳液,在機(jī)體內(nèi)留存時間長,但會引起機(jī)體炎癥癥狀或表面潰瘍,其代謝速率慢,能夠?qū)﹄u肉品質(zhì)造成影響,此外為了減小這些不利影響,在原佐劑的基礎(chǔ)上配比2～10 mg/mL左旋咪唑,接種后的免疫效果會明顯提高[13,15]。常見的鋁鹽佐劑帶來的副作用嚴(yán)重,黏度大,機(jī)體不易吸收疫苗,故新型無鋁油性佐劑的研發(fā)更適合應(yīng)用于ND疫情防控。佐劑的應(yīng)用增加了滅活疫苗的生產(chǎn)成本,同時佐劑的選擇也會直接影響疫苗的免疫效力。

表2 新城疫的滅活疫苗

由于養(yǎng)雞場的集約化飼養(yǎng),流行毒株與常見的疫苗毒株之間基因型匹配程度低,抗原性差異顯著,接種疫苗后仍有大量病毒被釋放,增加了非典型ND流行的風(fēng)險,同時提高了繼發(fā)感染或混合感染的機(jī)率[16]。在通常情況下,ND與禽流感(Avian influenza,AI)、傳染性支氣管炎、禽腺病毒感染、傳染性法氏囊病、減蛋綜合征等中的一個或多個傳染病同時感染,不僅會降低養(yǎng)殖效益,還會對經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。研發(fā)“一針防多病”的多價苗或多聯(lián)苗可降低人工成本[17]。滅活疫苗需要在減毒活疫苗初次免疫后進(jìn)行應(yīng)用[18]。目前選擇適宜的滅活疫苗佐劑以及免疫調(diào)節(jié)劑是ND滅活疫苗下一步研發(fā)的重點(diǎn)。

3.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是指將無特定病原體(specific pathogen free,SPF)ECEs內(nèi)的尿囊液接種毒株進(jìn)行增殖培養(yǎng),再加入穩(wěn)定劑凍干制成的疫苗[10]。目前減毒活疫苗主要分為傳統(tǒng)減毒活疫苗和基因工程減毒活疫苗,其中傳統(tǒng)減毒活疫苗分為自然弱毒株和人工傳代弱毒株,ND減毒活疫苗株包括Ⅰ系、Ⅱ系、Ⅲ系、Ⅳ系及克隆株(表3)。其中Ⅰ系疫苗(主要為Mukteswar株)毒力較強(qiáng),且免疫期長,可導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降,蛋殼變軟,雛雞死亡等癥狀,理論上只能用于成年雞群的緊急接種或加強(qiáng)免疫,然而由于存在生物安全隱患問題,2017年Ⅰ系疫苗被包括我國的多個國家相繼禁用[19]。

表3 新城疫減毒活疫苗

減毒活疫苗需要冷鏈運(yùn)輸及處理,V4 株、I-2株和La Sota株等熱穩(wěn)定型疫苗在特定溫度下都具備最低滴度和最長保質(zhì)期[20]。此外,50%胚胎感染劑量(50% embryo infection dose,EID50)是評估減毒活疫苗的抗體滴度和效力的關(guān)鍵指標(biāo),保護(hù)效力與疫苗接種劑量密切相關(guān),106EID50是能夠完全保護(hù)機(jī)體和減少病毒脫落的最低劑量[10]。與滅活疫苗相似,減毒活疫苗La Sota株與流行毒株基因型Ⅶ型之間F和HN蛋白氨基酸同源性分別為89%和 87%左右,存在抗原差異性與遺傳變異性質(zhì)[21]。目前存在兩種可行性方案,第一種是通過反向遺傳學(xué)技術(shù)定點(diǎn)誘變基因Ⅶ型G7毒株內(nèi)的L蛋白基因特異性突變,替換F切割位點(diǎn)序列,使強(qiáng)毒致弱,獲得的候選疫苗G7M誘導(dǎo)雞產(chǎn)生同源抗體抵御基因Ⅶ型強(qiáng)毒攻擊,保護(hù)率可達(dá)100%[22]。第二種方案是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)增加HN蛋白長度,在F切割位點(diǎn)序列定點(diǎn)突變并修飾來減弱毒力,插入特殊密碼子保證其遺傳穩(wěn)定性,最終獲得的疫苗株可以完全保護(hù)雞體免受相應(yīng)強(qiáng)毒株的攻擊[23]。

3.3 載體疫苗

載體疫苗是指利用基因工程技術(shù)將目的基因重組到特定載體病毒的基因組上,從而獲得能夠表達(dá)出外源基因的重組活載體病毒疫苗。載體疫苗相較于滅活疫苗、減毒活疫苗而言優(yōu)勢在于能夠表達(dá)多個目的基因,同時預(yù)防多個疾病,能以半復(fù)制的形式遞呈給宿主,同時誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫以及黏膜免疫,提供的保護(hù)作用時間長,安全性高,穩(wěn)定性顯著[10]。通過選用雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)、火雞皰疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)、新城疫病毒(NDV)等載體表達(dá)F基因、HN基因等保護(hù)性目的基因構(gòu)建ND活載體疫苗,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[19]。

FPV是目前已知的最大的動物病毒,基因容量大,利于操作,能高效表達(dá)出多種外源基因,并且具有較高的安全性,已經(jīng)廣泛用于各類表達(dá)載體。在FPV載體中分別插入NDV-F基因和雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)gB基因來表達(dá)rFPV-gB-F重組抗原,免疫28日齡 SPF雞30 d后,分別用NDV強(qiáng)毒株和ILTV強(qiáng)毒攻擊,保護(hù)率均達(dá)到80%以上,對NDV免疫保護(hù)期為2個月,對ILTV免疫保護(hù)期為5個月[24]。一般情況下,以FPV為載體的ND重組活載體疫苗接種方式是以皮下接種和刺種為主,FPV載體疫苗對肉雞體重有輕微影響,這就意味著此類疫苗的接種范圍會受到限制。

作為一種在全球廣泛應(yīng)用的新興載體,HVT也是一種較為理想的載體,能包含多種保護(hù)性基因,以期同時預(yù)防多種疾病,rHVT-ND載體疫苗可大規(guī)模接種,受母源抗體影響較小,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫,并產(chǎn)生終身免疫的雙重保護(hù)作用。研發(fā)的Vectormune?ND是一種高效的抗異型基因型Ⅶ.1.1速發(fā)型毒株的疫苗,是利用HVT載體表達(dá)基因型Ⅰ型NDV-F蛋白,構(gòu)建出的重組載體活疫苗,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抵御基因型Ⅶ.1.1速發(fā)型毒株攻擊的完全臨床保護(hù)作用,肌肉注射或滴鼻免疫兩種攻毒途徑達(dá)到相似效果,但肌肉注射與滴鼻免疫相比,前者更顯著減少病毒脫落[25]。rHVT-ND載體疫苗與傳統(tǒng)疫苗聯(lián)合應(yīng)用經(jīng)滴眼免疫途徑接種SPF雛雞,結(jié)果顯示對基因型Ⅶ型毒株的具有100%的保護(hù)作用,幾乎可以提供完全臨床保護(hù),且毒株通過口鼻和泄殖腔途徑的脫落顯著減少[26]。但rHVT-ND載體疫苗需要在冷鏈或液氮中儲存,并要求在解凍后1 h內(nèi)施用,另外需要連續(xù)接種免疫至少28 d才能夠使機(jī)體達(dá)到完全免疫的效果[12]。

NDV自身就是一種很有前景的載體。NDV復(fù)制過程是在胞漿中完成,與宿主細(xì)胞發(fā)生基因交換與重組的概率低,安全性高,穩(wěn)定性好;病毒基因組大,易于嵌入外源基因片段,操作方便高效;NDV更易于在ECEs以及體內(nèi)的呼吸道和消化道內(nèi)增殖,且表現(xiàn)出病毒滴度高特征,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫,適用于大規(guī)模生產(chǎn)和接種。目前已有以NDV為載體的AI重組活載體疫苗進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn),對國內(nèi)高致病性AI疫情防控起到推動作用。在NDV載體中插入人工標(biāo)記目的基因,將構(gòu)建出的活載體疫苗接種雞群,可以用來鑒別ND毒株自然感染和疫苗免疫接種的雞群[27]。但NDV載體疫苗在體內(nèi)的實(shí)際效力受母源抗體的影響,這也是阻礙其發(fā)展的障礙,也是未來需要克服的一大難題。

4 納米疫苗

納米疫苗(Nano-vaccine)是指以納米顆粒材料為載體,將抗原或免疫調(diào)節(jié)劑呈遞給特定的靶細(xì)胞,通過靶向傳送或者利用自身免疫刺激特性來達(dá)到誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的目的。作為未來疫苗研究中的一顆冉冉升起的新星,高效穩(wěn)定、安全精準(zhǔn)的納米疫苗被廣泛應(yīng)用研究。

目前納米顆粒載體主要分為病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)、自組裝蛋白納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒4類[28]。Pushko P等[29]制備了AI病毒H5N1、H7N3和H9N2這3種亞型血凝素蛋白的VLPs,并利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了H5/H7/H9/N1/gag VLPs蛋白,在高致病性AI的攻毒試驗(yàn)中,與空白對照組相比,試驗(yàn)組全部存活;在低毒攻擊下,也檢測到機(jī)體所產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答,表明了以VLPs為載體的納米疫苗有望成為AI疫苗的一種前景。Dwivedi V等[30]研制了可降解的聚合酶納米顆粒PLGA,將其包裹豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗對豬群進(jìn)行滴鼻免疫,試驗(yàn)結(jié)果顯示:試驗(yàn)組豬群內(nèi)的肺勻漿和血清中IFN-γ、CD3+CD8+、CD4+CD8+等水平均高于對照組,表明了以聚合物納米顆粒為載體的納米疫苗為豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研發(fā)提供了新的方向。

ND納米疫苗的研究目前較少,臨床毒理數(shù)據(jù)還尚不清楚,走向商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的道路任重而道遠(yuǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,具有高水平免疫原性的納米材料也漸漸被發(fā)現(xiàn)、合成,制備流程也愈加完善成熟,對ND納米疫苗的研究逐漸深入,有望為ND的防控起到重要作用。

5 總結(jié)與展望

5.1 目前雞新城疫疫苗商業(yè)化面對的技術(shù)難題

面對ND流行,我國憑借嚴(yán)格的防控對策和科學(xué)的疫苗免疫,使得該流行病得到了良好的控制,但對于一些發(fā)展中國家,由于缺乏冷鏈設(shè)備以及嚴(yán)格的生物安全措施,導(dǎo)致非典型ND持續(xù)傳播以及毒株在雞群間持續(xù)復(fù)制感染[10-11]。ND疫苗商業(yè)化主要面臨五大技術(shù)難題。(1)受ND的影響,機(jī)體免疫力下降,存在交叉感染的風(fēng)險。(2)減毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)等安全隱患且在偏遠(yuǎn)貧困地區(qū)缺少冷鏈運(yùn)輸設(shè)備,疫苗質(zhì)量會大打折扣,容易出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象。(3)ND疫苗效價受母源抗體影響,只有當(dāng)母源抗體水平≥4 log2時再進(jìn)行ND疫苗的首次免疫,可確保免疫效力。(4)NDV為負(fù)鏈RNA病毒,基因重組變異概率高,易出現(xiàn)新的基因型,目前在多數(shù)ND流行的國家,流行株與疫苗株之間主要保護(hù)性抗原的同源性低,易造成疫苗株誘導(dǎo)感染變異株的機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平低。(5)研制以及儲存疫苗設(shè)備所需成本太高,會阻礙安全有效的商業(yè)化疫苗的研發(fā)。

5.2 ND疫苗未來的研究方向

目前已有多種商業(yè)化ND疫苗投入生產(chǎn)使用,正處于試驗(yàn)階段的疫苗也取得了一定的研究成果,例如亞單位疫苗、病毒顆粒樣疫苗、核酸疫苗等基因工程疫苗以及多價苗、多聯(lián)苗等。理論上,基因工程疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗來說具有安全性高、免疫原性強(qiáng)、穩(wěn)定性顯著等優(yōu)勢,也是研發(fā)有效商業(yè)化ND候選疫苗的最有希望的方向。通過基因工程技術(shù)對目的毒株內(nèi)的毒力基因和免疫抑制基因?qū)嵤┚_刪除和定點(diǎn)修飾,以期獲得基因型匹配的安全有效的疫苗。構(gòu)建反向載體技術(shù)為減毒活疫苗、病毒載體活疫苗等基因工程疫苗的研發(fā)突破搭建了一個有前景的平臺,為研發(fā)不同疾病、不同基因型的多價苗、多聯(lián)苗開辟了新途徑,有望達(dá)到降低成本、提高安全性、免疫效力高的目標(biāo)。除此以外,新型納米疫苗技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展,高效、低毒、安全的特性使其進(jìn)入了大眾視野,也為ND疫苗的研發(fā)帶來了更多的可能,是人們向著徹底消滅ND的美好愿景更進(jìn)一步。