高 靜,周 峰 ,彭 程*,胥元鵬,王子堅(jiān),聶龍祁,張建春,熱孜婉,南金魚(yú),陳學(xué)生,王新強(qiáng)

(1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.阿克塞縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心,甘肅阿克塞 736400;3.酒泉市畜牧獸醫(yī)總站,甘肅酒泉 735000)

甘肅省阿克塞縣為駱駝養(yǎng)殖區(qū),因放牧中與布魯氏菌病牛、羊及其污染物接觸導(dǎo)致部分駱駝感染布病。疫苗免疫是控制布魯氏菌在駱駝之間傳播的有效方法[1]。研究表明,用流產(chǎn)布魯氏菌株S19(150)和羊布魯氏菌Ⅰ型接種單峰駱駝,幼齡(3個(gè)月)單峰駱駝接受全劑量疫苗,成年單峰駝(10歲)減少劑量。接種疫苗2到4周后,2組都產(chǎn)生了滴度在1∶25到1∶200之間的布魯氏菌抗體[2]。用于奶牛防控最有效的疫苗就是S19[3]。S19疫苗對(duì)人有致病力[4],不適用于懷孕動(dòng)物和種公畜,免疫后抗體可持續(xù)10～11個(gè)月,干擾正常血清學(xué)檢測(cè)[5]。我國(guó)目前使用的A19疫苗就是從俄羅斯引入的S19[6],并且是早期使用的S19[7]。為了有效預(yù)防駱駝布病流行與發(fā)生,論文選用布魯氏菌活疫苗(A19株)開(kāi)展駱駝的免疫試驗(yàn),試驗(yàn)的劑量參照牛的免疫劑量用于駱駝免疫試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 阿克塞縣紅柳灣鎮(zhèn)大壩圖村2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)1～3歲駱駝40頭,3～12月齡駱駝20頭,無(wú)布魯氏菌感染史,免疫前間隔2周連續(xù)采血,經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)陰性。

1.1.2 主要試劑 布魯氏菌A19疫苗(批號(hào)2020009)、疫苗稀釋液(批號(hào)2020047),天康生物股份有限公司產(chǎn)品;虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)010012011)、試管凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)010042003)、陽(yáng)性血清(批號(hào)010061901)、陰性血清(批號(hào)010051904),青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱,德國(guó)3M公司產(chǎn)品;生物安全柜,Heal force公司產(chǎn)品;高速離心機(jī),德國(guó)Hevaeus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 疫苗使用

(1)用法與用量:皮下注射。標(biāo)準(zhǔn)劑量每頭份含活菌數(shù)至少6.0×1010CFU(標(biāo)準(zhǔn)劑量)、減低劑量為1.0×109CFU(標(biāo)準(zhǔn)劑量的1/60)。

(2)標(biāo)準(zhǔn)劑量稀釋:稀釋標(biāo)準(zhǔn)劑量時(shí)吸取疫苗稀釋液對(duì)干粉疫苗進(jìn)行對(duì)等稀釋,每毫升含一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量,蓋好瓶蓋。使用疫苗時(shí),要使其充分混勻。

(3)減低劑量稀釋:0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)劑量疫苗加入11.8 mL稀釋液即配成減低劑量(標(biāo)準(zhǔn)劑量的1/60)。

1.2.2 試驗(yàn)分組

(1)選取3月齡至3歲以內(nèi)健康駱駝12峰,分4組(表1)做疫苗免疫安全試驗(yàn),按照標(biāo)準(zhǔn)劑量和減低劑量分四組進(jìn)行頸部?jī)?nèi)側(cè)皮下注射免疫,詳細(xì)觀察并做好免疫前后有關(guān)信息的記錄,包括精神狀態(tài)、飲食欲、體溫、呼吸、脈搏等變化情況,以及免疫后是否出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)及其他異常情況等。

表1 布魯氏菌A19株活疫苗免疫安全試驗(yàn)分組

(2)根據(jù)不同年齡和疫苗免疫劑量分4個(gè)試驗(yàn)組(表2),開(kāi)展A19疫苗免疫試驗(yàn),在駱駝?lì)i部?jī)?nèi)側(cè)皮下注射免疫后23 d開(kāi)始分多次進(jìn)行免疫抗體效價(jià)測(cè)定。

表2 布魯氏菌活疫苗A19株免疫試驗(yàn)分組

1.2.3 免疫抗體效價(jià)檢測(cè) 在免疫前、免疫后的23 d(1～3歲組)/38 d(3～12月齡組)、90、180、270和360 d,頸靜脈采集3 mL血液樣品,分離血清,以備檢測(cè)。檢測(cè)方法為虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT) (GB/T 18646-2018)用于血清樣品初篩;試管凝集試驗(yàn)(SAT)(GB/T 18646-2018)用于陽(yáng)性樣本復(fù)核[8]。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗(yàn)

A19疫苗免疫后觀察并記錄駱駝發(fā)熱、呼吸、食欲等狀況,未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)及其他異常情況。

2.2 抗體檢測(cè)

2.2.1 1～3歲駱駝標(biāo)準(zhǔn)劑量 按照標(biāo)準(zhǔn)劑量注射免疫A19疫苗的1～3歲試驗(yàn)組,免疫后23 d,陽(yáng)性率100%,凝集率100%(凝集∶抗體滴度≥1∶50,以下同);免疫后90 d,陽(yáng)性率64.3%,凝集率78.6%;免疫后180 d,陽(yáng)性率9.1%,凝集率36.4%;免疫后270 d,陽(yáng)性率9.1%,凝集率18.2%;免疫后360 d,陽(yáng)性率為0,凝集率10%(表3)。

表3 1～3歲駱駝標(biāo)準(zhǔn)劑量免疫抗體消長(zhǎng)情況

2.2.2 1～3歲駱駝減低劑量 按照減低劑量注射免疫A19疫苗的1～3歲駱駝群,免疫后23 d,陽(yáng)性率94.12%,凝集率94.10%;免疫后90 d,陽(yáng)性率7.7%,凝集率15.4%;免疫后180 d,免疫抗體陽(yáng)性率和凝集率均為0(表4)。

表4 1～3歲駱駝減低劑量免疫抗體消長(zhǎng)情況

2.2.3 3～12月駱駝標(biāo)準(zhǔn)劑量 按照標(biāo)準(zhǔn)劑量注射免疫A19疫苗的3～12月齡駱駝群,免疫后38 d,陽(yáng)性率50%,凝集率100%;免疫后90 d,陽(yáng)性率為0,凝集率為33.3%;免疫后180 d,免疫抗體陽(yáng)性率和凝集率均為0(表5)。

表5 3～12月齡駱駝標(biāo)準(zhǔn)劑量抗體消長(zhǎng)情況

2.2.4 3～12月齡駱駝減低劑量 按照減低劑量注射免疫A19疫苗的3～12月齡駱駝群,免疫后38 d,陽(yáng)性率16.7%,凝集率達(dá)100%;免疫后90 d,陽(yáng)性率為0,凝集率16.7%;免疫后180 d,免疫抗體陽(yáng)性率和凝集率均為0(表6)。

表6 3～12月齡駱駝減低劑量免疫抗體消長(zhǎng)情況

3 討論

因布魯氏菌活疫苗(A19株)不能用于孕畜,本試驗(yàn)選擇2月齡到3歲之間駱駝進(jìn)行免疫試驗(yàn)(阿克塞雙峰駝4歲開(kāi)始配種),重點(diǎn)研究駱駝免疫布魯氏菌活疫苗A19株后安全性和抗體消長(zhǎng)規(guī)律,從而選擇出適宜的免疫方案,為駱駝布病免疫防疫提供技術(shù)支撐,為實(shí)現(xiàn)駱駝健康養(yǎng)殖和駱駝產(chǎn)業(yè)良好發(fā)展保駕護(hù)航。駱駝感染布魯氏菌在埃及、蘇丹等國(guó)家也有流行病學(xué)研究,但臨床反應(yīng)和抗體滴度效價(jià)明顯低于牛布魯氏菌病臨床反應(yīng)[9]。本次疫苗免疫駱駝短期內(nèi)能產(chǎn)生很高的抗體滴度(1∶3 200),且免疫后轉(zhuǎn)陽(yáng)率較高,證明駱駝對(duì)布魯氏菌活疫苗(A19株)相當(dāng)敏感。本試驗(yàn)表明,1～3歲組駱駝?dòng)脴?biāo)準(zhǔn)劑量(6×1010CFU /頭)皮下注射布魯氏菌活疫苗(A19株)免疫效果最好。此外,免疫效果受動(dòng)物年齡影響較大,對(duì)1歲以內(nèi)的幼齡駱駝免疫,轉(zhuǎn)陽(yáng)率很低。