問靜 韓達斌 汪永明 劉海青 劉學(xué)良

【摘 要】 目的：建立濕生扁蕾的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法對濕生扁蕾中有效成分熊果酸進行定性鑒別，采用HPLC法測定濕生扁蕾中有效成分木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮和芒果苷的含量。結(jié)果：在TLC色譜中，熊果酸色譜鑒別斑點清晰，且陰性對照無干擾；HPLC測定木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮和芒果苷四種成分線性關(guān)系良好（r≥0.9998），平均加樣回收率分別為99.85%、97.35%、97.06%、97.81%，RSD分別為0.72%、0.85%、0.79%、0.80%。結(jié)論：該文建立的質(zhì)量方法專屬性強，簡便可行、重現(xiàn)性好，可用于濕生扁蕾的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 濕生扁蕾；薄層色譜法；熊果酸；高效液相色譜法；木犀草素

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2024）09-0051-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409012

Quality Standard of Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma

WEN Jing HAN Dabin WANG Yongming LIU Haiqing LIU Xueliang*

Qinghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Xining 810007，China

Abstract：Objective To establish the method of quality control for Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma.Methods Ursolic acid in Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma were identified by TLC. Luteolin， swertianolin， l，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone and mangiferin in Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma were determined by HPLC. Results The spots in thin layer chromatography were clear， and the negative control had no interference. The 5 components luteolin， swertianolin， l，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone and mangiferin were well separated and showed good linear relationships （r≥0.9998）. The average recovery rates were 99.85%， 97.35%， 97.06% and 97.81%， and RSD were 0.72%， 0.85%， 0.79%and 0.80%， respectively. Conclusion The method is simple accurate and sensitive so it can be used for the quality control of Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma.

Keywords：Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma; Thin Layer Chromatography; Ursolic Acid;HPLC; Luteolin

濕生扁蕾［Gentianopsis paludosa （Mum.）Ma］，藏文名“加蒂那布”，為龍膽科植物濕生扁蕾的全草，產(chǎn)于西藏、青海、四川、云南等地，生長于海拔1180～4600 m的河灘、沼澤地、山坡草地及林緣，一年或兩年生草本，花盛期采集，全草入藥，文獻記載該藥材具有清溫?zé)?、利膽、止瀉的功效，現(xiàn)臨床主要用于黃疸型肝炎、肝膽病引起的發(fā)熱、感冒、小兒腹瀉等的治療［1-3］。目前濕生扁蕾收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥分冊（1995年版）［4］，僅有性狀、顯微鑒別、一般顯色理化鑒別，沒有薄層鑒別、含量測定等項目，現(xiàn)有可查的文獻中也只是單獨的測定濕生扁蕾中很少的1～4個成份［5-9］，難以有效為其質(zhì)量控制提供參考，本研究建立薄層色譜法鑒別熊果酸，高效液相色譜法對濕生扁蕾中有效成分木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮和芒果苷進行定量測定，可為濕生扁蕾的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waterse 2695型高效液相色譜儀；Waters 2998 PDA detector型二極管陣列檢測器 （美國沃特斯有限公司）；ME204梅特勒-托利多電子天平（感量0.1mg、

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；XS105DU型梅特勒-托利多超越系列專業(yè)型XS分析天平（感量0.01 mg、瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB25-12DT新芝超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q2355型超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試劑及樣品 木犀草素對照品（批號：111720-202111，純度94.4%），芒果苷（批號：111607-201704，純度：98.1%），熊果酸對照品（批號：110742-200517，純度99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；當(dāng)藥醇苷對照品（批號：19041505，純度98.0%）購自普菲德生物技術(shù)有限公司；1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮（純度96.0%）由中科院西北高原生物研究所孫洪發(fā)研究員提供［10］；實驗用甲醇（批號：11163207138，德國默克股份兩合公司）及磷酸（批號：Z0510032，上海安譜實驗科技股份有限公司）均為色譜純；水為超純水；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。18批實驗用濕生扁蕾藥材樣品信息詳見表1，經(jīng)青海省藥品審評核查中心劉海青主任藥師鑒定為濕生扁蕾的干燥全草，各批樣品經(jīng)粉碎后過三號篩密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別［5］

2.1.1 熊果酸薄層色譜鑒別 分別取樣品粉末1 g，至具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理（250 W，50 kHz）30 min，濾過，作為供試品溶液。取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶8∶3∶0.5）的溶液為展開劑，展開，取出，晾干。再噴以10％硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色的紫紅色斑點。如圖1。

2.2 含量測定［6-9］

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Waters SunFire ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），用甲醇（A）-0.05%磷酸（B）溶液為流動相進行梯度洗脫（見表2），流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長為254 nm；進樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含木犀草素對照品0.8487 mg、當(dāng)藥醇苷對照品 0.4159 mg、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對照品0.3750 mg、芒果苷對照品0.2411 mg的對照品儲備液。再精密吸取2.0 mL置10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液，其中木犀草素對照品濃度為0.1697 mg·mL-1、當(dāng)藥醇苷對照品濃度為0.0832 mg·mL-1、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮濃度為0.0750 mg·mL-1、芒果苷對照品濃度為0.0482 mg·mL-1。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取過50目號篩的濕生扁蕾藥材樣品約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.22 μm濾過，取續(xù)濾液作為HPLC測定供試品溶液。

2.2.4 專屬性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，采用外標(biāo)兩點法對峰面積和進樣濃度進行計算。在此條件下木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷與樣品中其它成分分離良好，陰性對照樣品無干擾，理論板數(shù)均不低于5000，與樣品中其他相鄰成分分離度均大于1.5。如圖2。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.2項下標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置25 mL量瓶中加甲醇稀釋成不同系列濃度的混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗要求進行分析，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，對照品進樣量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，4種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液，按2.2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，測得木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷的峰面積RSD （n=6） 分別為0.11% 、0.10%、0.11%、0.12%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取2.2.3項下同一供試品溶液（樣品編號：SSBL-12），按2.2.1項下的色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進行測定，記錄峰面積，測得木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷峰面積RSD（n=7）分別為0.45%、0.31%、0.33%、0.29%，結(jié)果表明供試品中木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取濕生扁蕾樣品（樣品編號：SSBL-12）6份，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件進行分析，得木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷的平均含量（n＝6）分別為1.3643%、0.4811%、0.4559%、0.4789%，其平均含量RSD（n＝6）分別為0.57%、0.42%、0.36%、0.36%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 稱濕生扁蕾樣品（SSBL-12）6份，每份0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中；每份中分別加入同濃度的混合對照品溶液（木犀草素1.3679 mg·mL-1、當(dāng)藥醇苷0.4816 mg·mL-1、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮0.4554 mg·mL-1、芒果苷0.4783 mg·mL-1）1.00 mL，按2.2.3項下的方法制成供試品溶液，并按2.2.1項下色譜條件進行分析，測定上述成分的含量，計算回收率。結(jié)果木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷平均回收率分別為99.85%、97.35%、 97.06%、97.81%，RSD為0.72%、0.85%、0.79%、0.80% （n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.10 樣品含量測定 取18批過50目號篩的濕生扁蕾藥材約0.2 g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，然后按2.2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖并計算各批濕生扁蕾中木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷的百分含量。詳見表4。

3 討論

3.1 薄層色譜展開劑的考察 濕生扁蕾在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥分冊》中僅有性狀、顯微鑒別、一般顯色理化鑒別，無薄層鑒別方法。目前尚無濕生扁蕾對照藥材供應(yīng)，故未做濕生扁蕾對照藥材的薄層色譜鑒別實驗，僅對濕生扁蕾中有效成分熊果酸進行薄層色譜鑒別實驗。本實驗對不同提取方法（冷浸、超聲、回流）進行了考察，對不同提取時間（20 min、30 min、40 min）進行了考察，對不同展開劑［三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（8∶2∶0.2∶0.2）、三氯甲烷-甲醇（40∶1）、三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶8∶3∶0.5）］進行了考察。經(jīng)方法學(xué)驗證，超聲30 min，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶8∶3∶0.5）溶液為展開劑，結(jié)果無陰性干擾，斑點清晰，分離良好，專屬性、重復(fù)性、耐用性均符合要求，可以用于濕生扁蕾藥材中熊果酸的鑒別。

3.2 色譜條件及樣品制備條件考察 本實驗分別對濕生扁蕾和各成分的對照品溶液進行了全波長掃描，經(jīng)過對不同波長下圖譜中色譜峰的數(shù)量、峰高及峰面積的比較，結(jié)果確定在254 nm 下測定可兼顧4個特征成份均有較強的吸收，供試品溶液色譜峰信息較豐富，基線較平穩(wěn)且相鄰成分分離較好；實驗中經(jīng)多次試驗分別考察了不同溶劑系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸 、乙腈-水-磷酸）及梯度洗脫流動相系統(tǒng)、不同系統(tǒng)流速（0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.9 mL·min-1、1.0 mL·min-1）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、不同流動相比例及不同色譜柱對濕生扁蕾色譜圖分析的作用結(jié)果，綜合考察色譜峰的基線波動程度、峰形和分離度，確定以甲醇-0. 5% 磷酸為流動相系統(tǒng)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫 30 ℃，Waters SunFire ODS C18色譜柱為色譜分析條件。

樣品制備中采用水、乙醇、50%乙醇、甲醇、50%甲醇5種溶劑；15 mL、25 mL、50 mL3種溶劑用量；回流、超聲、冷浸3種不同提取方法；15 min、30 min、45 min、60 min4種提取時間分別進行提取比較，結(jié)果綜合色譜峰數(shù)量及響應(yīng)值、分離情況、基線的穩(wěn)定性及分析時間、成本等，確定樣品提取以甲醇25 mL為溶劑、超聲30 min處理效率最高，確定為合理提取方法。

3.3 樣品結(jié)果分析 本實驗前期研究對濕生扁蕾進行化學(xué)成分分離分析，成功分離出當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素、木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮6種成分。分析結(jié)果顯示，18批樣品中，木犀草素和當(dāng)藥醇苷的含量最高，木犀草素的藥理作用為止瀉［11-13］，當(dāng)藥醇苷的藥理作用為抗炎［14-17］，這也印證了濕生扁蕾的功效。當(dāng)藥苷和異葒草素含量較低，且不同批次之間含量差異顯著，故選擇木犀草素、當(dāng)藥醇苷、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮、芒果苷4種成分作為檢測指標(biāo)，對濕生扁蕾的質(zhì)量控制更具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

該實驗建立了濕生扁蕾1種有效成分的定性鑒別及4種主要有效成分的HPLC測定方法，并進行了方法學(xué)考察，該方法簡便、高效、準(zhǔn)確，能夠用于濕生扁蕾的質(zhì)量分析。

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（收稿日期：2023-08-14 編輯：陶希睿）

基金項目：青海省基礎(chǔ)研究項目（編號2023-ZJ-604）。

作者簡介：問靜（1987—），女，漢族，本科，主管藥師，研究方向為藥品審評核查。E-mail：412818388@qq.com

通信作者：劉學(xué)良（1980—），男，漢族，本科，主任藥師，研究方向為藥品審評核查。 E-mail：93684218@qq.com