何愛琴，石彩鳳，周陽，楊俊偉，吳小梅

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟病中心，南京 210003

糖尿病是全球性的公共衛(wèi)生問題，其中90%是2型糖尿?。?］，糖尿病腎?。―KD）是其主要的微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為慢性腎臟病的主要病因，顯著增加心血管死亡的風(fēng)險(xiǎn)［2］，早期識別DKD 發(fā)病的高危人群以及對危險(xiǎn)因素進(jìn)行早期干預(yù)是亟待解決的難題［3］。研究［4］顯示，DKD 受到基因及環(huán)境多種因素的影響。解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）分布在線粒體內(nèi)膜上，在人體中廣泛表達(dá)，包括白色脂肪組織、胰島、視網(wǎng)膜細(xì)胞和腎臟。UCP2 能通過“質(zhì)子漏”作用使線粒體內(nèi)膜外的質(zhì)子直接進(jìn)入線粒體基質(zhì)，降低內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)梯度，使氧化過程與二磷酸腺苷磷酸化解偶聯(lián)，使得三連酸腺苷合成減少，以及降低活性氧的產(chǎn)生。UCP2 的這種解偶聯(lián)作用涉及多種組織功能，如產(chǎn)熱、葡萄糖分泌、游離脂肪酸代謝以及調(diào)節(jié)自噬等［5］，敲除小鼠UCP2基因可以緩解急性腎損傷［6-7］。UCP2 被認(rèn)為是代謝綜合征、胰島素抵抗、2型糖尿病和肥胖的候選基因［8-9］，其啟動子區(qū)域基因多態(tài)性會影響UCP2 的表達(dá)、胰島素釋放和敏感性。UCP2 基因存在3 個(gè)常見位點(diǎn)的多態(tài)性，包括啟動子區(qū)域的-866G/A 位點(diǎn)的基因多態(tài)性（rs659366），外顯子4中的Ala55Val位點(diǎn)的基因多態(tài)性（rs660339），以及3'未翻譯區(qū)域（3'UTR）中的45 bp 插入/刪除（Ins/Del）位點(diǎn)的基因多態(tài)性［10-13］。尤其是-866G/A 位點(diǎn)與UCP2 的表達(dá)密切相關(guān)，與G等位基因相比，A等位基因與UCP2 mRNA 表達(dá)增高相關(guān)［12，14］。但目前中國人群中UCP2 基因多態(tài)性與DKD 發(fā)病的關(guān)系尚不明確。本研究觀察了UCP2基因多態(tài)性，并分析UCP2 基因啟動子區(qū)域基因型與DKD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的2型糖尿病患者180例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75歲；②診斷為T2DM，符合美國糖尿病學(xué)會2020年制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾接受腎臟替代治療，如腎移植、透析等；②任何感染性疾病的急性期；③肝硬化失代償期；④自主能力受損；⑤腎活檢組織病理提示存在非糖尿病腎??；⑥急性腎損傷。180例患者根據(jù)尿白蛋白/肌酐比值（ACR）和預(yù)估腎小球?yàn)V過率（eGFR）分為DKD 患者92 例［糖尿病腎病組，ACR≥30 mg/g、eGFR＜60 mL/（min·1.73 m2）］和單純糖尿病患者88 例［單純組，ACR＜30 mg/g、eGFR≥60 mL/（min·1.73 m2）］。糖尿病腎病組男性54 例、女性38例，年齡62.00（52.25，66.00）歲，BMI 24.99（23.25，28.17）kg/m2，血白蛋白43.70（38.28，47.83）g/L，糖化血紅蛋白 8.35%（6.98%，10.30%）；單純組男性49 例、女性39 例，年齡60.00（57.00，66.00）歲，BMI 24.80（22.99，26.67）kg/m2，血白蛋白42.20（37.80，45.40）g/L，糖化血紅蛋白8.60%（7.23%，9.88%）。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過（批準(zhǔn)號：2019KY097），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 UCP2基因測序 設(shè)計(jì)并合成好SNP位點(diǎn)的引物池，然后通過兩步PCR 的方法完成目標(biāo)SNP 位點(diǎn)序列的擴(kuò)增和兼容Illumina 測序文庫的制備。第一輪PCR 體系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，上游引物池（10 μmol/L）1 μL，下游引物池（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Ready Mix 15 μL（總體積25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。配制好反應(yīng)體系后，在PCR 儀（BIO-RAD，T100TM）上執(zhí)行以下反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min，然后執(zhí)行8個(gè)循環(huán)，條件是98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。緊接著執(zhí)行25 個(gè)循環(huán)，條件是98 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，使用AMPure XP 磁珠純化回收PCR 產(chǎn)物。然后以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板執(zhí)行第二輪PCR 反應(yīng)，以獲得測序帶分子標(biāo)簽的文庫。反應(yīng)體系如下：DNA模板（10 ng/ μL）2 μL，通用P7 引物（含分子標(biāo)簽，10 μmol/L）1 μL；通用P5 引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL（總體積 30 μL）。配制好反應(yīng)體系后，執(zhí)行如下PCR 程序：98 ℃預(yù)變性5 min，然后執(zhí)行5 個(gè)循環(huán)程序，94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最終72 ℃延伸5 min，完成后一直4 ℃。最終PCR 產(chǎn)物使用AMPure XP 磁珠純化回收。各個(gè)PCR 產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen 測序儀（Illumina， San Diego， CA）進(jìn)行測序。引物序列如下：rs660339：5'-CAGTGTTTGGAGCATCGAGATGACT-3'，5'-GTTTGACAGAATCATACAGGCCGAT-3'；rs659366：5'-TCCCTTCTGCTGGTGAAAACACATA-3'，5'-GGGATGAGAAAAGGCGTCAGGAGAT-3'；3'UTR：5'-TTCCTGGAACGTGGTGATGTTCGTC-3'，5'-ACCAGCACTGAGACAATGAGTAGAT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻率或百分比表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)檢驗(yàn)。利用二元Logistic回歸分析研究UCP2基因啟動子區(qū)域位點(diǎn)-866G/A 基因型與DKD 發(fā)病的關(guān)系，應(yīng)用顯性和隱性模型來解釋基因型與表型之間的關(guān)系，顯性突變模型認(rèn)為，只要個(gè)體的基因型中至少一個(gè)等位基因是突變的，相關(guān)表型就會表現(xiàn)出來，而隱性模型則更為嚴(yán)格，認(rèn)為只有當(dāng)個(gè)體的基因型中兩個(gè)等位基因都是突變的時(shí)候，相關(guān)表型才會顯現(xiàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組UCP2 基因型頻率比較 糖尿病腎病組-866G/A 位點(diǎn)G/G 基因型頻率為33.0%、G/A 基因型頻率為40.9%、A/A 基因型頻率為26.1%，單純組分別為30.4%、56.5%、13.0%，兩組A/A 基因型頻率比較，P＜0.05；糖尿病腎病組Ala55Val位點(diǎn)C/C基因型頻率為31.8%、C/T基因型頻率為42.0%、T/T基因型頻率為26.1%，單純組分別為28.3%、57.6%、14.1%，兩組比較，P＞0.05。45bp INS/DEL位點(diǎn)DEL/DEL 基因型頻率為73.9%、DEL/INS 基因型頻率為23.9%、INS/INS基因型頻率為2.3%，單純組分別為84.8%、13.0%、2.2%，兩組比較，P＞0.05。

2.2 UCP2 基因啟動子區(qū)域位點(diǎn)-866G/A 基因型與DKD 發(fā)生的關(guān)系 在-866G/A 隱性模型中，A/A 基因型是DKD 發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，相比于G/A 和G/G，A/A 基因型發(fā)生DKD 的風(fēng)險(xiǎn)增高2.359 倍［2.359（1.091～5.099），P=0.029］；當(dāng)矯正性別、年齡后，A/A 基因型發(fā)生DKD 的風(fēng)險(xiǎn)增高2.491 倍［2.491（1.142～5.437），P=0.022］；當(dāng)進(jìn)一步矯正性別、年齡、糖尿病病程、糖化血紅蛋白、尿酸、總膽固醇后，A/A 基因型發(fā)生DKD 的風(fēng)險(xiǎn)增高2.491 倍［2.489（1.004～6.172），P=0.049］。在-866G/A 顯性模型中，相比于G/G 基因型，G/A 和A/A 基因型發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

糖尿病人群中約40%的患者合并DKD，DKD 已經(jīng)成為慢性腎臟病乃至終末期腎臟病的主要病因，并且更為嚴(yán)重的是，DKD 顯著增加心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)計(jì)到2040 年DKD 將成為全球第5 大常見死因［15］。由于存在尿蛋白波動甚至恢復(fù)正常、GFR 快速下降及無蛋白尿型DKD 等臨床表型，依據(jù)尿蛋白和eGFR診斷DKD的可靠性已備受爭議［16］。近年來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些DKD 診斷的生物標(biāo)志物，比如TNF受體、小管損傷標(biāo)志物等，但是由于缺乏大規(guī)模臨床驗(yàn)證，其應(yīng)用仍受到制約。目前，DKD的治療主要包括控制血壓、血糖等，特異性針對DKD的治療有限，且只能延緩而不能逆轉(zhuǎn)腎功能進(jìn)展。早期識別DKD 的高風(fēng)險(xiǎn)人群是改善DKD 預(yù)后的重要步驟。DKD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素與DKD 的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。研究［17］發(fā)現(xiàn)，不論是T1D 還是T2DM，DKD的發(fā)生均具有家族聚集性。其中遺傳因素與DKD的發(fā)生關(guān)系密切，因此，研究特定蛋白的基因多態(tài)性是識別DKD發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)人群的重要手段。

UCP2是重要的能量代謝的相關(guān)蛋白，其可以減少活性氧的產(chǎn)生，被認(rèn)為是參與代謝疾病重要的分子。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究［18］發(fā)現(xiàn)，口服UCP2 抑制劑京尼平可減少葡萄糖誘導(dǎo)的白蛋白通過足細(xì)胞單層的滲漏，從而阻止C57BL/6J 小鼠DKD 的進(jìn)展，認(rèn)為UCP2 是參與DKD 發(fā)生及進(jìn)展的重要蛋白。UCP2基因于1997年被首次發(fā)現(xiàn)［19］，其位于大鼠1號染色體、小鼠7號染色體和人類11號染色體上［20］，人類UCP2 基因包括8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子。UCP2啟動子區(qū)域的基因多態(tài)性可以改變UCP2 的蛋白表達(dá)。截至目前為止，UCP2基因中大多數(shù)已確定的多態(tài)性都顯示出低頻率，因此尚未得到深入的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，UCP2 啟動子區(qū)域3 個(gè)常見基因多態(tài)性位點(diǎn)中只有-866G/A 位點(diǎn)與DKD 的發(fā)生有關(guān)，在調(diào)整混雜因素后，-866G/A 位點(diǎn)A/A 基因型發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)增高2.489 倍。既往研究［21］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，-866G/A 多態(tài)性具有明確的功能，通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)影響基因的表達(dá)，與氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平升高有關(guān)。我們猜想，可能是由于-866G/A 基因位點(diǎn)參與調(diào)節(jié)UCP2 的蛋白表達(dá)，因此其與DKD發(fā)病的關(guān)系更為密切，遺憾的是本研究中僅僅關(guān)注了UCP2 基因多態(tài)性與DKD 發(fā)生的關(guān)系，后續(xù)需要進(jìn)一步的研究闡明UCP2 基因多態(tài)性與腎臟UCP2表達(dá)的關(guān)系。盡管目前沒有證據(jù)表明Ins/Del 多態(tài)性對UCP2 表達(dá)具有功能性影響，但它位于基因的3'非翻譯區(qū)，該區(qū)域是microRNA 連接的主要位點(diǎn)，而microRNA 是基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，Ins/Del多態(tài)性可能會改變某些microRNA 的連接位點(diǎn)從而影響基因表達(dá)［22］。而Ala55Val 多態(tài)性導(dǎo)致保守氨基酸變化，但沒有跡象表明它會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能變化。本研究并未發(fā)現(xiàn)UCP2 啟動子區(qū)域的另外兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與DKD 的相關(guān)關(guān)系，這與之前的研究結(jié)果也是一致的，可能是位點(diǎn)的突變并未影響UCP2的蛋白表達(dá)或者功能。

總之，UCP2 基因-866 G/A 基因位點(diǎn)多態(tài)性與DKD 的發(fā)病顯著相關(guān)，攜帶A/A 基因型的的糖尿病患者發(fā)生DKD 的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，這一發(fā)現(xiàn)為針對糖尿病患者的早期干預(yù)提供了重要依據(jù)。需要進(jìn)一步研究闡明UCP2 基因多態(tài)性與腎臟UCP2 表達(dá)的關(guān)系，推動DKD診治的精準(zhǔn)化和個(gè)體化管理。