謝麗 宋現讓

作者單位：250117 濟南 山東第一醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院

生物標志物是一種能客觀測量并評價正常生物過程、病理過程或對藥物干預反應的指示物。2023年，隨著免疫學、分子生物學和基因組學技術的發(fā)展，液體活檢技術發(fā)現了更多有價值的生物標志物，這些生物標志物的發(fā)現有助于臨床醫(yī)師了解腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為腫瘤的早期診斷和治療提供了重要的參考依據。

液體活檢技術作為一種新興的檢測技術，具有創(chuàng)傷小、可重復性強、成本低等優(yōu)點，可以非侵入性地反映體內腫瘤的狀態(tài)，在腫瘤篩檢中具有廣闊的應用前景，能為腫瘤的早期診斷、個體化治療監(jiān)測以及預后判斷提供有力依據。液體活檢來源涵蓋了不同類型的腫瘤相關物質，其中腫瘤來源的生物標志物主要包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）和腫瘤教育血小板（tumor-educated platelets，TEPs）等。2023 年，液體活檢標志物在腫瘤診斷和治療領域的應用更加深入和廣泛，本文就其研究新進展進行盤點。

1 液體活檢標志物檢測技術的新進展

1.1 ctDNA

CHENG 等［1］使用廣譜游離DNA測序在血漿中鑒定了一類新型約50 nt超短單鏈游離DNA，它與167 bp單核小體游離細胞DNA 明顯不同，具有不同的生物學過程以及功能元素（functional element，FE）峰、片段組學、末端基序和G-四聯體（G-Quod）特征，可作為一類獨特的生物標志物。有研究通過甲基化敏感高分辨率PCR方法分析肝細胞癌（hepatocellular cancer，HCC）患者ctDNA 中無名指蛋白135（ring finger protein 135，RNF135）和乳酸脫氫酶B（lactate dehydrogenase B，LDHB）的甲基化水平，并基于此開發(fā)了甲基化敏感高分辯率分析（MS-HRM），結果顯示，MS-HRM RNFB5和LDHB 組合可以檢測到57%的HCC，在同等特異度下優(yōu)于甲胎蛋白檢測的45%的靈敏度，當與甲胎蛋白聯合使用時，靈敏度可以提高至70%，證實ctDNA 甲基化測定也可用于腫瘤液體活檢［2］。SAURA 等［3］從乳腺癌患者收集的母乳中發(fā)現存在ctDNA，通過液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）分析母乳的ctDNA，結果在87%的病例中檢測到腫瘤變異，而在92%的匹配血漿樣本中仍未檢測到變異，其檢測敏感度為71.4%，特異度為100.0%，此外在乳腺癌臨床診斷前18個月和6個月收集的母乳中也可檢測到ctDNA。該研究開辟了母乳作為液體活檢新來源的潛在用途。

1.2 CTCs

CTCs 因在整個循環(huán)血液中的濃度極低，檢測的靈敏度有限。2023 年，STOECKLEIN 等［4］通過采用診斷性白細胞分離術（diagnostic leukapheresis，DLA）來篩查大血量（中位處理血量約為2.8 L）以提高CTC 檢測的靈敏度，結果發(fā)現DLA 能將M0 期胰腺癌患者的CTC 檢出率提高到44%，在M1 期患者中提高到74%，同時可使CTC 計數增加了60 倍，從而為基因組分析提供足夠的CTC。這種大容量液體活檢策略通過提供充足的CTC材料，增強了其作為可靠液體活檢方法的實用性，有望作為識別高危腫瘤患者和幫助優(yōu)化多模式治療策略的可行手段。

1.3 EVs

EVs 是液體活檢的理想選擇，但區(qū)分腫瘤衍生的EVs 和體液中含有生物標志物的EVs 亞群一直具有挑戰(zhàn)性。2023 年，KO 等［5］發(fā)現糖蛋白CD147+EV 主要來源于腫瘤細胞，與健康個體和良性疾病患者相比，循環(huán)中的CD147+EVs 在卵巢癌和腎癌患者的陽性率顯著增加。該研究還發(fā)現，通過CD147免疫捕獲分離的循環(huán)miRNA 較通過常規(guī)方法分離的循環(huán)miRNA 更接近反映腫瘤miRNA 的特征，因此CD147免疫捕獲可能是分離腫瘤衍生miRNA 進行液體活檢的有效方法。

膜蛋白是細胞外囊泡和顆粒（extracellular vesicles and particles，EVPs）常用的標志物，但無法滿足臨床要求的診斷準確性。ZHAI 等［6］用干涉等離子體顯微鏡研究膜蛋白表達水平、適配體的結合動力學和EVPs大小之間的相關性，結果發(fā)現5種蛋白質標志物的選擇性膜蛋白表達水平及其結合動力學在各種大小的EVPs 中具有高度異質性，導致對所有人群進行批量分析時，其對腫瘤分類的總體準確性較低（＜50%）；如果根據大小將EVPs分為3個亞群，腫瘤診斷的準確性可以提高到70%；進一步將EVPs 分組為大小間隔為10 nm 的亞群，并使用機器學習算法分析膜蛋白和EVPs 大小之間的相關性，發(fā)現其區(qū)分腫瘤類型的總體準確性可以提高到85%。該研究表明不同膜蛋白的選擇與EVPs大小之間的相關性可能是臨床腫瘤診斷有潛力的標志物。

1.4 其他

piRNAs是新型小沉默RNA，已被鑒定在癌癥相關信號通路中發(fā)揮作用。2023年，RUI等［7］采用小RNA測序分析血清外泌體中的piRNAs，篩選出了253個差異表達的血清外泌體衍生的piRNAs，其中來自HCC的血清外泌體衍生的piRNAs 顯示出獨特的表達譜，說明外泌體中的piRNAs可能作為HCC診斷的生物標志物。TEPs 被認為是腫瘤生長的全身和局部反應的核心參與者。2023 年，CAMPOLO 等［8］在對胃腸胰神經內分泌腫瘤患者的TEPs 樣本進行RNAseq 分析時鑒定出了差異表達的252 個circRNAs，首次證實了來自TEPs的circRNAs 特征可能是潛在的診斷和預測生物標志物。

2 液體活檢標志物的臨床應用

2.1 在腫瘤早期診斷和分期中的應用

早期診斷有助于提高腫瘤的治愈率和生存率，但是通過液體活檢檢測早期腫瘤仍具有一定挑戰(zhàn)性，主要是因為缺乏針對早期病變的特異性生物標志物，而且相關標志物的水平可能很低。目前，腫瘤的早期診斷仍然是液體活檢技術應用于臨床的關鍵挑戰(zhàn)，2023年，液體活檢標志物研究在腫瘤的早期診斷方面取得了新的進展。BAE 等［9］對涵蓋9 種癌癥類型的2 125 個患者樣本和1 241 個正常對照樣本進行cfDNA 全基因組測序，并整合數據開發(fā)出新的診斷模型，結果顯示，該模型對Ⅰ期腫瘤的敏感度高達98.2%，有可能實現超靈敏的早期腫瘤檢測和準確的腫瘤組織起源定位。為提高肺癌早篩的準確性，SIKOSEK 等［10］前瞻性招募1 384 名符合肺癌篩查標準的個體，并收集全血進行超深度小RNA 測序，結果發(fā)現了18 個差異表達的小RNA，然后基于此建立診斷模型。該模型的診斷性能隨腫瘤分期遞增，從發(fā)現隊列中Ⅰ期的0.73增加到Ⅳ期的0.90，驗證隊列中從Ⅰ期的0.76 增加到Ⅳ期的0.86［10］。這些數據表明，基于小RNA 的血液檢測有可能成為低劑量計算機斷層掃描篩查的可行替代方案，用于早期發(fā)現肺癌。

JO 等［11］利用原位高級別漿液性卵巢癌動物模型發(fā)現了基于EVs 的腫瘤標志物組合（包括EpCAM、CD24、VCAN、HE4和TNC），該組合可以將高級別漿液性卵巢癌與非腫瘤顯著分開，敏感度為89%，特異度為93%。為提高外泌體檢測的敏感度，YU 等［12］報道了一種納米液體活檢測定法，其通過雙重特異性生物標志物抗原共識別和捕獲策略，可檢測低至78 pg/mL的胰腺癌外泌體特異性蛋白GPC1，而且具有較高的特異度和靈敏度，為早期胰腺癌的無創(chuàng)監(jiān)測和診斷提供了可能。GUO 等［13］發(fā)現EVs 衍生的lncRNA GClnc1可有效區(qū)分早期胃癌與癌前病變（慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生）以及傳統胃腸道生物標志物（CEA、CA72-4 和CA19-9）陰性的胃癌，說明EVs 衍生的lncRNA GClnc1可能作為胃癌早期檢測的循環(huán)生物標志物，為根治性手術和改善患者生存結局提供機會。

HCC 的早期診斷仍缺乏高度敏感和特異性的蛋白質生物標志物。XING 等［14］基于HABP2、CD163、AFP 和PIVKA-Ⅱ建立的診斷模型能夠顯著區(qū)分HCC 與肝硬化（AUC=0.979）和健康個體（AUC=0.992），優(yōu)于現有的臨床預測策略。該模型還可以準確預測肝硬化到HCC 的轉化（AUC=0.890），而且比影像學診斷早11.4 個月。這些結果為液體活檢技術用于臨床提供了有價值的參考，也展現出了提高HCC 早期診斷水平的巨大潛力。XU 等［15］開發(fā)了一種基于血漿circRNAs 的生物標志物組合，可區(qū)分早期（Ⅰ/Ⅱ期）和晚期（Ⅲ/Ⅳ期）胰腺導管腺癌，與CA19-9 水平聯合應用時，診斷性能顯著提高（AUC=0.94），而且還能有效地識別CA19-9 陰性的胰腺導管腺癌患者（AUC=0.85）。

2.2 在腫瘤療效評估和耐藥性檢測中的應用

監(jiān)測液體活檢標志物的動態(tài)變化有助于揭示腫瘤對治療藥物的耐藥機制，從而指導臨床醫(yī)師選擇合適的治療方案。2023年，液體活檢標志物在癌癥治療耐藥性檢測中的應用正在不斷發(fā)展，包括在化療、靶向治療、免疫治療等多種治療方式的耐藥性中的應用。

胃癌患者較高的治愈性切除率及良好預后與其對新輔助化療（neo-adjuvant chemotherapy，NACT）的良好反應密切相關。2023 年，ZHANG 等［16］發(fā)現ctDNA 可作為預測Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者預后和監(jiān)測NACT反應的潛在生物標志物。該研究收集了接受2個周期NACT 胃癌患者的基線、NACT 后和手術后的血漿，使用包含425基因的panel檢測ctDNA中的基因組改變（genomic alterations，GA）。該研究結果顯示，臨床Ⅲ期患者的ctDNA 濃度顯著高于Ⅱ期患者；接受NACT 和手術后，ctDNA 的整體檢出率逐漸降低；接受NACT后，最大變異等位基因頻率（max-VAF）從0.50%下降到0.08%，GA數量從2.9下降到1.7；接受NACT后部分緩解的患者，max-VAF和GA數量也顯著下降，但疾病進展患者則增加；在基線、NACT后或手術后可檢測到ctDNA的患者總生存期較ctDNA檢測不到的患者更差，且接受NACT前和接受NACT后ctDNA陰性的患者預后最好。

SAEKI 等［17］開發(fā)了一種基于SEPT9 甲基化的多重ddPCR技術，以對接受索拉非尼或侖伐替尼治療的HCC 患者進行藥物療效篩查。該研究的多因素分析顯示，甲基化SEPT9在驗證隊列中被確定為不良總生存期的預測因子，可能是分子靶向藥物治療HCC 患者的潛在療效預測標志物。CARBONELL 等［18］對接受免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治療的轉移性非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的血漿樣本中的游離DNA 進行全基因組測序分析，計算腫瘤分數（tumor fraction，TFx）和體細胞拷貝數改變負荷，發(fā)現基線時的TFx 與骨骼和肝臟的轉移性病變相關，高TFx 與ICIs 受益相關，且無論基線時的TFx 水平如何，其都能更好地預測治療樣本的臨床療效。

有研究使用仿生細胞滾動和樹突分子偶聯抗體技術純化CTC，以檢測頭頸部鱗狀細胞癌患者血液中CTC 的數量，發(fā)現隨著放化療和西妥昔單抗治療的成功，CTC 數量明顯下降［19］。KOJIC 等［20］開發(fā)了基于患者特異性體細胞突變的個性化ddPCR技術，該技術能夠在每1 mL 腦脊液中檢測到低至0.17 ng～85.39 ng ctDNA，用該技術對原發(fā)性和轉移性小兒腦惡性腫瘤患者的腦脊液樣本進行連續(xù)評估檢測，發(fā)現ctDNA 水平與病程和臨床療效呈正相關。該研究說明基于個性化突變的液體活檢在小兒腦惡性腫瘤療效監(jiān)測中的可行性。

化療在轉移性結直腸癌患者的治療中仍然占主導地位，為預測患者對一線化療的客觀緩解率，YANG 等［21］收集了190 例在不同機構接受FOLFOX或XEOLX 化療方案的轉移性結直腸癌患者的血漿樣本，通過進行血漿EVs 的RNA 測序，構建了由具有反映預測能力的22 個基于EVs 的RNA 組成的特征模型，結果顯示，該模型能很好地將患者分為基于奧沙利鉑的化療敏感組和一線化療前不敏感組，AUC值在訓練隊列、內部驗證隊列和外部驗證隊列中分別為0.986、0.821 和0.816。外泌體也可以通過遞送miR-6836至順鉑敏感的上皮性卵巢癌細胞中，重建腫瘤微環(huán)境，逆轉其對順鉑的反應［22］。膽管癌是一種預后不佳的異質性膽道惡性腫瘤。LAPITZ等［23］通過質譜法對不同患者血清EVs 進行高通量蛋白質組學分析，并基于機器學習的算法提出了具有預測預后能力的EVs 生物標志物組合，其中EVs 中的COMP/GNAI2/CFAI 高表達意味著膽管癌患者總生存期縮短，ACTN1/MYCT1/PF4V表達水平升高意味著總生存期延長，而且這兩個合組合也可以對膽管癌患者進行預后分層，以增加有資格獲得潛在治愈選擇或接受更成功治療的病例數量，從而降低膽管癌的死亡率。

2.3 在腫瘤預后評估、轉移和復發(fā)監(jiān)測中的應用

通過監(jiān)測液體活檢標志物的動態(tài)變化，可以預測腫瘤的復發(fā)轉移風險和預后，從而指導臨床醫(yī)生及時采取必要的干預措施。ctDNA 是一種具有多方面作用的生物標志物，術前ctDNA 水平可反映早期腫瘤的復發(fā)風險，術后ctDNA 水平則可能預示腫瘤即將復發(fā)。ABBOSH 等［24］開發(fā)了一種系統發(fā)育追蹤技術，該技術包括患者特異性錨定多重PCR 以及追蹤腫瘤突變的ctDNA 富集，并結合信息工具用于低ctDNA 水平下對亞克隆結構進行非侵入性跟蹤。該研究對197例早期NSCLC 患者術后120 d 內、輔助治療或復發(fā)前連續(xù)收集的1 069 份血漿樣本進行ctDNA 檢測，結果在25%的術后患者中檢測到ctDNA，包括49%的臨床復發(fā)患者；確定了多克隆轉移播散的患者與不良臨床結局有關；通過測量術前血漿中的亞克隆癌細胞組分，發(fā)現與非轉移性亞克隆相比，播種未來轉移的亞克隆明顯擴增。該研究結果表明ctDNA可用于檢測和分析根治性治療后持續(xù)存在的殘留腫瘤細胞，使用ctDNA非侵入性檢測的原發(fā)性腫瘤亞克隆擴增與轉移潛力有關，在手術時預測后期轉移復發(fā)的亞克隆組成可以為針對導致疾病復發(fā)的亞克隆的精準輔助治療提供信息。

對ctDNA 甲基化的縱向評估有助于早期發(fā)現復發(fā)，優(yōu)化患者的風險分層和術后治療策略。一項多中心前瞻性縱向隊列研究［25］從2 家醫(yī)院招募350 例Ⅰ～Ⅲ期結直腸癌患者，在手術前和手術后、輔助化療期間和術后收集血液樣本，之后每3個月采集1 次（最多2 年），然后通過多重甲基化PCR 檢測血漿樣品中的ctDNA 的6 個DNA 甲基化標志物，以評估ctDNA 水平與結直腸癌在整個病程中復發(fā)的相關性。該研究發(fā)現，在296 例術前患者中，78.4%的患者6 種ctDNA 甲基化標志物中的任何一種檢測呈陽性；術后1 個月，ctDNA 陽性患者的復發(fā)可能性是ctDNA 陰性患者的17.5 倍。該研究還顯示，ctDNA 與癌胚抗原測試組合能顯示復發(fā)風險分層，術后1 個月的ctDNA 狀態(tài)也與接受不同持續(xù)時間和強度輔助化療患者的預后密切相關；輔助化療后，ctDNA陽性患者的無復發(fā)生存期明顯短于ctDNA 陰性患者；根治性治療后的縱向ctDNA分析顯示，ctDNA 陽性患者的無復發(fā)生存期比ctDNA陰性患者差，且根治性治療后通過ctDNA 分析發(fā)現的復發(fā)早于影像學證實的復發(fā)，中位提前期為3.3個月。

在復發(fā)前進行分子殘留病灶生物標志物檢測，盡早發(fā)現分子殘留病灶并進行風險分層，有助于優(yōu)化臨床決策模式。CHEN 等［26］使用高效文庫制備、增強的雜交捕獲和基于UMI 的超深度靶向測序技術建立了一種先進的殘留病灶檢測技術。該技術基于對患者特異性腫瘤ctDNA 的檢測，具有覆蓋深度均勻、背景噪聲低、準確定量、使用50 個突變標記和低至20 ng ctDNA 起始材料等優(yōu)點，在針對早期NSCLC 患者的前瞻性研究中，可以幫助早期患者識別術后復發(fā)風險，監(jiān)測臨床復發(fā)后的治療反應，為患者提供精確的分層，以便做出個性化的治療決策。在血管免疫母細胞性T 細胞淋巴瘤中ctDNA 可作為液體活檢的復發(fā)性突變和預后生物標志物，從而對患者進行分層并指導治療選擇［27］。有研究采用ddPCR 檢測轉移性胰腺導管腺癌患者ctDNA 樣本中的NPTX2 甲基化程度，結果發(fā)現，診斷時較高的NPTX2 甲基化水平與不良預后相關，檢測NPTX2 甲基化水平可以有效地對患者進行分層以預測總生存期，此外NPTX2 甲基化水平的動態(tài)變化也與疾病進展和治療反應相關［28］。胰腺導管腺癌患者發(fā)生肝轉移時血漿基因組中KRAS突變和max-VAF（variant allele fraction）的發(fā)生率均顯著高于肺部、淋巴結、腹膜等其他部位轉移患者［29］。

CD117 是卵巢干細胞常用的標志物，而EVs 中CD117的豐度與卵巢癌分級和治療耐藥狀態(tài)相關［30］。對從卵巢癌腹水中分離的EVs 進行檢測發(fā)現，復發(fā)性卵巢癌患者EVs 中CD117 的豐度遠高于原發(fā)性腫瘤［30］。CTCs 和PD-L1 陽性EVs 組合可用于評估轉移性NSCLC 患者預后［31］。盡管只有少部分的浸潤性黏膜下結直腸癌（T1 期）患者存在淋巴結轉移，但多數患者接受了淋巴結清掃術。為了準確地識別淋巴結轉移陽性患者，防止過度治療，MIYAZAKI 等［32］對200 例高危T1 期結直腸癌患者外泌體中的miRNA進行分析，發(fā)現4 種miRNA（miR-181b、miR-193b、miR-195 和miR-411）表達與患者淋巴結轉移相關，進一步利用該組合建立風險分層模型，結果顯示該模型將淋巴結轉移的假陽性率降低了76%?；谘?個miRNA的液體活志物組合也可用于預測胃癌患者術后1 年內發(fā)生早期復發(fā)的風險［33］。

3 液體活檢標志物研究面臨的挑戰(zhàn)

分子生物學的技術進步引發(fā)了人們對研究液體活檢作為腫瘤診療工具的興趣，然而將液體活檢應用于臨床精準醫(yī)療仍然有一定局限性，主要包括以下方面：⑴液體活檢標志物檢測具有高度復雜性且準確性不高。一方面，受到不同器官來源的腫瘤脫落等因素的限制，液體活檢標志物檢測在泛癌篩查檢測中的敏感度和特異度仍不高。另一方面，腫瘤異質性導致檢測的復雜性，如組織學和血液學檢測結果不一致、腫瘤進展的不同變化等。另外，具體的臨床應用場景有不同的要求，如耐藥突變檢測需要更高的靈敏度，腫瘤突變載量的精確評估需要對主克隆和亞克隆進行全面檢測，藥物療效的預測作用需要對ctDNA 清除率進行精確定義等，此外排除克隆性造血和其他背景噪聲也很重要。⑵缺乏統一的液體活檢標志物檢測技術標準。目前，液體活檢研究仍處于發(fā)展階段，尚缺乏規(guī)范的操作程序和統一的數據分析方法，不同實驗室的檢測結果可能有較大異質，缺乏科學可比性，這在一定程度上影響其準確性和可靠性。此外，低濃度的CTCs 和ctDNA 會導致靈敏度降低，樣品提取和處理過程中的污染可能導致假陽性和假陰性結果，復雜的檢測過程和低效的設備也阻礙了其更廣泛的應用。為提高其臨床應用價值，在進行技術改進的同時，亟需建立液體活檢標志物檢測的標準化方法，包括采集容器的選擇、抽血和血漿處理的使用時間和程序、液體活檢成分提取/分離程序、準確穩(wěn)定的庫構建技術、強大的生物信息學分析平臺和數據庫等。⑶需要多維度和多組學的組合檢測。越來越多的研究表明，單一類別的腫瘤標志物（如ctDNA 突變或DNA 甲基化）在敏感度和特異度方面存在明顯的局限性，因此多維標志物和多組學的結合為液體活檢在癌癥中的應用提供了新的方向。多標志物組合分析可以更全面地了解腫瘤異質性，但是液體活檢幾種成分（可能來自不同的癌細胞群）的互補性仍有待進一步明確，可考慮將ctDNA 檢測與甲基化、外泌體、循環(huán)miRNA、CTCs、代謝組學和分子成像方法相結合。另外，疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及多個器官、細胞以及各種生物分子的相互作用，孤立的液體活檢只能反映特定分子或生物標志物的水平，仍不能全面反映疾病的復雜特征。因此，有必要考慮整合其他檢查技術，如CT、MRI 和超聲檢測。另外，目前大多數研究結果仍不能直接應用于臨床實踐，需要在更大的人群中進行嚴格的前瞻性試驗和在臨床應用前進行驗證。

4 小結

綜上所述，2023 年，液體活檢標志物如ctDNA、CTCs、EVs 等在腫瘤早期診斷、療效評估、預后預測、轉移和復發(fā)監(jiān)測等臨床應用中都有了更加深入的研究和拓展。通過非侵入性程序獲得的生物樣本可以提供有關腫瘤各個方面的信息，有助于了解腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，也有助于臨床醫(yī)師監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展和評估治療反應，從而為患者提供更準確和個性化的治療決策。雖然目前仍存在一定局限性，但隨著技術方法的不斷進步和大規(guī)模臨床試驗的開展，許多生物標志物已經開始證明其價值，顯示出了廣闊的應用前景，相信液體活檢將成為腫瘤診斷和治療不可或缺的技術。