孫曉娟 杜曉婕 周紅梅 王瞾 曾維惠

光老化為皮膚老化過(guò)程中的主要環(huán)節(jié), 其中UVB是光老化發(fā)生的主要因素［1］, 其能夠使得皮膚組織逐漸干燥缺水, 角質(zhì)層功能受到破壞, 出現(xiàn)皮膚松弛粗糙、質(zhì)地較硬, 形成皺紋等, 若不及時(shí)予以規(guī)范化治療,可能會(huì)進(jìn)展為光化性角化病, 嚴(yán)重的可引起皮膚鱗狀細(xì)胞癌［2］。光老化致皮膚損傷目前尚無(wú)有效根治藥物,故探索防治UVB 所致光老化損傷為皮膚科研究熱點(diǎn)之一。2%超分子水楊酸為近年皮膚修復(fù)的新藥, 現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)其不僅有抗炎作用, 還有抗紫外線損傷、雙向角質(zhì)調(diào)理作用［3］?，F(xiàn)為進(jìn)一步明確2%超分子水楊酸對(duì)UVB 所致光老化是否存在修復(fù)作用, 并分析其可能作用機(jī)制, 本研究應(yīng)用UVB 輻照小鼠以構(gòu)建光老化損傷動(dòng)物模型, 觀察2%超分子水楊酸作用后皮膚形態(tài)變化以及皮膚組織p21、p53 表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 新型超分子水楊酸祛痘調(diào)理凝露［博任達(dá)生化科技(上海)有限公司］。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡30 只健康SPF 級(jí)昆明雌鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司), 體重20～25 g, 飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室, 試驗(yàn)期間所有小鼠均自由攝食飲水。

1.1.3 試劑和儀器 Masson 三色染色試劑盒、HE染色試劑盒(購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司)；UVB 輻射儀(美國(guó)SPECTRONICS)；熒光顯微鏡(美國(guó)AMSCOPE)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 隨機(jī)將30 只試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、UVB 組、UVB+2%超分子水楊酸組, 各10 只。

1.2.2 干預(yù)方法 三組小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí), 空白對(duì)照組小鼠正常日光照射飼養(yǎng), 時(shí)間為40 min；UVB 組、UVB+2%超分子水楊酸組小鼠予以UVB 輻照, 輻照開(kāi)始前將小鼠背部5.0 cm×5.0 cm 的皮膚表面毛發(fā)剃除(試驗(yàn)期間每5 天剃除毛發(fā)1 次),然后用UVB 輻照儀照射(預(yù)熱15 min)小鼠剃除毛發(fā)后的背部皮膚, 照射40 min/次(UVB 光源311 nm), 照射期間每15 分鐘輪換1 次鼠盒位置, 保證每個(gè)飼養(yǎng)籠內(nèi)小鼠接收到的UVB照射強(qiáng)度是相同的, 共照射12周,第1 周給予1×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；第2 周給予2×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；第3 周給予3×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/ 周)；第4～12 周 給 予4×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；與此同時(shí), UVB+2%超分子水楊酸組在UVB 照射后涂抹1 次2%超分子水楊酸, 非照射日也涂抹1 次, 空白對(duì)照組、UVB組不給予藥物干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 觀察三組小鼠背部皮膚外形情況 最后1 次輻照結(jié)束后48 h, 試驗(yàn)人員對(duì)三組小鼠背部照射區(qū)域皮膚損傷程度進(jìn)行評(píng)分, 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：0 分：皮膚表面未見(jiàn)有紅斑；1 分：皮膚表面有輕微紅斑；2 分：皮膚表面有明顯紅斑；4 分：皮膚表面有紫紅色紅斑, 或有結(jié)痂；3 分介于2～4 分之間。

1.3.2 觀察三組小鼠背部皮膚顯微結(jié)構(gòu)改變情況 試驗(yàn)人員肉眼觀察小鼠背部皮膚后以斷頸法將試驗(yàn)小鼠處死, 將日光照射或UVB 輻照小鼠的背部皮膚組織取下, 將取下的皮膚組織一半置于10%福爾馬林溶液中固定保存, 將其制為病理組織切片；另一半皮膚組織去除皮下脂肪后將其置于冷凍0.9%氯化鈉溶液中漂洗, 保存在-80℃冰箱中以用于制作皮膚組織勻漿。取福爾馬林溶液固定的病理組織, 經(jīng)酒精梯度脫水、石蠟包埋后制作切片, 分別進(jìn)行HE 染色和Masson 染色。在熒光顯微鏡下觀察HE 染色切片, 隨機(jī)選擇5 個(gè)視野,利用顯微鏡配置的微尺測(cè)量出小鼠背部皮膚表皮厚度、真皮厚度, 取5 個(gè)視野的均值作為最終測(cè)定結(jié)果。經(jīng)Masson 染色的切片通過(guò)熒光顯微鏡觀察皮膚組織中真皮膠原纖維排列情況, 并通過(guò)IMAGE-PRO PREMIER 2D 圖像分析軟件算出染為藍(lán)色區(qū)域中膠原纖維光密度值, 以此結(jié)果作為膠原纖維的含量。

1.3.3 觀察三組小鼠背部皮膚組織p21、p53 表達(dá)情況 應(yīng)用免疫組化染色法, 取組織勻漿, 石蠟包埋制片(厚度4.0～5.0 μm), 經(jīng)脫蠟→水化→過(guò)氧化氫滅活→微波修復(fù)抗原等步驟處理切片, 再分別滴加p21 單抗和p53 單抗, 孵育過(guò)夜后滴加二抗, 用磷酸緩沖鹽溶液(PBS 溶液)反復(fù)沖洗樣本3 次。最后給予二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素、酒精梯度脫水, 二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察切片, 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)［4,5］：p21 陽(yáng)性表達(dá)：p21 主要位于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜,見(jiàn)染色為棕黃色評(píng)定為陽(yáng)性, 反之不著色評(píng)定為陰性；p53 陽(yáng)性表達(dá)：p53 主要位于細(xì)胞核, 見(jiàn)著色為棕黃色評(píng)定為陽(yáng)性, 反之不著色評(píng)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示, 采用t 檢驗(yàn), 多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn), 等級(jí)資料予以秩和檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠背部皮膚外形情況比較 與空白對(duì)照組(該組小鼠背部皮膚色澤較腹部皮膚偏黑, 皮膚光滑無(wú)皺紋, 未見(jiàn)有明顯紅斑, 無(wú)明顯毛細(xì)血管擴(kuò)張等改變)相比, UVB 組小鼠皮膚粗糙, 有深皺紋毛孔擴(kuò)大, 缺乏彈性, 皮膚呈褐黃色斑, 皮革樣外觀, 鏡下見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張, 結(jié)痂, 為典型光老化特征, UVB+2%超分子水楊酸組皮膚外觀有隱約褐色斑, 有散在、不規(guī)則褐色斑片,光老化癥狀較輕。三組背部皮膚損傷程度比較有明顯差異性(P<0.05)；UVB 組背部皮膚損傷程度明顯大于空白對(duì)照組和UVB+2%超分子水楊酸組, 有明顯差異性(Z=3.964、2.893, P=0.000、0.004<0.05)；空白對(duì)照組與UVB+2%超分子水楊酸組皮損程度比較也有明顯差異性(Z=3.183, P=0.001<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠背部皮膚損傷程度比較(只)

2.2 三組小鼠背部皮膚顯微結(jié)構(gòu)改變情況比較 空白對(duì)照組小鼠背部皮膚鏡下見(jiàn)皮膚表面結(jié)構(gòu)完整, 真皮層纖維組織與表皮平行, 呈波浪狀；UVB 組小鼠背部皮膚表皮顯著變厚, 見(jiàn)有角化不全或過(guò)及, 真皮纖維組織與表皮分層不清楚, 分布不均勻；UVB+2%超分子水楊酸組小鼠背部皮膚表皮厚度較UVB 組少, 真皮纖維組織排列稀疏。三組表皮厚度、真皮厚度及真皮膠原纖維含量比較, 有明顯差異性(P<0.05)；UVB+2%超分子水楊酸組和UVB 組表皮厚度、真皮厚度明顯多于空白對(duì)照組, 真皮膠原纖維含量顯著少于空白對(duì)照組,有明顯差異性(P<0.05)；UVB+2%超分子水楊酸組表皮厚度、真皮厚度明顯少于UVB 組, 真皮膠原纖維含量多于UVB 組, 有明顯差異性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組小鼠背部皮膚表皮厚度、真皮厚度、真皮膠原纖維含量比較( ±s)

表2 三組小鼠背部皮膚表皮厚度、真皮厚度、真皮膠原纖維含量比較( ±s)

注：與空白對(duì)照組比較, aP<0.05；與UVB 組比較, bP<0.05

組別 只數(shù) 表皮厚度(μm) 真皮厚度(μm) 真皮膠原纖維含量(OD)空白對(duì)照組 10 18.55±1.80 350.08±35.16 0.46±0.05 UVB 組 10 79.68±21.37a 611.62±16.37a 0.15±0.30a UVB+2%超分子水楊酸組 10 60.99±11.49ab 467.94±20.71ab 0.32±0.03ab F 18.484 99.738 117.331 P 0.000 0.000 0.000

2.3 三組小鼠背部皮膚組織p21、p53 陽(yáng)性表達(dá)比較免疫組化顯示空白對(duì)照組未見(jiàn)有p21、p53 陽(yáng)性表達(dá)。UVB+2%超分子水楊酸組皮膚組織p21、p53 陽(yáng)性表達(dá)率低于UVB 組, 有明顯差異性(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組小鼠背部皮膚組織p21、p53 陽(yáng)性表達(dá)比較［只(%)］

3 討論

紫外線是引起皮膚老化的重要原因之一, 其皮膚組織表現(xiàn)主要是表皮組織變厚、組織角化過(guò)度并伴角化不全, 表皮與真皮纖維層次不清, 并且有退行性改變［6］。本研究中, UVB 組大鼠背部皮膚外觀改變,而且UVB 組真皮厚度、表皮厚度明顯增多, 真皮膠原纖維含量明顯減少, 與上述光老化表現(xiàn)相一致。而UVB+2%超分子水楊酸組表皮、真皮厚度及真皮膠原纖維含量?jī)?yōu)于UVB 組, 由此可見(jiàn)本研究UVB 組構(gòu)建的UVB 所致小鼠光老化損傷模型比較成功, 而2%超分子水楊酸對(duì)UVB 所致小鼠光老化損傷有一定修復(fù)作用。

大量研究報(bào)道［7,8］, UVB 對(duì)皮膚最明顯的影響是急性炎癥反應(yīng), UVB 照射劑量達(dá)到一定程度時(shí)可誘使角質(zhì)形成細(xì)胞啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng), 與此同時(shí)UVB 還會(huì)激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB), 釋放更多促炎細(xì)胞因子表達(dá), 進(jìn)而加劇皮膚老化進(jìn)程。另有研究指出［9-11］, UVB輻照過(guò)度可導(dǎo)致活性氧(ROS)簇激活, 引起氧化應(yīng)激反應(yīng), 上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)產(chǎn)生和活性, 從而導(dǎo)致真皮膠原纖維分解, 最終造成光老化, 因此, 抗炎、抗氧化及減少氧自由基生成、清除老化代謝產(chǎn)物是UVB 光老化的治療原則。

p21、p53 為細(xì)胞老化標(biāo)志物［12］, 本研究結(jié)果顯示,UVB 組背部皮膚組織P21、p53 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于UVB+2%超分子水楊酸組, 與孫楠等［13］研究相一致,p21、p53 表達(dá)增加與抑制細(xì)胞周期依賴性激酶活性、細(xì)胞周期停滯有一定的相關(guān)性。而經(jīng)2%超分子水楊酸處理后大鼠皮膚組織p21、p53 陽(yáng)性表達(dá)顯著減少,提示2%超分子水楊酸修復(fù)光老化皮膚損傷可能與通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚組織p21、p53 表達(dá)有關(guān)。2%超分子水楊酸與傳統(tǒng)水楊酸有明顯不同, 其主要是利用超分子技術(shù)將水楊酸溶于水, 在制作過(guò)程中不使用任何有機(jī)溶劑, 故該產(chǎn)品較為溫和, 發(fā)揮療效的同時(shí)還可以降低對(duì)皮膚的刺激性［14-16］。2%超分子水楊酸有雙向角質(zhì)調(diào)節(jié)作用, 能夠去除老化的角質(zhì)層, 達(dá)到更新角質(zhì)的治療目的, 而且對(duì)于角化不成熟的角質(zhì)層細(xì)胞還能夠促進(jìn)其成熟, 調(diào)節(jié)p21、p53 蛋白進(jìn)而改善細(xì)胞周期停滯［17-19］。

綜上所述, 2%超分子水楊酸對(duì)UVB 所致小鼠光老化皮膚有修護(hù)保護(hù)作用, 其機(jī)制與抑制凋亡相關(guān)基因p21、p53 表達(dá)有關(guān)。