楊斌,湯玉,時(shí)晨,單進(jìn)軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,兒童健康與中醫(yī)藥江蘇省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)中心,江蘇 南京 210023)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)屬于副黏病毒科肺病毒屬,是一種負(fù)義單鏈RNA病毒[1]。RSV感染是誘發(fā)小兒肺系疾病的最常見病因之一,通常會(huì)引起咳嗽、哮喘、鼻炎等呼吸道疾病,嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)哮喘綜合征、呼吸道阻塞、肺不張甚至窒息死亡[2]。臨床常用RSV融合蛋白的人單克隆抗體(帕利珠單抗)和利巴韋林預(yù)防治療RSV肺炎,但是帕利珠單抗只可部分預(yù)防RSV感染且價(jià)格昂貴,利巴韋林副作用多且臨床療效欠佳,所以仍需開發(fā)治療RSV感染的藥物,以減少RSV感染對患者的影響[3-4]。

目前傳統(tǒng)中藥作為新藥開發(fā)的重要資源,在治療病毒感染性疾病方面表現(xiàn)出了獨(dú)特優(yōu)勢?；瘽駭《绢w粒是黃璐琦院士援鄂抗疫時(shí)以《傷寒論》和《金匱要略》為依據(jù),將麻杏石甘湯、藿香正氣散等經(jīng)典名方加減化裁而成的治療新型冠狀病毒感染方劑[5-6],具有化濕解毒,宣肺瀉熱功效[7]。RSV肺炎與新型冠狀病毒肺炎均屬疫病范疇,基于中醫(yī)異病同治的思想探討化濕敗毒顆粒對RSV肺炎的治療作用目前還未見報(bào)道。本研究旨在研究化濕敗毒顆粒治療小鼠RSV肺炎的療效,并從脂質(zhì)代謝的角度探討其潛在的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

化濕敗毒顆粒(生產(chǎn)批號(hào):J2204004;每袋5 g,相當(dāng)于生藥17.13 g)由廣東一方制藥有限公司提供。RSV A型(Long株)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。人喉癌上皮細(xì)胞 (Human laryngeal epithelial cells,Hep-2)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c健康小鼠,54只,6～8周齡,體質(zhì)量18～21 g,購于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0006,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(倫理批號(hào):202112A033)。實(shí)驗(yàn)開展前,將小鼠置于室溫為24～26 ℃,相對濕度為52%～56%,12 h光暗晝夜循環(huán)的環(huán)境中,自由進(jìn)食飲水進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 儀器與試劑

Synergy超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);Vortex-Genie2渦旋振蕩器(美國Scientific industries公司);THZ-C恒溫震蕩儀(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司);Savant SPD1010真空離心濃縮儀(美國Thermo Fisher公司);U3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司);Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Xcalibur 2.1SP1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

胎牛血清(FBS)(10099-142)購于美國Gibco公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于上海源培生物科技股份有限公司;甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(Methyl Tert-Butyl Ether,MTBE)均為99.8%質(zhì)譜純,購自德國Merck公司;脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)PE(17∶0/17∶0)、TG(17∶0/17∶1/17∶0 D5)[純度:99%,美國Avanti Polar Lipids公司,貨號(hào):LM170PE-19、170/171/170TG(DG)-10];甲酸、異丙醇、甲酸銨和乙酸銨均為99.8%質(zhì)譜純,購于美國ROE公司。

1.4 RSV擴(kuò)增

Hep-2為RSV繁殖細(xì)胞,采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞成長至60%單層后進(jìn)行病毒擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增前吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS清洗,接種RSV A型A2標(biāo)準(zhǔn)株,吸附2 h后,加入含2%胎牛血清的DMEM維持液,逐日觀察,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上的病變時(shí),液氮冷凍破碎細(xì)胞,4 000 r·min-1離心15 min,取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩ep-2細(xì)胞以1×105mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。待細(xì)胞長成單層時(shí)吸棄培養(yǎng)液,以PBS清洗細(xì)胞表面,將通過維持液梯度稀釋的病毒液接種于96孔培養(yǎng)板中,并設(shè)正常細(xì)胞。置37 ℃,5% CO2孵育箱中吸附2 h,每隔15 min輕輕搖晃,使病毒均勻吸附。吸棄病毒液,每孔加維持液100 μL,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),逐日觀察病變程度并記錄。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn),用Reed-Muench公式計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.5 動(dòng)物分組及給藥方案

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,將BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、利巴韋林組、地塞米松組、化濕敗毒顆粒低劑量組和化濕敗毒顆粒高劑量組,每組9只。除空白組外,其余各組小鼠經(jīng)異氟烷淺麻醉后,以(4×107PFU)RSV病毒滴鼻感染,每鼠80 μL,空白組采用同法滴入等體積無菌生理鹽水。在滴鼻2 h后灌胃給藥,給藥體積為10 mL·kg-1,連續(xù)給藥3 d,每日1次?？瞻捉M和模型組小鼠給予超純水,利巴韋林組按照30 mg·kg-1·d-1給予利巴韋林溶液,地塞米松組按照30 mg·kg-1·d-1給予地塞米松溶液,化濕敗毒顆粒低劑量組給予生藥12.56 g·kg-1·d-1,化濕敗毒顆粒高劑量組給予生藥25.12 g·kg-1·d-1。

1.6 樣本采集

造模后第4天處死小鼠,解剖并采集小鼠右肺中葉用中性甲醛固定,剩余肺組織放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 肺組織病理學(xué)分析

將甲醛固定的肺組織經(jīng)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,HE染色后,通過光學(xué)顯微鏡觀察肺部形態(tài)。

1.8 炎癥因子及病毒載量檢測

稱取肺組織約15 mg于2 mL離心管中,加入裂解液500 μL,置于球磨機(jī)中勻漿10 min。離心取上清并按照試劑盒說明書提取總RNA,蛋白核酸分析儀對RNA進(jìn)行質(zhì)量分析。按照qPCR試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,SYBR Green Ⅱ qPCR法檢測肺組織中RSV-F、RSV-G、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平,基因引物序列見表1。qPCR反應(yīng)條件(采用兩步法):95 ℃預(yù)變性15 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,設(shè)置40個(gè)循環(huán),同時(shí)做熔解曲線。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 脂質(zhì)組學(xué)樣本處理

稱取肺組織約20 mg于2 mL離心管中,加入超純水200 μL,置于球磨機(jī)中勻漿10 min。取組織勻漿液20 μL于1.5 mL EP管中,加入含內(nèi)標(biāo)的冰甲醇溶液225 μL,渦旋10 s后加入750 μL MTBE于4 ℃震蕩10 min。加入預(yù)冷的超純水188 μL,渦旋20 s后于4 ℃,18 000 r·min-1離心2 min,吸取上層液體350 μL至1.5 mL EP管中,真空揮干。取揮干后的樣本加入110 μL復(fù)溶液(甲醇∶甲苯=9∶1),渦旋10 min,超聲10 min,4 ℃,18 000 r·min-1離心10 min后取上清液80 μL進(jìn)樣分析。

1.10 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS分析條件

1.10.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY CSH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流速:0.6 mL·min-1,正離子模式流動(dòng)相A:乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸;流動(dòng)相B:異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸。負(fù)離子模式流動(dòng)相A:乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1乙酸銨;流動(dòng)相B:異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1乙酸銨。流動(dòng)相梯度:0～2 min,15%→30%B;2～2.5 min,30%→48%B;2.5～11 min,48%→82%B;11～11.5 min,82%→99%B;11.5～12 min,99%B;12～13 min,99%→15%B;13～15 min,15%B。柱溫:65 ℃,進(jìn)樣量:2 μL。

1.10.2 質(zhì)譜條件 Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,HESI源。掃描模式:正(+)/負(fù)(-)離子模式。質(zhì)譜參數(shù):噴霧電壓為3.5 kV(+)和3.0 kV(-),離子源溫度為306 ℃(+)和325 ℃(-),毛細(xì)管溫度為300 ℃,鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?鞘氣流為275 kPa,輔助氣流為104 kPa,S-lens:50,掃描范圍m/z為215～1 800。

1.11 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采集樣品的圖譜信息,導(dǎo)入軟件MS-DIAL 4.24中進(jìn)行峰提取與LipidBlast脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對來鑒定脂質(zhì),得到包括化合物名稱、保留時(shí)間、保留指數(shù)及根據(jù)峰高提取的峰面積在內(nèi)的三維矩陣數(shù)據(jù)集。將得到的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入網(wǎng)站Metaboanalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca/),對數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化、Log轉(zhuǎn)化及Pareto校準(zhǔn)處理后主成分分析(PCA)、單因素方差分析(ANOVA)及非參數(shù)檢驗(yàn)法(Kruskal-Wallis test)。計(jì)算脂質(zhì)在不同組內(nèi)的差異倍數(shù)(Fold change,FC),選取FC>1.2或FC<0.83,P<0.05篩選所得的物質(zhì)為差異性代謝物。此外,脂質(zhì)代謝物富集分析基于ChemRICH(http://chemrich.fiehnlab.ucdavis.edu/)[8]。使用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析,并使用Cytoscape 3.10.0軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理觀察

各組小鼠肺組織病理切片結(jié)果顯示,空白組小鼠肺泡及各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)清晰完整,未見明顯出血和炎癥浸潤。模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理改變,表現(xiàn)為肺組織充血、水腫,肺間質(zhì)增厚,血管及支氣管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,化濕敗毒顆粒高、低劑量組及利巴韋林和地塞米松組干預(yù)后小鼠肺組織病理評(píng)分顯著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001),見圖1。

注:與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)Fig.1 HE staining results of lung tissue in each group of mice(×200)

2.2 各組小鼠肺組織病毒載量及炎癥因子水平

采用qPCR檢測小鼠肺組織病毒載量及IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:模型組小鼠肺組織RSV-F、RSV-GmRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.001),化濕敗毒顆粒低、高劑量組和利巴韋林組小鼠肺組織RSV-F、RSV-GmRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05,P<0.001)(圖2A)。此外,與空白組相比,RSV感染導(dǎo)致模型組小鼠肺組織IL-1β和TNF-αmRNA水平顯著增加(P<0.001),化濕敗毒顆粒高、低劑量組IL-1β和TNF-αmRNA水平均明顯降低(P<0.001)(圖2B)。以上結(jié)果提示化濕敗毒顆?？筛纳芌SV肺炎小鼠病毒載量及肺組織病理損傷。

注:與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,圖2 各組小鼠病毒載量及炎癥因子基因表達(dá)水平Fig.2 Gene expression levels of viral load and inflammatory factors in each group of mice

2.3 各組小鼠肺組織脂質(zhì)組學(xué)變化

2.3.1 脂質(zhì)成分分析 根據(jù)肺組織病理觀察、病毒載量及炎癥因子水平分析結(jié)果,選取空白組、模型組、化濕敗毒顆粒高劑量組進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。樣本經(jīng)UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS檢測,檢測過程中,監(jiān)測內(nèi)標(biāo)在樣本中的峰高值,計(jì)算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%,說明本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)操作與儀器條件相對穩(wěn)定。

分別從正、負(fù)離子模式下隨機(jī)選取一個(gè)樣本,其總離子流圖(TIC)見圖3A～B,各組圖譜基本相似。如圖4A通過MS-DIAL軟件及LipidBlast數(shù)據(jù)庫鑒定脂質(zhì),共鑒定出5個(gè)脂質(zhì)大類,25個(gè)脂質(zhì)亞類。其中正離子模式下鑒定出脂質(zhì)350個(gè),負(fù)離子模式下鑒定出脂質(zhì)246個(gè),主要為雙(單?；视?磷酸酯[Bis(monoacylglycero)phosphate,BMP]、肉堿(Carnitine,Car)、神經(jīng)酰胺(Ceramide,Cer)、己糖神經(jīng)酰胺(Hexosylceramide,HexCer)、甘油二酯(Diacylglycerol,DG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、N-?；掖及?N-acylethanolamine,NAE)、磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)、鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)、溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine,lysoPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine,lysoPE)、溶血磷脂酰甘油(Lysophosphatidylglycerol,lysoPG)、心磷脂(Cardiolipin,CL)、脂肪酸(Fatty acid,FA)、甾醇脂質(zhì)(Sterol lipid,ST)、醚磷脂酰膽堿(ether phosphatidylcholine,PC O)、醚磷脂酰乙醇胺(ether phosphatidyethanolamine, PE O)、醚溶血酰磷脂酰膽堿(ether lysophosphatidylcholine,LPC O)等。

注:A.正離子模式下各組樣本的總離子流圖;B.負(fù)離子模式下各組樣本的總離子流圖圖3 總離子流圖Fig.3 Total ion current plot

正、負(fù)離子模式下各組數(shù)據(jù)集繪制PCA圖,圖4B～C中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,空白組、模型組、化濕敗毒顆粒高劑量組3組之間具有較好的區(qū)分度,提示3組小鼠肺組織脂質(zhì)組成存在顯著差異。

注:A.正負(fù)離子模式下RSV肺炎小鼠肺組織中檢測到的脂質(zhì)旭日圖;B.正離子模式下各組樣本的PCA圖;

2.3.2 差異脂質(zhì)分析 以FC>1.2或FC<0.83,P>0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異脂質(zhì)。正離子模式下篩選出22個(gè)TG、11個(gè)PC、2個(gè)SM、2個(gè)DG、1個(gè)PG、1個(gè)LPC、1個(gè)HexCer,負(fù)離子模式下篩選出4個(gè)PC、2個(gè)FA、2個(gè)SM、1個(gè)PS、1個(gè)Cer,結(jié)果見表2。對所得差異脂質(zhì)進(jìn)行熱圖分析如圖5A～B,各方塊代表樣品中特定脂質(zhì)的強(qiáng)度值,顏色從紅色到藍(lán)色的轉(zhuǎn)變表示強(qiáng)度值從大變小,從圖中可以看出空白組、模型組與化濕敗毒顆粒組顯著區(qū)分。圖5C顯示,與空白組相比,模型組中TG、PS總體呈下降趨勢(P<0.05,P<0.001),SM、Cer、HexCer、DG、FA、PG、PC O、LPC O等呈上升趨勢(P<0.05,P<0.01,P<0.001),提示RSV感染會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織脂質(zhì)代謝紊亂;而化濕敗毒顆粒干預(yù)后,除SM外,其余差異脂質(zhì)均出現(xiàn)明顯回調(diào)(P<0.05,P<0.01),提示化濕敗毒顆粒對RSV感染引起的脂質(zhì)代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用。

注:A.正離子模式下小鼠肺組織差異脂質(zhì)熱圖;B.負(fù)離子模式下小鼠肺組織差異脂質(zhì)熱圖;C.差異表達(dá)脂質(zhì)亞類盒須圖;D.與空白組比較,模型組差異脂質(zhì)富集分析圖;E.與模型組比較,化濕敗毒顆粒低劑量組差異脂質(zhì)富集分析圖。D～E圖中,紅色代表脂質(zhì)類別呈上調(diào)趨勢,藍(lán)色代表脂質(zhì)類別呈下調(diào)趨勢,紫色代表該脂質(zhì)類別既有上調(diào)脂質(zhì)又有下調(diào)脂質(zhì),氣泡大小與脂質(zhì)數(shù)量呈正相關(guān)。與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖5 小鼠肺組織差異脂質(zhì)分析Fig.5 Differential lipid analysis of mouse lung tissue

表2 正負(fù)離子模式肺組織差異脂質(zhì)Table 2 Lung differential lipids in positive and negative ion mode

(續(xù)表)

通過ChemRICH聚類分析進(jìn)一步分析脂質(zhì)代謝變化,如圖5D～E,每個(gè)氣泡代表有顯著變化的脂質(zhì)亞類(P<0.05),節(jié)點(diǎn)大小反映每個(gè)脂質(zhì)亞類中包含的脂質(zhì)總數(shù)。結(jié)果表明,甘油磷脂、鞘脂、脂肪酸、甘油脂等均發(fā)生顯著變化,提示脂質(zhì)在RSV肺炎中存在重要作用。與空白組相比,模型組有20種脂質(zhì)類別發(fā)生顯著變化。如圖5D,除TG和醚磷脂酰乙醇胺(Ether phosphatidylethanolamine,PE O)部分下調(diào)外,其余脂質(zhì)類別總體呈上升趨勢。圖5E顯示化濕敗毒顆粒治療后,其中8個(gè)脂質(zhì)亞類出現(xiàn)回調(diào)(P<0.05)。結(jié)合脂質(zhì)分子種類和脂質(zhì)亞類的研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)化濕敗毒顆?？梢燥@著回調(diào)RSV感染引起的大部分脂質(zhì)變化。因此,我們推測化濕敗毒顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)肺組織脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)來改善RSV肺炎。

2.3.3 差異脂質(zhì)相關(guān)性研究 對差異表達(dá)脂質(zhì)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,根據(jù)P<0.001和Spearman相關(guān)系數(shù)r>0.75或r<-0.75,觀察到正離子模式下35種脂質(zhì)和負(fù)離子模式下7種脂質(zhì)存在顯著相關(guān)性。如圖6A～B所示,正離子模式下PC O(36∶4)、LPC O(16∶0)、PG(36∶2)、PC O(38∶5)和TG(18∶1/18∶2/22∶5)等脂質(zhì)有顯著相關(guān)(邊≥27)。負(fù)離子模式下PC(16∶0/20∶4)、PC(14∶0/16∶0)、PC O(16∶1/16∶0)等脂質(zhì)表現(xiàn)出顯著相關(guān)(邊≥4)。脂質(zhì)之間的高度相關(guān)性表明化濕敗毒顆?？赡芡ㄟ^脂質(zhì)之間的相互作用來調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

注:A.正離子模式下差異脂質(zhì)互作圖(35個(gè)節(jié)點(diǎn),366條邊);B.負(fù)離子模式下差異脂質(zhì)互作圖(7個(gè)節(jié)點(diǎn),11條邊)。通過P<0.001和Spearman相關(guān)系數(shù)r>0.75或r<-0.75篩選。圖6 差異脂質(zhì)互作分析Fig.6 Differential lipid interaction analysis

3 討論

RSV感染通常表現(xiàn)為肺組織中病毒的大量復(fù)制(RSV-F、RSV-G等病毒蛋白基因高表達(dá))以及炎癥因子升高[9]?；瘽駭《绢w粒具有化濕解毒,宣肺瀉熱功效,臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)其治療新型冠狀病毒感染效果顯著。研究發(fā)現(xiàn),化濕敗毒顆粒含有的槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黃芩素等有效成分具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制病毒復(fù)制、降低炎癥因子水平的作用[6]。本研究以RSV滴鼻接種來建立RSV感染肺炎小鼠模型,以模型組小鼠肺泡上皮細(xì)胞損傷,肺間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤,肺組織RSV病毒載量顯著升高,表明小鼠RSV肺炎模型建立成功?；瘽駭《绢w粒干預(yù)治療可顯著改善小鼠肺組織病理損傷,降低RSV-F、RSV-G、IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)水平,說明化濕敗毒顆粒對RSV肺炎具有治療作用。

脂質(zhì)是細(xì)胞膜和激素的主要成分,能夠儲(chǔ)存能量、傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào),在人體中發(fā)揮重要作用[10]。由于細(xì)胞和器官功能對脂質(zhì)的依賴,脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝對人體具有系統(tǒng)性影響,并且可以作為特殊的健康參數(shù)反映身體狀況[10]。本實(shí)驗(yàn)基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS高分辨率質(zhì)譜,分析小鼠肺組織中的脂質(zhì)組分,探究RSV肺炎對肺脂質(zhì)代謝的影響。比較發(fā)現(xiàn)RSV感染可引起小鼠肺組織中PC O、Cer、SM、FA、DG顯著升高,TG顯著降低。PC O即醚磷脂酰膽堿,是脂質(zhì)過氧化的底物。研究表明,醚磷脂的生物合成是促進(jìn)鐵死亡發(fā)生的主要原因之一[11],降低醚磷脂的水平可以保護(hù)細(xì)胞中GPX4蛋白活性,抑制鐵死亡發(fā)生[12-13],提示RSV感染可能會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生,化濕敗毒顆粒可以通過降低PC O水平而改善這種現(xiàn)象。Cer是SM的代謝中間體,二者可以調(diào)控細(xì)胞生長、死亡、衰老、免疫反應(yīng)以及自噬等[14]。同時(shí),SM還對病毒的感染入侵有一定的影響[15]。本研究發(fā)現(xiàn)RSV感染會(huì)導(dǎo)致肺組織中SM及Cer的含量顯著增加,可能與RSV感染引起的細(xì)胞凋亡、自噬等有關(guān),化濕敗毒顆?？刹糠指纳芐M及Cer的升高,抵抗病毒入侵。FA、DG、TG是人體主要的儲(chǔ)能物質(zhì)[16],可為機(jī)體的基礎(chǔ)代謝提供必需的能量,與免疫炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。RSV感染會(huì)導(dǎo)致肺組織中FA及TG降低、DG升高,這可能與病毒入侵后,小鼠食欲減弱,熱量需求增加等有關(guān)。研究表明TG水平的下降,不利于保護(hù)機(jī)體耐受炎癥[17]。DG水平增加可能會(huì)導(dǎo)致TCR信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制[18],RSV免疫逃逸,小鼠肺炎程度進(jìn)一步加劇?；瘽駭《绢w粒干預(yù)使FA、DG、TG等脂質(zhì)的紊亂得以恢復(fù),改善肺部微環(huán)境,緩解RSV肺炎。

綜上所述,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化濕敗毒顆粒對RSV感染誘導(dǎo)的小鼠肺炎具有治療作用,利用脂質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)化濕敗毒顆粒療效機(jī)制可能與通過調(diào)控脂質(zhì)代謝水平、緩解脂質(zhì)代謝紊亂,從而改善肺組織細(xì)胞的死亡和凋亡有關(guān)(圖7)。

圖7 化濕敗毒顆粒調(diào)節(jié)肺脂質(zhì)改善RSV肺炎Fig.7 Huashi Baidu granules improve RSV pneumonia through regulating of lung lipids