賴夢亭,麥麥提敏·麥提薩伍爾,李彤,肖平,宿樹蘭,段金廒

(南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇 南京 210023)

中藥多糖因其資源豐富、來源天然、生物活性好、毒副作用小等優(yōu)勢成為近年來天然藥物的研究熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用,臨床常用作免疫調(diào)節(jié)劑[2-3],如香菇多糖具有顯著的抗腫瘤活性,在臨床上被用作抗腫瘤的佐劑,配合放化療藥物使用可以起到增強機體免疫力、減輕不良反應的作用[4]。多糖類成分是板藍根的主要活性成分之一,具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[5-7],但未經(jīng)脫蛋白的板藍根多糖中含有大量的蛋白質(zhì)雜質(zhì),難以實現(xiàn)質(zhì)量控制,與多糖結(jié)合的蛋白會干擾多糖結(jié)構(gòu)分析和生物活性研究,甚至影響多糖生物活性的發(fā)揮,因此對多糖進行脫蛋白處理是探究多糖結(jié)構(gòu)及生物活性的重要內(nèi)容。常用的脫蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸法和大孔樹脂分離法等,但上述方法存在操作過程繁瑣、脫蛋白效率低、有機溶劑用量大且不易去除等缺點,而酶法具有不破壞多糖原有結(jié)構(gòu)、脫蛋白效率高、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點[8]。

斑馬魚的基因序列與人類基因有87%相似度,免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)與哺乳動物高度類似[9]。斑馬魚幼魚主要依賴固有免疫,免疫細胞類型包括巨噬細胞和中性粒細胞,斑馬魚體型小、胚胎及幼魚透明、繁殖能力強、發(fā)育迅速,借助化學染色手段以及免疫細胞熒光標記轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚,在高分辨顯微鏡下可以實現(xiàn)斑馬魚活體成像、細胞追蹤和器官觀察[10]。

本研究以多糖保留率和蛋白脫除率的綜合評分為指標,通過單因素實驗和Box-Behnken響應面法篩選酶種類和酶解條件,確定最佳酶法除蛋白工藝。并對脫蛋白前后的板藍根多糖進行了紫外掃描、紅外光譜、分子量測定,測定了脫蛋白板藍根多糖的單糖組成。進一步評價脫蛋白后的板藍根多糖對免疫低下斑馬魚免疫細胞、免疫因子的影響,以期為板藍根多糖的開發(fā)利用與質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ENSPIRE多功能酶標儀(美國PerkinElmer公司);Z323K低溫高速離心機(德國Beckman公司);G-9雙光路紫外掃描儀(南京菲勒儀器有限公司);FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司);Waters2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);ESEN-AW-RC2-SS小型水體循環(huán)單元(北京愛生科技發(fā)展有限公司);BSG-300光照培養(yǎng)箱(博迅生物儀器);DFC17000T體式熒光顯微鏡(Leica Microsystems公司)。

1.2 動物

中性粒細胞熒光標記的轉(zhuǎn)基因Tg(lyz:DsRed)系斑馬魚和野生型AB系斑馬魚均購自南京堯順禹生物技術有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境按照明暗14 h/10 h控光,水溫(28±0.5) ℃,每天喂食新鮮豐年蝦2次。斑馬魚前一天晚上按照雌雄比例1∶2于產(chǎn)卵缸中配對產(chǎn)卵,次日上午8:00抽板,2 h后收取受精卵培養(yǎng)成幼魚用于后續(xù)試驗。

1.3 試劑與藥物

板藍根購自亳州紫瑞藥業(yè)(批號:248210808),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定為十字花科菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根。牛血清白蛋白標準品(北京索萊寶科技有限公司,貨號:128K053);考馬斯亮藍G-250(Biosharp公司,貨號:21260625)、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司,批號:L22A8Y34505,M05GS140428,P09N11B130551);胃蛋白酶(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20211103);D-無水葡萄糖標準品、DL-阿拉伯糖、D-甘露糖(成都樂美天醫(yī)藥科有限公司, 貨號:DSTDW000501,DSTDA003801,DSTDG004701);D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖(上海源葉生物科技有限公司,貨號:K07J12B133073,27GB155998,O27GS165538);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(Solarbio公司,貨號:1029D022);三氟乙酸、中性紅(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:C10672531、C11611183);三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20210507);鹽酸左旋咪唑、氯霉素、羧甲基纖維素鈉、苯基硫脲(上海源葉生物科技有限公司,貨號:N16HS201037、M23HS179080、J14HS173796、S26GS160906);IL-6、IL-1β試劑盒(湖南艾方生物科技有限公司,批號:AF20230907、AF20230910)。

2 方法

2.1 板藍根多糖提取

取板藍根飲片200 g,加入8倍量去離子水浸泡1 h,回流提取3 h,以100目尼龍篩三疊之后過濾煎液,濾渣與去離子水比例為1∶4 (g·mL-1),第2次回流1 h,過濾后合并2次水煎液。4 000 r·min-1離心10 min去除沉淀,上清液備用。

2.2 綜合評分計算方法

以苯酚硫酸法測定多糖保留率,考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)脫除率,參考文獻采取加權計算法,引入綜合評分的概念[11],多糖保留率賦分40%,蛋白脫除率賦分60%,計算公式如下。

多糖保留率(Y1)=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100%;

(1)

蛋白脫除率(Y2)=(脫蛋白前蛋白含量-脫蛋白后蛋白含量)/脫蛋白前蛋白含量×100%;

(2)

綜合評分Y=(Y1×40%+Y2×60%)×100%。

(3)

2.3 單因素試驗

對酶種類(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)、酶活(100、200、30、400、500、600 U·mL-1)、pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9、9.5)、溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)和酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)進行單因素考察。在考察某一因素時,固定其他因素為前一次試驗的最佳試驗結(jié)果,酶種類考察時確定所有酶的酶活為200 U·mL-1,其余條件為該酶最適條件。平行3次試驗。酶解后立刻轉(zhuǎn)移到100 ℃水浴鍋水浴30 min滅酶,4 000 r·min-1離心20 min去除加入的蛋白酶,取上清液測定多糖和蛋白質(zhì)含量,根據(jù)“2.2”項下方法計算綜合評分。

2.4 響應面優(yōu)化酶法脫蛋白工藝

實驗因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計Table 1 Box-Behnken experimental design

基于單因素實驗結(jié)果,采用Design-Expert V8.0.6軟件的Box-Behnken進行響應面設計,以綜合評分為響應值。

2.5 板藍根多糖理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 IRPS制備和成分測定 水提液經(jīng)80%醇沉過夜得板藍根粗多糖,而后按照酶法脫蛋白最佳工藝處理得到脫蛋白多糖命名為IRPS(Isatidis radix polysaccharides,IRPS)。采用苯酚硫酸法測定總糖含量,采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量。

2.5.2 紫外-可見光掃描 稱取脫蛋白前后的多糖樣品溶于水配成10 mg·mL-1的溶液,純水作為空白,采用紫外掃描儀進行200～800 nm全波長掃描。

2.5.3 傅里葉紅外光譜分析 稱取脫蛋白前后的多糖樣品與KBr按照1∶100的比例研磨制片,用傅里葉變換紅外光譜儀掃描,光譜范圍為中紅外4 000～400 cm-1。

2.5.4 掃描電鏡分析 取少量脫蛋白前后多糖,噴金處理后,用熱場發(fā)射掃描電鏡在100、500和5 000倍鏡下觀察二者的表面微觀結(jié)構(gòu)。

2.5.5 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定2種多糖的分子質(zhì)量。檢測器為Waters2414型示差折光檢測器(Refractive index detector,RID);色譜柱為凝膠柱TSK-gel G5000PW串聯(lián)TSK-gel G3000PW(8.0 mm×300 mm, 6 μmol·L-1);流動相:0.1 mol·L-1硝酸鈉;流速為0.4 mL·min-1;柱溫35 ℃;進樣體積為10 μL。

取已知分子量的葡聚糖系列標準品(0.1、2.7、5.25、9.75、13.05、36.8、64.65、135.3、300.6 kDa),分別用0.1 mol·L-1硝酸配制成濃度為1 mg·mL-1的標準溶液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,進行高效凝膠滲透色譜分析,以葡聚糖標準品相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgMw)為縱坐標,保留時間(t)為橫坐標,繪制標準曲線,建立回歸方程,以此計算IRPS的分子質(zhì)量。

2.5.6 IRPS單糖組成

2.5.6.1 IRPS的PMP衍生化 精密稱取IRPS樣品10 mg至安瓿瓶內(nèi),加入2 mol·L-1的三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA),用酒精噴燈熔封,于110 ℃烘箱反應4 h,旋蒸去除TFA,加入1 mL甲醇復溶,旋蒸至TFA揮干,加入1 mL超純水復溶。

精密稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸標準品各1 mg于1 mL容量瓶,用超純水定容至1 mL,配制成1 mg·mL-1的單糖溶液和混合對照品溶液備用。

取單糖混合溶液、單糖溶液、樣品溶液500 μL,加入0.3 mol·L-1的NaOH溶液75 μL,在加入10%PMP甲醇溶液150 μL,渦旋混勻,于70 ℃水浴1 h,冷卻至室溫,加入0.3 mol·L-1的HCl溶液75 μL中和pH,振搖后加入氯仿萃取3次,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。

2.5.6.2 色譜條件 色譜柱為AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)-乙腈(83∶17),等度洗脫;柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL·min-1;進樣體積10 μL,檢測波長245 nm。

2.6 板藍根多糖免疫調(diào)節(jié)作用評價

2.6.1 給藥劑量考察 隨機選擇發(fā)育至3 dpf(Day post fertilization)的健康幼魚,以每孔10條的密度置于12孔板,設置IRPS濃度梯度為0、15.62、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg·mL-1,每個濃度組設置3個復孔,給藥24 h后觀察幼魚死亡數(shù)和畸形情況。

2.6.2 斑馬魚分組及給藥 隨機選擇發(fā)育至3 dpf的健康幼魚,設置空白組,模型組,陽性藥組及50、100、200、300 μg·mL-1的IRPS給藥組于12孔板,每孔放入10條幼魚?？瞻讓φ战M每孔給予4 mL胚胎培養(yǎng)水,模型組給予150 μg·mL-1的氯霉素(Chloramphenicol, CAP)溶液,陽性藥組給予100 μg·mL-1鹽酸左旋咪唑(Levamisole hydrochloride,LH),每孔終體積為4 mL。除空白組外,其余各組均加入CAP使終濃度為150 μg·mL-1。每個濃度設置3個復孔,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6.3 免疫細胞密度 依照“2.6.2”項下方法,給藥24 h后吸盡藥液,用胚胎養(yǎng)魚水補上,于冰上麻醉,將斑馬魚側(cè)體位置于載玻片上,3%羧甲基纖維素鈉固定,在體式熒光顯微鏡下每組隨機采集10條斑馬魚的熒光顯微照片,用Image-Pro Plus 6.0軟件處理后得的熒光強度來表示免疫細胞密度。

2.6.4 巨噬細胞數(shù)目 將胚胎收集到含200 μmol·L-1苯基硫脲的胚胎養(yǎng)魚水中發(fā)育至3 dpf。依照“2.6.2”項下方法給藥,于給藥24 h后吸盡藥液,加入含中性紅染液濃度為3 μg·mL-1的胚胎養(yǎng)魚水,避光染色30 min,洗凈表面染色液,用體式顯微拍照統(tǒng)計斑馬魚頭部巨噬細胞數(shù)目。

2.6.5 IL-6、IL-1β含量 依照“2.6.2”項下方法配置給藥濃度,隨機挑選40條魚于6孔板,復6孔,給藥24 h后吸棄藥液,用超純水清洗3次,收集于離心管中,加入0.5 mL生理鹽水,破碎勻漿,15 000 r·min-1離心15 min,分離出上清液,使用BCA法檢測其蛋白含量,按照ELISA試劑盒的說明書測量斑馬魚體內(nèi)的IL-1β和IL-6含量。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果如圖1A,以綜合評分為篩選依據(jù),胰蛋白酶綜合評分最高,菠蘿蛋白酶次之,但菠蘿蛋白酶最適反應溫度為60 ℃,而胰蛋白酶為37 ℃,從節(jié)能角度考慮,本實驗選定對胰蛋白酶脫蛋白工藝進行優(yōu)化。對胰蛋白酶的pH、酶活、酶解時間考察結(jié)果如圖1B～D,選取綜合評分最高點及左右兩點即pH 7.5～8.0,酶活400～600 U·mL-1,酶解時間3～5 h,進行響應面優(yōu)化。如圖1E,溫度在35 ℃和 40 ℃時,綜合評分趨于穩(wěn)定,45 ℃以后,綜合評分下降可能與胰蛋白酶變性失活有關,而35～40 ℃胰蛋白酶最適酶解溫度為37 ℃[12]。

3.2 響應面優(yōu)化IRPS酶法脫蛋白工藝

3.2.1 回歸模型分析 采用Design-Expert V 8.0.6 軟件進行響應面設計,以綜合評分為響應值,響應面實驗設計及結(jié)果如表2。對試驗結(jié)果進行多元線性回歸和二項式擬合,得到回歸方程:Y=89.13+2.54A+1.79B-5.88C-3.60AB-1.52AC-0.13BC-14.70A2+1.50B2-19.27C2,R2=0.946說明該模型擬合度良好,能較準確地預測本實驗的脫蛋白綜合性能。

表2 Box-Behnken響應面實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface experiment result

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

Design-Expert V 8.0.6 軟件繪制酶活、酶解時間、pH對板藍根多糖脫蛋白影響的響應面圖和二維等高線圖見圖2,通過響應面3D圖和等高線圖能直觀地反映各因素交互作用的影響。在三維圖中,曲面越陡表明該因素對綜合評分的影響越大,反之則表明影響越小。等高線圖中,若中心是圓形則表明因素交互作用不顯著,若為橢圓形則表明交互作用顯著。pH和酶活的響應面曲線較陡峭,對綜合評分影響較大,而酶解時間對綜合評分的影響較小。

圖2 各因素對除蛋白影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour maps of the effects of various factors on protein removal

3.2.2 最佳工藝預測和驗證 通過Design-Expert V 8.0.6軟件設計得到板藍根多糖脫蛋白最佳工藝條件:選用胰蛋白酶,酶活497.14 U·mL-1,酶解pH=7.92,酶解時間5 h,預測綜合指標可達到92.90%。根據(jù)影響因素排列:C(pH)>A(酶活)>B(時間),結(jié)合實際試驗的情況,該條件修正為: 取胰蛋白酶酶活為500 U·mL-1,pH=7.9、8.0、8.1,酶解時間為5 h,酶解溫度37 ℃,每個條件重復3次實驗,實驗結(jié)果如圖3,當pH為8.0時,脫蛋白效果最好,3次實驗綜合指標為(91.15±0.37)%,與預測值相接近,表明優(yōu)化的試驗條件較為可信,具有實際應用價值。

圖3 響應面驗證Fig.3 Response surface verification

3.3 IRPS的結(jié)構(gòu)表征

3.3.1 多糖組成 板藍根飲片經(jīng)過熱水回流提取、酶法脫蛋白、凍干后得到IRPS,得率為3.88%(以飲片計)。經(jīng)測定IRPS總糖含量為80.59%,糖醛酸含量為18.34%。紫外-可見分光光度計對酶解前后的多糖進行200～800 nm全波長掃描,結(jié)果如圖4,酶解前(A)在280 nm處有蛋白吸收,而酶解后(B)在260 nm與280 nm處均無吸收,表明酶解法脫蛋白效果明顯,IRPS不含蛋白質(zhì)和核酸。

注:A.酶解前;B.酶解后圖4 脫蛋白前后板藍根多糖紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectra of Isatidis Radix polysaccharides before and after deproteinization

3.3.2 FT-IR分析 IRPS的FT-IR圖譜如圖5所示,在3 405.36 cm-1處的強吸收峰為氫鍵-OH伸縮振動引起的,2 932.74 cm-1處為—CH2-伸縮振動造成。1 744.25cm-1處的是C=O雙鍵伸縮振動強吸收峰,1 400～1 200 cm-1之間的兩個吸收峰由C—H變角振動引起。1 200～1 100 cm-1的兩個特征吸收峰為吡喃糖的C—O—C和C—O—H中的C—O振動吸收,在829.18 cm-1處有吸收峰,這是α-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰,762.41cm-1的吸收峰是為β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰,據(jù)此推測IRPS中含有α和β兩種構(gòu)型的糖苷鍵。

圖5 IRPS 的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of IRPS

3.3.3 電鏡 采用SEM對脫蛋白前后板藍根多糖的形態(tài)特征進行觀察,實驗結(jié)果如圖6所示。圖6a～c為脫蛋白前的粗多糖,100倍鏡下觀察脫蛋白前板藍根粗多糖呈顆粒狀,500倍鏡和5 000倍鏡下可看見脫蛋白前多糖顆粒表面有凹凸不平的微孔,是蛋白和多糖聚集的結(jié)果。同倍數(shù)下視野內(nèi)的顆粒越少說明顆粒越大,分子間范德華力的作用使蛋白和多糖緊密黏合,所以圖6a視野內(nèi)可見顆粒更多,圖6d脫蛋白后IRPS顆粒變大,可能是IRPS經(jīng)過高溫酶解膨脹、反復凍融和凍干的原因。圖6d～f為脫蛋白后IRPS,100倍鏡下脫蛋白后多糖呈顆粒狀,表面光滑是表面蛋白被脫除的結(jié)果,500倍鏡和5 000倍鏡下可看見顆粒內(nèi)孔洞變大,這是因為多糖內(nèi)部結(jié)合的蛋白被酶解。

注:a～c.酶解前;d～f.酶解后。從左到右依次為×100、×500、×5 000。圖6 脫蛋白前后板藍根多糖掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of Isatidis Radix polysaccharides before and after deproteinization

3.3.4 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜測定脫蛋白前后分子量結(jié)果如圖7所示,A為酶法脫蛋白前,B為酶法脫蛋白后。脫蛋白前后分子量圖譜呈現(xiàn)多個峰,且每個峰保留時間基本不變,表明板藍根多糖脫蛋白前后分子量沒有明顯變化。IRPS為非均一分子量多糖,根據(jù)標準曲線Y=-0.183 2X+11.731(R2=0.990 2,X為標準品的保留時間,Y為分子質(zhì)量的對數(shù)值),計算得到IRPS的相對分子質(zhì)量分布在5.82～60.26 kDa。

注:A.酶解前;B.酶解后圖7 脫蛋白前后板藍根多糖分子質(zhì)量圖Fig.7 Molecular weight map of Isatidis Radix polysaccharides before and after deproteinization

3.3.5 單糖組成 IRPS的單糖組成如圖8所示,主要由葡萄糖構(gòu)成、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成,還有少量的甘露糖、鼠李糖、半乳糖糖醛酸。它們的摩爾質(zhì)量比為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=2.17∶0.96∶2.90∶83.25∶4.88∶5.84。

注:A.標準品;B.IRPS;1.甘露糖;2.鼠李糖;3.葡萄糖醛酸;4.半乳糖醛酸;5.葡萄糖;6.半乳糖;7.阿拉伯糖圖8 IRPS 的單糖組成HPLC譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of monosaccharide composition of IRPS

3.4 板藍根多糖免疫調(diào)節(jié)作用評價

3.4.1 給藥劑量篩選 將濃度和死亡數(shù)輸入至SPSS26.0分析得到IRPS的LD50=377.238 μg·mL-1,最終確定其給藥濃度為50、100、200、300 μg·mL-1。見圖9。

圖9 IRPS給藥劑量篩選Fig.9 IRPS administration dose

3.4.2 免疫細胞密度 如圖10A所示,模型組與空白組相比,斑馬魚免疫細胞熒光強度顯著降低,說明CAP給藥后斑馬魚幼魚形成了免疫抑制模型;如圖10B,與模型組相比,IRPS在50～300 μg·mL-1免疫細胞密度升高,且IRPS濃度越高,熒光強度越大,呈現(xiàn)劑量依賴性,表明IRPS可以增加免疫低下的斑馬魚免疫細胞數(shù)目。

注:A.熒光斑馬魚顯微圖像;B.熒光強度統(tǒng)計圖。a.空白對照(Control)組;b.模型(CAP)組;c.陽性藥(LH)組;d～g.50、100、200、300 μg·mL-1IRPS組。與空白對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖10 IRPS對斑馬魚免疫細胞密度的影響Fig.10 Effect of IRPS on the density of zebrafish immune cells

3.4.3 巨噬細胞數(shù)目 如圖11A所示,模型組與空白組相比,斑馬魚頭部巨噬細胞數(shù)目明顯減少,為模型組的56.55%;與模型組相比,50～300 μg·mL-1IRPS均能使斑馬魚頭部巨噬細胞數(shù)目增加,且呈現(xiàn)劑量依賴性。

注:A.斑馬魚頭部顯微圖像;B.巨噬細胞數(shù)目統(tǒng)計圖。a.未染色正常斑馬魚頭部;b.空白對照(Control)組;c.模型(CAP)組;d.陽性藥(LH)組;e～h. 50、100、200、300 μg·mL-1IRPS組。與空白對照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖11 IRPS對斑馬魚巨噬細胞影響Fig.11 Effect of RIPS on the number of macrophages of zebrafish

3.4.4 IL-6、IL-1β含量 IL-1β和IL-6是由巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞分泌的炎癥因子,機體受到外界病原體入侵或是免疫系統(tǒng)受到損傷都能導致炎癥因子水平提高[13]。如圖12,CAP造模后,斑馬魚體內(nèi)IL-6和IL-1β含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,IRPS給藥濃度為50～300 μg·mL-1時,IL-6和IL-1β含量顯著下降(P<0.05,P<0.01);表明IRPS可以顯著降低斑馬魚體內(nèi)IL-6和IL-1β含量,具有一定免疫調(diào)節(jié)作用。

注:與空白對照(Control)組比較,##P<0.01;與模型(CAP)組比較,圖12 IRPS對斑馬魚IL-6、IL-1β 含量的影響Fig.12 Effects of IRPS on the contents of IL-6 and IL-1β in zebrafish

4 討論

多糖常與多肽/蛋白形成糖肽或者糖蛋白,這種組合會影響多糖的水溶性、結(jié)構(gòu)研究和生物活性評價,多糖脫蛋白是研究其結(jié)構(gòu)、藥理活性和構(gòu)效關系的首要和關鍵的步驟[14]。本研究篩選了不同的酶對板藍根多糖脫蛋白的能力,通過響應面試驗得到了IRPS脫蛋白的最佳工藝參數(shù)為胰蛋白酶,酶活500 U·mL-1、pH 8.0、酶解時間為5 h、酶解溫度37 ℃。結(jié)構(gòu)分析表明,酶法脫蛋白對板藍根多糖分子量基本沒有影響,其分子在5.82～60.26 kDa之間,IRPS主要含甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖。研究表明,多糖的分子量、單糖組成和糖苷鍵連接方式都會影響其免疫活性[15]。

斑馬魚實驗周期短、重復性好、操作簡單,既有細胞實驗的便捷直觀,也有小鼠實驗的整體性[16]。有研究利用AB斑馬魚和化學染色法證明了防風多糖可以增加巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)目,降低IL-6和IL-1β含量[17]。利用Tg(lyz:DsRED2)中性粒細胞轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚證明了多花黃精多糖能使中性粒細胞數(shù)目增加[18], 利用斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)褐藻多糖能夠促進NO分泌、激活NF-κB信號通路[19]。廣譜抗生素CAP具有免疫毒性,其副作用為降低中性粒細胞數(shù)目,造成免疫抑制,以150 μg·mL-1的CAP成功建立了斑馬魚免疫損傷模型,其表現(xiàn)為中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)目減少,孵化率和心率降低[20]。本研究采用CAP建立斑馬魚免疫低下模型對IRPS的免疫調(diào)節(jié)活性進行評價,發(fā)現(xiàn)IRPS濃度為50～300 μg·mL-1能夠使免疫抑制斑馬魚的中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)目增多,組織中的IL-6和IL-1β含量降低,具有較好的劑量依賴關系。IRPS的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過影響免疫細胞在生物體內(nèi)的分布,降低炎癥因子的含量發(fā)揮的。本研究采用綠色環(huán)保的酶解法去除板藍根多糖中的蛋白質(zhì),并基于斑馬魚模型評價了板藍根多糖的免疫調(diào)節(jié)活性,研究結(jié)果為板藍根多糖進一步深入研究及開發(fā)利用提供了科學依據(jù)與有益參考。