高勤,陳楠,賈樂彤,汪潔,陳靜,楊雨微,呂志陽

(南京中醫(yī)藥大學翰林學院,江蘇 泰州 225300)

青藤堿(Sinomenine)是從防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.) Rehd.et Wils.、華防己DiploclisiachinensisMerr或毛青藤Sinomeniumscutum(Thunb.) Rehd.et Wils.Ver.cirnereum Rehd.et Wils.的藤莖中提取制備的一種單體生物堿,具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[1]。目前應(yīng)用青藤堿的相關(guān)制劑主要有鹽酸青藤堿片、鹽酸青藤堿腸溶片、正清風痛寧片、正清風痛寧緩釋片等,它們均有良好的臨床療效[2]。但由于青藤堿難溶于水,對光、熱及堿不穩(wěn)定,也存在生物利用度低、半衰期短等問題,口服后可能出現(xiàn)皮炎、蕁麻疹及胃腸道不適等不良反應(yīng)[3]。

微乳(Microemulsion,ME)由水相、油相、乳化劑和輔助乳化劑組成,為低黏度且熱力學穩(wěn)定的均一相體系,其分散性好,可增強藥物的溶解度,提高生物利用度和穩(wěn)定性,制備工藝相對簡單,適宜工業(yè)化大生產(chǎn)[4-5]。本研究采用微乳為載體,以偽三元相圖及D-最優(yōu)混料法優(yōu)選青藤堿微乳的處方配比,預(yù)期能制備青藤堿的經(jīng)皮給藥制劑,可降低胃腸道不良反應(yīng),提高藥物的溶解度,并進行初步藥效學研究,為青藤堿的新劑型開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Yiii407102萬分之一電子天平(上海菁海儀器有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);TGL-18C-C 型自動平衡離心機(上海安亭科學儀器廠);MSF-101D型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市四樺儀器有限公司);HZ-D(Ⅲ)型順循環(huán)式真空泵(遵義市四樺儀器有限公司);KH-500B型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);ZEN3600動態(tài)光散射粒度分析儀(Malvern公司);NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計(上海尼潤智能科技有限公司);RYJ-12B藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品

青藤堿原料藥(陜西新湃生物科技有限公司,批號:XP20211120);鹽酸青藤堿對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:R19010F100717);甲醇(色譜純,默客公司,批號:20210213);油酸(廣東云星生物技術(shù)有限公司,批號:2022012002A);蓖麻油(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20220517);油酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20220827);無水乙醇(無錫市亞盛化工有限公司,批號:20220803);1,2-丙二醇(山東優(yōu)索華工科技有限公司,批號:20210612);聚山梨酯-80(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20210524);聚山梨酯-20(山東優(yōu)索華工科技有限公司,批號:20210326);PEG40氫化蓖麻油(山東優(yōu)索化工科技有限公司,批號:20220526)。

1.3 實驗動物

小鼠40只,雌性,體質(zhì)量20～24 g,購自徐州醫(yī)科大學,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2020-0011,實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學翰林學院實驗動物倫理委員會批準,動物倫理申請?zhí)?HLXYDL21003。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標性成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm),流動相:甲醇∶0.1%磷酸(40∶60),柱溫為30 ℃,檢測波長:262 nm,流量:1.0 mL·min-1,進樣量:10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取青藤堿對照品10.0 mg,于250 mL容量瓶中,加入甲醇至刻度線定容,超聲溶解10 min后,過0.45 μm有機濾膜,即得濃度為40 μg·mL-1的青藤堿對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取青藤堿自微乳0.5 mL,甲醇定容至10 mL,過0.45 μm微孔濾膜,續(xù)濾液即得青藤堿自微乳供試品溶液。

2.1.4 含量測定方法學考察

2.1.4.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液適量,配成濃度分別為5、10、20、40、80 μg·mL-1的系列對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣,測定峰面積。以對照品溶液濃度(X)為橫坐標, 峰面積(Y)為縱坐標, 繪制標準曲線,得到線性方程:Y=11 294X+157.6,R2=0.999 1。結(jié)果表明:青藤堿濃度在5～80 μg·mL-1范圍內(nèi),與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.4.2 精密度試驗 精密稱取濃度為20 μg·mL-1青藤堿對照品溶液10 μL,按“2.1.1”項下色譜條件,1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次及連續(xù)6 d每天測定1次,記錄峰面積并計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果表明日內(nèi)精密度RSD為1.65%,日間精密度RSD為1.97%。

2.1.4.3 重現(xiàn)性試驗 精密稱取濃度為40 μg·mL-1的青藤堿對照品溶液6份,按“2.1.1”項下方法測定青藤堿的含量,記錄峰面積并計算,峰面積RSD為1.29%,表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取青藤堿對照品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定,記錄峰面積,考察其穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,24 h內(nèi)青藤堿的峰面積RSD為0.25%,表明對照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2 青藤堿微乳處方配比初步研究

2.2.1 青藤堿在輔料中溶解度的測定 稱取過量的青藤堿原料藥,分別加入10 mL油相(油酸、油酸乙酯、蓖麻油)、乳化劑(聚山梨酯80、聚山梨酯20、PEG40氫化蓖麻油)、助乳化劑(1,2-丙二醇、無水乙醇)中混勻,30 ℃、50 r·min-1條件下,恒溫磁力攪拌30 min,取上清液,加入甲醇稀釋10倍,超聲溶解,3 000 r·min-1離心10 min,過0.45 μm有機濾膜,按“2.1.1”色譜條件下測定青藤堿的含量,比較青藤堿原料藥在不同輔料中溶解度的差異。結(jié)果顯示青藤堿在各輔料中的溶解度大小為:①油相:蓖麻油>油酸>油酸乙酯;②乳化劑:PEG40氫化蓖麻油>聚山梨酯80>聚山梨酯20;③助乳化劑:無水乙醇>1,2-丙二醇,結(jié)果見表1。

雞痘屬于高度接觸性病毒性傳染病，春夏秋冬都可能出現(xiàn)發(fā)病，但其發(fā)病嚴重以及流行多集中于秋冬季節(jié)。由于秋冬季節(jié)溫度逐漸降低，濕度較大，會使得雞痘的傳染速度有一定的提升。在這樣的情況下，如果秋天多雨的情況下，應(yīng)提前做好雞痘的預(yù)防措施。

表1 青藤堿在各輔料中溶解度Table 1 Solubility of sinomenine in excipients

2.2.2 乳化劑與助乳化劑的配伍實驗 選取溶解度較大的蓖麻油、油酸為油相,以聚山梨酯80、PEG 40氫化蓖麻油為乳化劑,以無水乙醇、1,2-丙二醇為助乳化劑,固定總質(zhì)量為10 g,以油相∶乳化劑∶助乳化劑=1∶2∶1混合,在磁力攪拌器30 ℃、50 r·min-1條件下攪拌30 min,混合溶液中加入50 mL蒸餾水,觀察有無相變點、成乳時間、溶液顏色及穩(wěn)定性等,依據(jù)表2的評價標準進行等級分類[6],得出以蓖麻油為油相,PEG40氫化蓖麻油為乳化劑,無水乙醇為助乳化劑時,配伍后相容性和乳化性較好,實驗結(jié)果見表3。

表2 乳化等級分類Table 2 Emulsification grade classification

表3 青藤堿微乳輔料配伍實驗結(jié)果Table 3 Experimental results of sinomenine microemulsion excipient compatibility

2.2.3 偽三相圖的繪制 根據(jù)溶解度測定與配伍實驗結(jié)果,綜合選擇以蓖麻油為油相,PEG40氫化蓖麻油為乳化劑,無水乙醇為助乳化劑,蒸餾水為水相,在(30.0±0.5) ℃下用水滴定法構(gòu)建青藤堿微乳偽三元相圖。固定體系總質(zhì)量為5.0 g,按乳化劑與助乳化劑按質(zhì)量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)配制成混合乳化劑,混合乳化劑(Smix)與蓖麻油按(1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1)質(zhì)量比混勻,磁力攪拌下滴加蒸餾水至體系從澄清透明狀變?yōu)榈{色乳光或渾濁時,記錄加水量。以選定的Smix比例、油相和水相為3個頂點,采用Origin 2018 Pro 版軟件繪制偽三元相圖,結(jié)果見圖1。將能形成澄清或帶有藍色乳光的實驗點定為偽三元相圖中可形成微乳的處方點,各處方點有其對應(yīng)數(shù)值,綜合比較數(shù)值大小,最終得到可形成微乳時油相、Smix、水的范圍分別為7.0%～89.0%,10.0%～69.0%,1.0%～40.0%。將這些點連接后與水相頂點形成的封閉區(qū)域,即為成乳區(qū)。計算成乳面積,微乳區(qū)域面積越大,則處方越穩(wěn)定,Km值為3∶1時面積最大,按此配比采用D-最優(yōu)混料設(shè)計進行后續(xù)微乳處方優(yōu)化。

圖1 偽三元相圖Fig.1 The pseudo-ternary phase diagrams

2.3 D-最優(yōu)混料實驗設(shè)計法優(yōu)化處方配比

2.3.1 實驗設(shè)計 D-最優(yōu)混料實驗設(shè)計具有預(yù)測精度高、多目標同步優(yōu)化等特點,本研究以油相的用量(X1)、Smix的用量(X2)和水的用量(X3)為自變量(3相質(zhì)量分數(shù)總和為1),以平均粒徑(Y),載藥量(Z)為因變量,采用D-最優(yōu)混料設(shè)計對微乳處方進行優(yōu)化,根據(jù)偽三元相圖初步確定的油相、Smix、水的用量范圍設(shè)計實驗處方配比,見表4。稱取油相、Smix,于30 ℃、50 r·min-1磁力攪拌5 min混勻后,加入適當青藤堿原料藥,磁力攪拌混勻,再加入處方量的蒸餾水,同等轉(zhuǎn)速下磁力攪拌30 min,即得青藤堿微乳,平均粒徑及載藥量實驗結(jié)果見表4。

表4 D-最優(yōu)混料設(shè)計及結(jié)果Table 4 D-optimal mixture design and n=3)

根據(jù)平均粒徑的大小進行評分,因平均粒徑的大小在18.86～192.03 nm的范圍內(nèi),均符合微乳粒徑要求,粒徑越小其吸收效果越好,故粒徑評分1～20 nm為100分,21～40 nm為90分,以此類推每20 nm為一個等級。載藥量的范圍為0.040%～7.446%,載藥量越大越好,載藥量評分7.50%≤Z<6.75%為100分,6.00%≤Z<6.75%為90分,以此類推每0.75%為一個等級。綜合評分(M)為粒徑和載藥量評分之和,結(jié)果見表4。

2.3.2 模型擬合及效應(yīng)面分析 采用Minitab軟件對表4中的16組試驗數(shù)據(jù)進行分析,建立回歸模型,得到平均粒徑(Y),載藥量(Z)以及綜合評分(M)的回歸方程:

從平均粒徑(Y)和載藥量(Z)的回歸方程可以得出:平均粒徑、載藥量以及綜合評分的回歸模型的顯著性水平P<0.05,表明該模型與真實數(shù)據(jù)之間具有較高的擬合度。而模型失擬項P>0.05,表示模型預(yù)測值與實際值失去擬合的概率小,失擬項不顯著,進一步說明了模型預(yù)測可信度良好,可用于最優(yōu)處方的分析及預(yù)測。

2.3.3 D-最優(yōu)混料優(yōu)化分析 根據(jù)回歸模型繪制混合等值線圖和混合曲面圖,可以直觀地反映各因素對于結(jié)果的影響。由圖2可以看出,當X1減小,X2增加時,綜合評分增加;當X2比例增加時,綜合評分先增大后減小再增大;由圖3可以看出,當X3比例減小時,綜合評分增加,當X1的比例增加時,載藥量先減少再增加;由圖4可以看出,當X2比例增大時,綜合評分先減少再增加,當X3的比例增加時,載藥量先減少再增加。而綜合三者可以看出,減小X1的比例,適當提高X2,X3的比可以提高綜合評分。根據(jù)回歸模型分析且考慮實際操作的可行性,最終可以得到最優(yōu)處方為7.0%蓖麻油,69.0%混合乳化劑(其中包括51.75%PEG40氫化蓖麻油和17.25%無水乙醇)以及24.0%的蒸餾水。

圖2 X1和X2添加量配比對綜合評分的影響Fig.2 The effect of the ratio of X1 and X2 on the comprehensive score

圖3 X1和X3添加量配比對綜合評分的影響Fig.3 The effect of the ratio of X1 and X3 on the comprehensive score

圖4 X2和X3添加量配比對綜合評分的影響Fig.4 The effect of the ratio of X2 and X3 on the comprehensive score

2.4 青藤堿微乳的質(zhì)量評價

圖5 青藤堿微乳的粒徑分布圖Fig.5 The particle size distribution of sinomenine microemulsion

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取青藤堿微乳樣品置離心管中于3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min,無分層現(xiàn)象。精密稱取青藤堿微乳,密封于西林瓶中,室溫放置30 d,分別于第0、1、3、5、10、15、30天取樣檢測,其外觀性狀良好,未分層,藥物含量無明顯變化。

2.4.3 載藥量測定 精密吸取青藤堿微乳1 mL,加入蒸餾水稀釋10倍,超聲使溶解均勻,過0.45 μm濾膜,按“2.1.1”所述色譜條件測定,記錄峰面積并計算,得到其載藥量為5.225%。

2.5 透皮釋放實驗

2.5.1 離體皮膚的制備 大鼠剔除背部毛,斷頸處死,剝離背部無損傷皮膚,去除皮下脂肪組織和血管,用生理鹽水沖洗干凈,置于少量生理鹽水中,置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 透皮實驗方法 將離體皮膚固定在擴散池裝置上,向接收池中加入配套的轉(zhuǎn)子以及pH6.8的磷酸緩沖鹽,排盡氣泡,恒溫水浴溫度調(diào)至32 ℃,分別向供給池中加入1.0 g的1%青藤堿水溶液、1%青藤堿微乳(n=3),均勻分布在離體鼠皮表面,分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣1 mL[7-8],并迅速補充同體積等溫度的空白接收液,樣品以0.45 μm的微孔濾膜過濾,按照2.1項下建立的青藤堿含量測定的色譜條件,測定青藤堿的含量,按照公式(1)計算各時間點的單位面積累積透過量(Q,μg·cm-2)。

n-1
Qn=(V接*Cn+∑Ci*V吸)/Ai=1

(1)

其中V接為接收液體積;V吸為每次取樣的體積;A為皮膚有效透皮面積(2.2 cm2);Cn為第n個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1);Ci為第i(i≤n-1)個取樣點的藥物濃度(μg·mL-1),以時間t為橫坐標,Qn為縱坐標作圖,對曲線進行線性回歸,求得直線斜率即為穩(wěn)態(tài)滲透速率Js(μg·cm-2·h-1),結(jié)果可見表5,圖6。

表5 青藤堿各體系體外透皮吸收的比較(n=3)Table 5 Comparison of transdermal absorption of sinomenine systems in vitro (n=3)

圖6 不同體系青藤堿的滲透動力學曲線Fig.6 Osmotic kinetic curves of sinomenine in different systems

實驗結(jié)果表明:1%青藤堿水溶液及1%青藤堿微乳12 h累積滲透量分別為1.003 1、1.223 4 μg·cm-2。穩(wěn)態(tài)滲透速率分別為0.046 0、0.064 9 μg·cm-2·h-1。1%青藤堿微乳12 h累積滲透量及滲透速率均高于1%青藤堿水溶液,可見青藤堿微乳具較好的透皮滲透能力。

2.6 耳腫脹實驗

選取ICR雌性小鼠40只,隨機分為5組,每組8只,分別為空白對照組、模型組(空白微乳組)、低、高濃度青藤堿微乳組(0.5 g·kg-1, 2.0 g·kg-1)和陽性對照組(地塞米松組,0.005 g·kg-1)。按照上述劑量在小鼠耳廓涂抹給藥,每天3次,連續(xù)4 d,第4天給藥1 h后,對各組小鼠右耳給予二甲苯致炎,每只0.05 mL,45 min后將小鼠脫頸椎處死,剪下雙耳,用直徑為7 mm打孔器將雙耳相同部位打下圓耳片,稱定質(zhì)量,由公式(2)計算各組腫脹度,由公式(3)求出腫脹率[9],由公式(4)求出抑制率,見表6。

表6 青藤堿微乳對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Table 6 Effect of sinomenine microemulsion on xylene induced ear swelling in n=8)

腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量

(2)

腫脹率=(腫脹度/左耳質(zhì)量)×100%

(3)

抑制率=(模型組腫脹率-給藥組腫脹率)/模型組腫脹率×100%

(4)

實驗結(jié)果表明,低濃度、高濃度青藤堿微乳組及陽性對照組小鼠耳腫脹度分別為:40.0、24.2、16.6 mg,其抑制率分別為:13.95%、65.07%、74.18%。與模型組相比,各給藥組耳腫脹度均顯著下降(P<0.01),青藤堿微乳可顯著抑制小鼠耳腫脹而呈現(xiàn)出抗炎活性,且當給藥劑量為2.0 g·kg-1時抑制率可達65.07%,接近陽性藥物地塞米松組,與低濃度組具有顯著性差異,抗炎效果較好。

3 討論

微乳制劑是由乳化劑、助乳化劑、油相和水相組成,對藥物具較好的增溶能力,作為經(jīng)皮給藥制劑的載體受到了廣泛關(guān)注。其中油相是微乳的重要載體,在青藤堿微乳的處方優(yōu)化過程中全面考察其在油酸、油酸乙酯及蓖麻油中的溶解性及配伍效果,青藤堿在蓖麻油中溶解度最高,可提高微乳的載藥量和乳化效果,也可降低乳化劑和助乳化劑的需求,綜合優(yōu)選蓖麻油為油相[10]。乳化劑選擇PEG40氫化蓖麻油,青藤堿在其中溶解性較好,配伍實驗中乳化過程迅速,體系未出現(xiàn)分成現(xiàn)象。無水乙醇為助乳化劑,具有良好的溶解及乳化能力,有一定的經(jīng)皮吸收促進作用,且無明顯皮膚刺激性[11]。采用偽三元相圖,確定Km值為3∶1時形成微乳區(qū)域面積最大,為D-最優(yōu)混料設(shè)計提供依據(jù),該方法適用于微乳處方組成確定,優(yōu)化油相、混合乳化劑及水相的配比,青藤堿微乳粒徑越小,載藥量越大為佳,優(yōu)化后的青藤堿微乳粒徑小于20 nm,載藥量也顯著提高,適合于經(jīng)皮給藥,最終篩選出青藤堿微乳的最優(yōu)比例及最佳制備工藝。

青藤堿微乳為經(jīng)皮給藥制劑,藥物皮膚局部的經(jīng)皮吸收情況直接影響到其藥效,1%青藤堿微乳12 h累積滲透量為1.223 4 μg·cm-2,相比水溶液組提高了21.96%,是因為青藤堿微乳粒徑顯著減小,比表面積增大,增加了與皮膚的接觸面積,利于藥物的透皮吸收;另外微乳中的乳化劑及助乳化劑本身可以通過增溶、增加角質(zhì)層的水化作用以及破壞脂質(zhì)雙分子層來促進藥物滲透[12]。青藤堿微乳對小鼠耳腫脹度和抑制率與陽性藥地塞米松相近,也顯示出了較好的抗炎作用。本研究采用D-最優(yōu)混料設(shè)計法優(yōu)化青藤堿微乳處方,制備出藥物釋放率高,性質(zhì)穩(wěn)定,抗炎效果較好的青藤堿微乳制劑,能夠較好的解決青藤堿溶解度低、穩(wěn)定性差等問題。后期將繼續(xù)開展微乳制劑長期穩(wěn)定性實驗以及系統(tǒng)全面的藥效學評價研究,以期為青藤堿經(jīng)皮給藥制劑的研究開發(fā)提供參考。