黃玉鳳 李菲 汪漢成 蔡劉體 陳興江 邱學柏

黃玉鳳，李 菲，汪漢成，等. 煙草鐮刀菌根腐病病原生物學特性及其優(yōu)勢種的代謝表型特征［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2024，52（7）：124-132.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.017

（1.貴州師范大學生命科學學院/西南喀斯特山地生物多樣性保護國家林業(yè)和草原局重點實驗室，貴州貴陽 550001；2. 貴州省煙草科學研究院，貴州貴陽 550081）

摘要：為明確煙草鐮刀菌根腐?。╰obacco Fusarium root rot）病原生物學特性和代謝表型特征，采用菌絲生長速率法和活體接種法分別測定了3種煙草鐮刀菌根腐病病原［腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、木賊鐮刀菌（Fusarium solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］在不同溫度、光照條件下的生長速率和致病力，同時采用Biolog代謝表型技術(shù)測定其優(yōu)勢種腐皮鐮刀菌的碳氮源、滲透壓和pH值下的代謝表型。結(jié)果表明，3種病原菌菌絲生長適宜溫度均為25～30 ℃，木賊鐮刀菌M417菌絲生長速率最快，可達10.71 mm/d；腐皮鐮刀菌F421產(chǎn)孢量最高，可達9.15×10.6 個/cm2；連續(xù)黑暗條件均有利于菌絲生長和產(chǎn)孢。尖孢鐮刀菌J419和腐皮鐮刀菌F503致病力較強，7 d時的病斑面積分別為1.05 cm2和1.35 cm2。代謝表型結(jié)果表明，腐皮鐮刀菌碳氮源代謝能力強，可高效代謝丙三醇、D-甘露醇、D-松二糖等54種碳源，以及L-鳥氨酸a-氨基-N-戊酸、L-鳥氨酸等大部分氮源；其pH值適應范圍為3.5～8.5，最適pH值為6，表現(xiàn)出強脫羧酶活性和弱脫氨酶活性；在1%～5.5% NaCl、5%～10%乙二醇、1%甲酸鈉、2%～3%尿素、7%～9%乳酸鈉、10～50 mmol/L硫酸銨（pH值=8）、10～100 mmol/L硝酸鈉、10～40 mmol/L亞硝酸鈉等環(huán)境下均可正常生長。研究結(jié)果揭示了3種鐮刀菌屬根腐病病原的生物學特性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢種腐皮鐮刀菌的營養(yǎng)需求廣、具有較強的滲透壓和pH值環(huán)境適應能力，為鐮刀菌根腐病災變規(guī)律的研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：煙草根腐?。荤牭毒鷮?；生物學特性；代謝表型

中圖分類號：S435.72? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0124-09

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，被廣泛種植并用于生產(chǎn)香煙、雪茄等煙草制品［1］。然而，煙草種植過程中常常受到多種病害的威脅，其中一種真菌性土傳病害——鐮刀菌根腐病（tobacco Fusarium root rot）較為常見［2］。該病害由鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌侵染引起，被報道的致病菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）等［3-4］。該病主要發(fā)生于煙草大田期，典型癥狀有煙株矮小、底部葉片葉尖黃化蜷縮焦干。近年來，隨著氣候條件與種植方式的變化，該病害在我國貴州煙區(qū)的發(fā)生范圍及危害程度呈現(xiàn)上升、加重趨勢，給煙農(nóng)造成嚴重經(jīng)濟損失［5］，亟須對其病原的生物學特性加強研究，以期掌握該病害的災變規(guī)律。

溫度、光照等環(huán)境因子影響著植物病原菌的生長［6］。已有少量煙草根腐病病原菌生物學特性的報道，趙杰研究表明，煙草根腐病病原尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌在10～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長，最適生長溫度為30 ℃［7］。陳高航對煙草尖孢鐮刀菌研究發(fā)現(xiàn)，其致死溫度為60 ℃，且環(huán)境適應性強［8］。汪漢成等研究發(fā)現(xiàn)，煙草腐爛病病原菌九州鐮刀菌（F. kyushuense）在完全黑暗、完全光照、光暗交替環(huán)境下菌絲生長速率無顯著性差異［9］。此外，碳氮源營養(yǎng)、滲透壓等環(huán)境因子也影響著病原菌的生物活性，病原菌對不同營養(yǎng)因子的代謝表型特征可反映其對環(huán)境的適應力。文增葉等研究發(fā)現(xiàn)，三七根腐病病原尖孢鐮刀菌可有效利用淀粉、乳糖等多種碳源和硝酸銨等氮源［10］。楊靜美等研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜腐皮鐮刀菌（Fusarium solani f. sp. glycine）在pH值 3～10范圍內(nèi)均可生長，最適pH值為7～10［11］。相較而言，作為嚴重危害煙葉生產(chǎn)的根腐病，其病原菌的生物學特性和環(huán)境適應力卻缺乏了解。

為此，本研究采用菌絲生長速率法分別測定鐮刀菌根腐病病原在不同溫度、光照條件下的生長速率，利用活體接種法測定不同種的致病力，同時采用Biolog代謝表型技術(shù)研究其在不同碳氮源、滲透壓和pH值下的代謝表型，旨在明確其生物學特性和環(huán)境適應力，為煙草根腐病的災變規(guī)律研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗概況及材料

試驗于 2023年6—11月在貴州省貴陽市觀山湖區(qū)貴州省煙草科學研究院進行。煙草鐮刀菌根腐病病原腐皮鐮刀菌（F. solani）菌株F421、F506、F503，木賊鐮刀菌（F. equiseti）菌株M417、M423、M16，尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）菌株J419、J3、J210，均由貴州省煙草科學研究院真菌實驗室提供。供試煙草品種為云煙87，待煙葉長至7～8葉時備用。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L；燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基：燕麥片30 g、瓊脂17 g、蒸餾水 1 L；烷基酯瓊脂培養(yǎng)基（AEA）培養(yǎng)基：酵母提取粉5 g、瓊脂20 g、丙三醇20 mL、硝酸鈉6 g、磷酸氫二鉀1.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.25 g；綠豆湯培養(yǎng)基：新鮮綠豆20 g，洗凈，放入1 000 mL純凈水中煮沸20 min，過濾去除豆渣，濾液加水補足1 000 mL，加入瓊脂粉20 g，攪拌均勻，分裝，121 ℃濕熱滅菌20 min。

Biolog代謝板FF（貨號：94545）、PM3（貨號：12121）、PM9（貨號：12161）、PM10（貨號：12162）和接種液FF-IF（filamentous fungi-inoculating fluid）（貨號：72106），均由美國Biolog公司生產(chǎn)；D-葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鈉等，購自美國Sigma公司；酵母氮源，購自美國Difco公司；Omnilog PM高通量微生物細胞表型芯片測定系統(tǒng)，由美國Biolog公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 煙草鐮刀菌根腐病病原的生物學特性 （1）溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響：用菌絲生長速率法測定腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在不同溫度范圍的菌絲生長速率。用直徑6 mm打孔器制取培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌碟，置于PDA培養(yǎng)基上，于5、10、15、20、25、30、35 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每處理設3次重復，接種7 d后采用“十字交叉法”測量菌落直徑，并計算生長速率。平板測定完后，用10 mL無菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板測定單位面積（cm2）的產(chǎn)孢量。（2）光照條件對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響：采用菌絲生長速率法測定不同光照條件下菌絲生長速率。使用無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上制取直徑為6 mm的培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌碟，將其接種到新的PDA培養(yǎng)基中，置于溫度均為28 ℃、光照條件分別為連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、光—暗周期為12 h—12 h的生化培養(yǎng)箱，每個處理設置3次重復，接種 7 d 后采用“十字交叉法”測量菌落直徑，并計算生長速率。隨后用10 mL無菌水洗滌平板，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板測定單位面積（cm2）的產(chǎn)孢量。（3）菌絲致死溫度的測定：隨機選取3株菌株（尖孢鐮刀菌J419、腐皮鐮刀菌F503、木賊鐮刀菌M16）進行菌絲致死溫度測定。在PDA培養(yǎng)基上制取直徑為6 mm的菌碟，將其置于盛有 5 mL 滅菌水的無菌試管中，分別置于35、40、45、50、55 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，同時緩慢搖動試管使之受熱均勻，取出試管冷卻至室溫，將處理后的菌餅接種到PDA平板中央，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，6 d后觀察菌絲生長情況以確定致死溫度范圍。每個處理重復3次。（4）不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響：參照上述方法制備腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌直徑6 mm 的菌碟，分別置于PDA、OA、AEA、綠豆湯培養(yǎng)基上，接菌后所有平板均置于溫度為28 ℃黑暗條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復3次，7 d后測量菌落直徑。

1.2.2 煙草鐮刀菌根腐病病原的致病力測定 隨機選取尖孢鐮刀菌菌株J419、腐皮鐮刀菌菌株F503、木賊鐮刀菌菌株M16進行病原菌致病力測定。煙草莖部和根部的致病力測定參照畢武等的方法［12］，葉部致病力的測定參照汪漢成等的方法［8］。將6 mm菌餅分別接種到刺傷和無刺傷的煙苗組織上，接種后菌碟和煙株組織采用浸有無菌水的脫脂棉保濕，隨后放在28 ℃黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)，對照組接種無菌絲的PDA菌碟。接種7 d后，采用“十字交叉法”測量病斑直徑，每個菌株重復3次。

1.2.3 代謝表型測定 由“1.2.1”節(jié)測定結(jié)果可知腐皮鐮刀菌F421產(chǎn)孢能力較強，選擇此菌株進行測定。使用Biolog系統(tǒng)測定其代謝表型。將煙草根腐病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃、[JP2]黑暗條件下培養(yǎng)7 d，至產(chǎn)生大量分生孢子。無菌棉簽蘸用FF接種液（FF-IF）浸濕，在菌落表面旋轉(zhuǎn)，接著將棉簽浸入20 mL的 FF-IF[JP]接種液中制備1×10.5 個/mL的孢子懸浮液。碳源代謝表型測定：將孢子懸浮液依次加入FF代謝板微孔中（100 μL/孔）；氮源代謝表型測定：取10.025 mL孢子懸浮液、D-葡萄糖溶液0.375 mL、酵母氮源溶液1 mL與無菌水0.6 mL均勻混合加入到PM3代謝板中；滲透壓和pH值環(huán)境下代謝表型測定：取孢子懸浮液20.05 mL、D-葡萄糖溶液0.75 mL、 酵母氮源溶液2 mL、無菌水 1.2 mL 均勻混合，加入PM9和PM10代謝板中；按照Biolog PM微生物細胞表型流程將各測定板放于Biolog 培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)，設置 OmniLog 工作軟件，每15 min收集1次數(shù)據(jù)。根據(jù)動力學曲線，分析其代謝表型特征。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2010和SPSS 24.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，應用LSD（least significant difference）法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草鐮刀菌根腐病病原的生物學特性[HT]

2.1.1 溫度對菌絲生長速率的影響 在不同溫度下，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長速率各不相同，且存在顯著性差異。在5～30 ℃ 條件下，所測尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌菌株均能生長。隨著溫度的升高，菌絲生長速率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。在25～30 ℃時，9株菌株的菌絲生長速度均較快。在25 ℃時，木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M423、腐皮鐮刀菌F421、尖孢鐮刀菌J210的菌絲生長速率較快，分別為7.07、10.45、8.43、10.00 mm/d；在30 ℃時，木賊鐮刀菌M417、腐皮鐮刀菌F506、腐皮鐮刀菌F503、尖孢鐮刀菌J419、尖孢鐮刀菌J3的菌絲生長速率最快，分別達到10.71、9.78、8.90、8.64、6.67 mm/d。25 ℃和30 ℃的生長速度顯著高于其他溫度處理（P<0.05）（圖1-A）。9株菌株菌絲生長的適宜溫度為25～30 ℃，低于15 ℃或高于30 ℃菌絲生長緩慢。

2.1.2 溫度對產(chǎn)孢量的影響 在不同溫度下，煙草鐮刀菌屬根腐病菌產(chǎn)孢量之間存在差異。隨著溫度升高，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。在15～35 ℃溫度范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，在25～30 ℃ 時產(chǎn)孢量最多。在25 ℃時，木賊鐮刀菌M423、尖孢鐮刀菌J419、尖孢鐮刀菌J210產(chǎn)孢量最多，分別為7.45×10.6、5.33×10.6、4.95×10.6 個/cm2；在30 ℃時，腐皮鐮刀菌F421、腐皮鐮刀菌F506產(chǎn)孢量最多，分別為 8.65×106、7.40×10.6個/cm2；而腐皮鐮刀菌F503、尖孢鐮刀菌J3、木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M417在這2個溫度范圍內(nèi)的產(chǎn)孢量無顯著性差異。在35 ℃，產(chǎn)孢量呈下降趨勢，尖孢鐮刀菌J3、尖孢鐮刀菌J419、木賊鐮刀菌M16、木賊鐮刀菌M417、木賊鐮刀菌M423在此溫度范圍不產(chǎn)孢（圖1-B）?？傊?，9株鐮刀菌產(chǎn)孢的適宜溫度為25～30 ℃，低于 15 ℃ 或高于30 ℃時產(chǎn)孢量少甚至不產(chǎn)孢。

2.1.3 光照對菌絲生長的影響 腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和 12 h—12 h光暗交替條件下，均可正常生長。在3種光照條件下，木賊鐮刀菌M16在連續(xù)黑暗條件和12 h—12 h光暗交替條件下的菌絲生長速率分別為4.45、4.33 mm/d，兩者之間無顯著性差異，但顯著高于連續(xù)光照條件；尖孢鐮刀菌J3在連續(xù)黑暗和連續(xù)光照條件下的菌絲生長速率分別為4.18、4.02 mm/d，兩者之間無顯著性差異，但顯著高于 12 h—12 h光暗處理條件；尖孢鐮刀菌J210在連續(xù)光照條件和12 h—12 h光暗交替條件下的菌絲生長速率分別為9.19、9.57 mm/d，兩者之間無顯著性差異，但顯著低于連續(xù)黑暗條件。在3種光照測試條件下，腐皮鐮刀菌F503的菌絲生長速率范圍為4.07～4.76 mm/d，尖孢鐮刀菌J419的菌絲生長速率為9.24～10.02 mm/d，相同菌種的不同菌株間均無顯著性差異；在黑暗條件下，木賊鐮刀菌M417、木賊鐮刀菌M423、腐皮鐮刀菌F421、腐皮鐮刀菌F506的菌絲生長速率均最快，顯著高于其他2個光照條件處理（P<0.05，圖2-A）。因此，連續(xù)黑暗條件為腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長的最適光照條件。

2.1.4 光照對產(chǎn)孢量的影響 在不同光照條件下，所有腐皮鐮刀菌、 木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌株均可產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量在不同光照條件下存在差異性。

由圖2-B可知，9株鐮刀菌屬根腐病菌在黑暗條件下的產(chǎn)孢量最多，例如腐皮鐮刀菌F421的產(chǎn)孢量為7.05×10.6個/cm2，尖孢鐮刀菌J3的產(chǎn)孢量為 4.88×10.6 個/cm2。連續(xù)光照條件下，產(chǎn)孢量均最少。為此，連續(xù)黑暗條件有利于腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌9株鐮刀菌的產(chǎn)孢。

2.1.5 菌絲的致死溫度 腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在35、40 ℃水浴處理10 min后，重新置于28 ℃黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)均可生長，而在45、50、55 ℃條件下水浴處理后不能生長（表1）。為此，3株鐮刀菌的致死溫度均為45 ℃。

2.1.6 不同培養(yǎng)基對鐮刀菌屬根腐病病原菌絲生長速率的影響 結(jié)果表明，在PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)

基、AEA培養(yǎng)基、綠豆湯培養(yǎng)基上，腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長速率存在差異（表2）。在相同條件下，木賊鐮刀菌M16、尖孢鐮刀菌J210、腐皮鐮刀菌F506在AEA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率最大，分別為10.19、11.36、10.07 mm/d，OA培養(yǎng)基和綠豆湯培養(yǎng)基的菌絲生長速率差異不顯著，而PDA培養(yǎng)基的菌絲生長速率最慢。尖孢鐮刀菌J3和腐皮鐮刀菌F503在AEA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率最快，分別為9.72、9.95 mm/d，在PDA培養(yǎng)基和綠豆湯培養(yǎng)基的菌絲生長速率無顯著性差異。木賊鐮刀菌M417在AEA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率最大，達到11.09 mm/d，在OA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率無顯著性差異。木賊鐮刀菌M423在PDA培養(yǎng)基、AEA培養(yǎng)基、綠豆湯培養(yǎng)基上的菌絲生長速率分別4.29、5.24、4.36 mm/d，三者之間無顯著性差異。尖孢鐮刀菌J419在AEA培養(yǎng)基上和綠豆湯培養(yǎng)基上的菌絲生長速率分別為9.36、8.88 mm/d，兩者之間無顯著性差異。腐皮鐮刀菌F421在AEA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率最大，達到10.21 mm/d，而在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率最小。為此，3種鐮刀菌菌絲生長的最適培養(yǎng)基均為AEA培養(yǎng)基。

2.2 煙草鐮刀菌根腐病病原的致病力

致病力試驗結(jié)果表明，3株腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌菌株刺傷、無刺傷接種，煙草葉片7 d后均出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，且刺傷接種的尖孢鐮刀菌J419、腐皮鐮刀菌F506的致病力較強，病斑面積分別為1.35 cm2和1.05 cm2；木賊鐮刀菌M16的致病力較弱。3菌種在葉部均形成褐色病斑，病斑周圍有黃褐色暈圈，3個種在葉片上的致病力強弱順序依次為尖孢鐮刀菌>腐皮鐮刀菌>木賊鐮刀菌。腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌在接種莖部后，莖部均出現(xiàn)白色菌絲體，隨后病斑逐漸擴大直至整株死亡，3個種在莖上的致病力強弱順序依次為尖孢鐮刀菌>腐皮鐮刀菌>木賊鐮刀菌。根部接種3種病原菌后，煙株葉部均發(fā)現(xiàn)不同程度的萎蔫黃化，根系破碎，須根減少（圖3）。

2.3 腐皮鐮刀菌的代謝表型特征

2.3.1 碳源代謝表型 由圖4可見，腐皮鐮刀菌對Biolog FF板上的所有碳源都能代謝，不同碳源間的代謝強度存在差異。其中可高效代謝的碳源約有54種，包括D-阿拉伯糖醇、丙三醇、D-甘露醇、D-松二糖、L-焦谷氨酸等，但對α-D-乳糖、γ-羥基丁酸等5種碳源的代謝能力相對較弱。

2.3.2 氮源代謝表型 由圖4可見，腐皮鐮刀菌對Biolog PM3板上的所有氮源都能代謝。其中，能夠高效代謝的氮源包括Met-Ala、α-氨基-N-戊酸、L-鳥氨酸等6種氮源；對8種氮源的代謝能力相對較弱，包括羥胺、甲胺、正戊胺、e-氨基-N-己酸、谷胱甘肽等；相較而言，腐皮鐮刀菌對谷胱甘肽的利用能力最弱。

2.3.3 滲透壓和pH值代謝表型特征 由圖5可知，腐皮鐮刀菌具有較強的滲透壓適應能力，可代謝10～40 mmol/L 亞硝酸鈉、1%～ 5.5% 硫酸鈉、1%甲酸鈉、1%和7%～9%的乳酸鈉、5%～10% 乙二醇、2%～3%的尿素、10～100 mmol/L 硝酸鈉、10～40 mmol/L 亞硝酸鈉，而對6.5%、8%的氯化鈉、20～200 mmol/L 苯甲酸鈉（pH值5.2）、60～80 mmol/L 亞硝酸鈉、7%的尿素的代謝較弱。在6% 氯化鈉與不同滲透壓物質(zhì)協(xié)同下，腐皮鐮刀可代謝滲透壓物質(zhì)，但對甜菜堿、四氫嘧啶、肌酸、γ-氨基-N-丁酸的代謝較弱。腐皮鐮刀菌可進行代謝的pH值范圍為3.5～8.5，最適pH值為6。當pH值 4.5脅迫與不同氨基酸混合時，腐皮鐮刀菌可高效代謝大部分基質(zhì)，例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-組氨酸、L-天門冬酰胺等，但不能代謝鄰氨基苯甲酸。當pH值 9.5脅迫與不同氨基酸混合時，腐皮鐮刀菌可代謝大部分基質(zhì)，如L-谷氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、腐胺、胍基丁胺、酪胺等，而對L-酪氨酸的代謝較弱。此外，還可高效代謝X-β-D-氨基葡萄糖苷、X-β-D-氨基半乳糖苷、X-氨基磷酸酶、X-芳基硫酸酯酶、X-SO4等基質(zhì)。在pH值分別為4.5和95的不同氨基酸脅迫下，分別測定了B1～D12和E1～G12孔中PM10的脫羧酶和脫氨酶活性。結(jié)果反映該病原菌的脫羧酶活性較高，但脫氨酶活性較差。

3 討論

煙草鐮刀菌根腐病是發(fā)生在煙草上的真菌性土傳病害，在我國各種植煙區(qū)均有發(fā)生，其危害于煙草根部，對煙草的經(jīng)濟效益造成重大損失［13-14］。溫度和光照條件能顯著影響病原菌的生長。本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌在 10～35 ℃條件下均可生長，25～30 ℃溫度范圍內(nèi)菌絲生長速率最大、產(chǎn)孢量最多，這與趙杰報道的結(jié)果［7］基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)煙草鐮刀菌根腐病病原生長的適溫范圍與同為煙草土傳病害的煙草黑脛病菌Phytophthora parasitica（21～35 ℃）［15］類似，這可能是煙草田間病害鐮刀菌根腐病與黑脛病常?；彀l(fā)、難以防治的原因之一。汪漢成等報道九州鐮刀菌光照處理對菌絲生長沒有明顯影響，光暗交替更利于其產(chǎn)孢［16］；而本研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌在黑暗條件下更利于菌絲生長和產(chǎn)孢，其差異可能是不同種鐮刀菌的生物學特性不同造成的。本研究發(fā)現(xiàn)煙草鐮刀菌屬根腐病病原尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、木賊鐮刀菌均可致煙草葉部、莖部和根部發(fā)病，結(jié)果與姚健等研究認為的煙草根腐病病原菌尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌可致煙草發(fā)病的結(jié)論［17］一致，進一步驗證了本研究結(jié)果的可靠性。王立國等研究報道，廣金錢草根腐病病原腐皮鐮刀菌在PDA和OA培養(yǎng)基上的菌絲生長差異不顯著［18］，而本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌菌絲在OA培養(yǎng)基上比PDA培養(yǎng)基上生長更快，說明同種菌菌株間在不同培養(yǎng)基的生長速度間存在差異。

營養(yǎng)元素是病原菌生長的必要條件，碳源和氮源的利用是其生長最重要的兩大營養(yǎng)元素。病原菌對不同碳氮源利用的種類和強度存在差異性，如汪漢成等［19］研究報道煙草赤星病菌可高效代謝的碳源有L-果膠糖、D-半乳糖等34種，氮源有L-谷氨酸、L-賴氨酸等60余種。本研究采用Biolog FF碳源代謝板進行測試，F(xiàn)F板大部分碳源為真菌可代謝碳源，能反映腐皮鐮刀菌對大部分碳源的需求。本研究發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌可高效代謝大部分碳源，如D-阿拉伯糖醇、丙三醇等，推測這些碳源有助于根腐病菌的生長。通過Biolog PM3氮源代謝板可知腐皮鐮刀菌對大部分氮源的代謝能力一般，且對谷胱甘肽的代謝能力最弱，推測這類氮源可抑制根腐病菌的生長。

滲透壓和pH值等環(huán)境因子對病原菌的生長與危害具有重要影響［19］，病原菌在不同環(huán)境中的代謝能力變化，可反映其對環(huán)境的耐受性。本研究基于Biolog表型技術(shù)測定了煙草鐮刀菌屬根腐病菌腐皮鐮刀菌生長的最適pH值為6。當pH值為4.5時，腐皮鐮刀菌可代謝大部分氨基酸；當pH值為9.5時，煙草根腐病菌腐皮鐮刀菌對氨基酸代謝活性相對較弱；該結(jié)果反映腐皮鐮刀菌的脫羧酶活性較高，但脫氨酶活性較差。煙草根腐病菌與煙草其他病原菌相比，其pH值適應范圍與煙草青枯病菌Ralstonia solanacearum （pH值 5.0～10） ［20］、煙草黑脛病菌 （pH值 3.5～10）［15］相似。病原菌在煙草上的pH值范圍不同可能是其脫羧酶活性和脫氨酶活性的差異造成的。病原菌對不同滲透壓物質(zhì)的代謝活性不同，可反映其在不同逆境中的耐受力。煙草腐皮鐮刀菌對20～200 mmol/L 苯甲酸鈉（pH值 5.2）、60～80 mmol/L亞硝酸鈉、甜菜堿、四氫嘧啶等部分物質(zhì)的代謝較弱，因此可使用不同濃度的滲透壓物質(zhì)來減輕該病害的危害，這需進一步深入研究。本研究獲得的煙草腐皮鐮刀菌的代謝表型組學信息為鐮刀菌屬其他病原菌的代謝表型研究提供了借鑒。

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基金項目：國家自然科學基金（編號：32160522、31960550）；貴州省科技基金（編號：黔科合基礎-ZK［2021］重點036）；中國煙草總公司科技項目［編號：110202101048（LS-08）、110202001035（LS-04）］；貴州省“百層次”創(chuàng)新型人才項目（編號：黔科合平臺人才-GCC［2022］028-1）；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目“茄科葉用經(jīng)濟作物病害綠色防控科技創(chuàng)新人才團隊建設”。

作者簡介：黃玉鳳（1998—），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事病原微生物學研究工作。E-mail：397521401@qq.com。

通信作者：汪漢成，研究員，主要從事煙草植保及微生態(tài)研究，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com；李 菲，教授，主要從事植物根際微生態(tài)研究，E-mail：ifei00987@outlook.com。