姜立春 付丹陽(yáng) 趙欣悅 蔣道玉 張雨潔 宋晚晴

姜立春，付丹陽(yáng)，趙欣悅，等. 麥洼牦牛糞便纖維素降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：223-230.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.030

（綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000）

摘要：為從麥洼牦牛糞便中篩選出具有高纖維素降解能力的菌株，通過羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再利用濾紙條崩解和剛果紅平板透明圈試驗(yàn)進(jìn)行初篩，將獲得的菌株使用DNS法測(cè)定CMC酶活力進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)菌體形態(tài)學(xué)觀察及16S rRNA序列測(cè)定及序列同源性比較結(jié)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該菌分類地位。結(jié)果表明，從麥洼牦牛糞便中篩選出1株酶活性為11.88 U/mL的纖維素酶產(chǎn)生菌株，經(jīng)菌種初步鑒定該菌為溶桿菌屬，命名為L(zhǎng)ysobacter sp. MY16。以菌株MY16發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：最適碳源蔗糖（50 g/L），最適氮源尿素（7 g/L）為基礎(chǔ)，對(duì)其培養(yǎng)條件采用Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken試驗(yàn)響應(yīng)面法分析，得出培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為溫度41 ℃、接種量8.1%、時(shí)間21 h。在最適條件下，培養(yǎng)CMCase活性為36.12 U/mL，比優(yōu)化前提高了2.04倍。綜上可知，本研究篩選出了1株具有高CMC酶活性的菌株MY16，可為纖維素的生物高值轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；牦牛糞便；纖維素酶；單因素法；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：1002-1302（2024）07-0223-08

纖維素是一種非常豐富的資源，廣泛存在于秸稈和畜禽類糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物中。我國(guó)是世界上農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量最大的國(guó)家［1］，秸稈可用作肥料、燃料、飼料等，具有高利用價(jià)值。但由于焚燒占比大，每年秸稈損失氮素高達(dá)20萬(wàn)t［2］。并且秸稈焚燒會(huì)對(duì)環(huán)境、社會(huì)及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)造成危害［3］。近年來(lái)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，隨之而來(lái)的問題便是大量的畜禽糞便未得到資源化利用或無(wú)害化處理。未處理的糞污可形成有害物質(zhì)，污染環(huán)境、威脅人類健康；大量糞便占用土地，制約畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［4］。因此，纖維素高效、循環(huán)利用對(duì)于充分利用資源本身，甚至對(duì)于環(huán)境、社會(huì)等綜合效益均有非常重要的意義。

纖維素是一種呈鏈狀的高分子化合物，由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵聯(lián)結(jié)起來(lái)形成非常穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，水分子、化學(xué)試劑等難以進(jìn)入與之結(jié)合［5］，這些特點(diǎn)使纖維素很難被降解利用。在過去的科學(xué)研究中，有科學(xué)家曾采用酸、堿的化學(xué)處理法［6-7］和蒸汽加熱的物理處理法［8］來(lái)處理纖維素，相較于物理法和化學(xué)法而言，生物處理法因?yàn)榉磻?yīng)條件更溫和并且對(duì)環(huán)境無(wú)污染而被廣泛使用。

生物法常以自然界中篩選的高效降解纖維素菌株為基礎(chǔ)，而食草性動(dòng)物的消化系統(tǒng)及糞便因具有較多纖維素降解功能的菌群可作為優(yōu)質(zhì)菌源。張智等從大熊貓糞便中篩選得到1株需氧的纖維素降解菌，初步鑒定該菌株為Paenibacillus cookii LZ033［9］。何靜等從雙峰駝糞便中分離篩選得到1株能夠降解纖維素的纖維化纖維微菌（Cellulosimicrobium cellulans）［10］。牦牛（Bos grunniens），屬于牛亞科動(dòng)物，草食性反芻家畜，分布于青藏高原及其相鄰高寒地區(qū)。因牦牛生活在特殊的生態(tài)環(huán)境，對(duì)高原高寒少氧、降水少、日照短、輻射強(qiáng)等惡劣的環(huán)境條件有極高適應(yīng)性［11］，形成了耐粗飼的特性［12］。所以牦牛消化道及糞便中的微生物具有極高的研究?jī)r(jià)值。聶遠(yuǎn)洋等從不同年齡的牦牛大腸內(nèi)容物中分離到微需氧菌和厭氧菌共90株細(xì)菌［13］。繁萍等通過宏基因組法分析牦牛糞便中的物種DNA信息，共注釋物種數(shù)8 774種，其中，注釋細(xì)菌8 099個(gè)種［14］。本研究以麥洼牦牛糞便為菌源，擬篩選出1株纖維素酶活性較高的菌株，并從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)上進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)該菌株培養(yǎng)基配方進(jìn)行單因素優(yōu)化，并在培養(yǎng)基配方優(yōu)化的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman和最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken及響應(yīng)面分析對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高產(chǎn)酶能力，為該菌株的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

試驗(yàn)樣品來(lái)自于四川省紅原縣天然牧場(chǎng)飼養(yǎng)的4歲齡健康麥洼牦牛的新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基（g/L）[JP]：CMC-Na 5.0 g、瓊脂17.0 g、KH2PO4 1.0 g、NaNO3 3.0 g、KCl 0.5 g、FeSO4 0.01 g（pH值5.5～6.0）［15］；牛肉膏蛋白胨（BPD）培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、瓊脂18.0 g、蛋白胨10.0 g（pH值7.4～7.6）；濾紙培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、濾紙條（1 cm×5 cm），酵母粉3.0 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 1.0 g（pH值7.0～7.2）；種子培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g（pH值7.1～7.3）；液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、蛋白胨10.0 g、NaCl 4.0 g[JP]、酵母膏5.0 g、KH2PO4 4.0 g、CMC-Na 10.0 g（pH值6.8～7.4）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離

取1 g麥洼牦牛糞便至250 mL錐形瓶中，加入99 mL無(wú)菌蒸餾水，在30 ℃條件下振蕩10 min。取5 mL菌懸液加入 95 mL 的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3 d。將富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋至10-7～10-2。分別吸取 0.2 mL 10-7～10-4濃度梯度的稀釋液涂布至羧甲基纖維素鈉選擇培養(yǎng)基，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。選擇其中最適宜的稀釋濃度梯度繼續(xù)進(jìn)行多次純化培養(yǎng)，直至得到純化的單菌落。

1.2.2 降解菌的初篩

將純化后的菌落接種至羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)3 d，待菌落生長(zhǎng)完成后，測(cè)量菌落直徑（d）。覆蓋質(zhì)量濃度為1 mg/mL的剛果紅（CR）溶液，染色30 min后，倒去CR溶液，采用0.9% NaCl溶液沖洗2～3次，測(cè)量水解圈直徑（D）。計(jì)算D/d，菌株纖維素水解能力與該值呈正比［16］，選出比值較高的即纖維素水解能力強(qiáng)的菌株。把初步分離的菌株置于種子培養(yǎng)基中制成種子液，35 ℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d后再分別接種于濾紙條培養(yǎng)基中，置于 30 ℃、130 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d，觀察并記錄濾紙的崩解情況，崩解程度越高說明菌株纖維素水解能力越強(qiáng)［17］。

1.2.3 降解菌的復(fù)篩

1.2.3.1 粗酶液的制備

將初篩得到的菌株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d后，離心20 min，除去培養(yǎng)基及菌體殘?jiān)占锨逡鹤鳛榇置敢?，用于CMCase的活性測(cè)定。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別加入不同濃度（0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和DNS溶液2.0 mL于試管中，在100 ℃水浴中加熱5 min，把溶液冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，測(cè)定540 nm下的吸光度（D），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 酶活力測(cè)定

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，代入D值計(jì)算出葡萄糖濃度，再根據(jù)羧甲基纖維素酶（CMCsae）活性的測(cè)定參照標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003［18］得出其CMC酶活性，選擇酶活性相對(duì)較高的菌種進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將最終篩選出的菌株于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察菌株形態(tài)。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［20］，根據(jù)菌落形狀大小、顏色變化、表面狀況、邊緣是否光滑、菌落質(zhì)地軟硬、是否透明等判斷菌種類型。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取細(xì)菌的DNA，采用16S rDNA通用引物F27和R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，將符合條件的PCR產(chǎn)物送至生物技術(shù)公司測(cè)序。測(cè)序完成后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行同源性對(duì)比，通過MEGA 11.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.5 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

對(duì)培養(yǎng)基的碳源（果糖、蔗糖、微晶纖維素、淀粉、玉米粉CMC-Na、葡萄糖、麥芽糖、乳糖）和氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、KNO3、NaNO3、玉米粉、尿素）采用單因素法測(cè)定其對(duì)CMCase活性的影響。其中，碳源和氮源質(zhì)量濃度范圍分別為20、30、40、50、60、70、80 g/L和1、3、5、7、9、12 g/L，分別測(cè)定CMC酶活性。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化

在上述單因素優(yōu)化培養(yǎng)基配方條件的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值這6個(gè)產(chǎn)酶影響因素進(jìn)行P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件影響顯著的因子。再通過爬坡實(shí)驗(yàn)確定顯著影響因子的中心范圍，以CMCase活性為優(yōu)化目標(biāo)根據(jù)B-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，并使用模型推測(cè)和實(shí)際相結(jié)合的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 菌株初篩

以麥洼牦牛糞便為菌源，經(jīng)過富集培養(yǎng)與羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基的初步篩選，獲得16株能降解纖維素的菌株，命名為MY01～MY16。經(jīng)剛果紅染色法與濾紙條試驗(yàn)法進(jìn)一步判斷其是否具有產(chǎn)纖維素降解酶的能力及產(chǎn)酶能力大小。由表1可知，通過水解圈比值（D/d）大小得出16株纖維素降解菌均具有一定的纖維素降解能力，且2種不同的試驗(yàn)方法得出的結(jié)果具有較好相關(guān)性，總體上來(lái)說水解圈比值越大濾紙崩解情況越強(qiáng)。其中，菌株MY04、MY10、MY16對(duì)纖維素的作用較大，D/d>5且遠(yuǎn)大于其他菌株，在試驗(yàn)7 d后濾紙失去形狀或直接呈糊狀。

2.1.2 菌株復(fù)篩

為驗(yàn)證菌株產(chǎn)酶能力的準(zhǔn)確性，還需要對(duì)獲得的菌株使用DNS法測(cè)定CMC酶活性進(jìn)行復(fù)篩。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，得到回歸曲線方

程：y=0.04 383x+0.00 092（r2=0.99 902）。根據(jù)16株菌株的吸光度分別計(jì)算葡萄糖濃度，再測(cè)定其CMCase活性。由表2可知，其中，菌株MY04、MY10酶活力較高，MY16最高，為11.88 U/mL。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，選MY16菌株作為后續(xù)的研究對(duì)象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株MY16在培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)前期呈乳白色且形成較慢，菌落形成前后菌株開始快速生長(zhǎng)，顏色加深并帶有乳黃色。菌落形態(tài)較小，表面圓滑潤(rùn)濕、有突起，正反面顏色相同、稍透明，且質(zhì)地柔軟，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固，易被挑取。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過對(duì)菌株MY16的16S rDNA序列同源性比對(duì)，使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖1可知，菌株MY16的16S rDNA序列與溶桿菌屬的同源性為99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與溶桿菌屬的細(xì)菌并于一個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，初步確定菌株MY16為溶桿菌，命名為L(zhǎng)ysobacter sp. MY16。

2.3 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

以相同質(zhì)量濃度的9種不同碳源配制培養(yǎng)基，測(cè)定CMC酶活性。由圖2-a可知，在本次試驗(yàn)中當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí)CMC酶活性達(dá)到最高，為12.35 U/mL。因此，選用蔗糖為最適碳源。

以不同濃度的蔗糖為碳源發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵后菌液中的CMC酶活性。由圖2-b可知，當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時(shí)，CMC酶活性為4.38 U/mL。當(dāng)蔗糖濃度為70 g/L時(shí)，CMC酶活性為14.27 U/mL，達(dá)最大值。在這之間酶活力隨著蔗糖濃度的逐漸增大而呈波浪式上升。其濃度為80 g/L時(shí)，CMCase活性為11.35 U/mL?？紤]到所用培養(yǎng)菌種為細(xì)菌，碳源濃度過高可能導(dǎo)致培養(yǎng)基過于黏稠，不利于菌種生長(zhǎng)，且在50 g/L時(shí)，酶活力也達(dá)到了小高峰。因此，最適蔗糖濃度為50 g/L。

以相同質(zhì)量濃度的9種不同氮源配制培養(yǎng)基，測(cè)定CMC酶活性。由圖2-c可知，當(dāng)以尿素為氮源時(shí)CMCase活性達(dá)到最高，為14.72 U/mL。因此，選用尿素為最適碳源。

以不同濃度的尿素為碳源發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵后菌液中的CMC酶活性。由圖2-d可知，當(dāng)尿素濃度為1 g/L時(shí)，CMCase[JP2]活性為15.95 U/mL，其濃度為 7 g/L 時(shí)的CMCase活性為23.89 U/mL，且為最大值，酶活性上升趨勢(shì)較為平緩，其濃度超過7 g/L后CMCase活性緩慢下降，前后變化趨勢(shì)相似，整個(gè)圖像為鐘罩形。因此，選用最適氮源濃度為7 g/L。

2.4 培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

利用Design-Expert（8.0）軟件對(duì)培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值這6個(gè)酶活性的影響因素進(jìn)行P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3）。對(duì)模型方差進(jìn)行分析，得到影響力的顯著性排序（表4）。數(shù)據(jù)分析得到該菌株CMC酶活性的多元一次方程為：CMCase活性=26.54+1.58X1+2.09X2-0.33X3+0.42X4+1.77X5-0.16X6。該模型的R2=0.953 1，說明模型的相關(guān)性良好，得到的數(shù)據(jù)可靠。由表4可知，影響CMC酶活性的關(guān)鍵因素的顯著性順序?yàn)閄2（接種量）>X5（培養(yǎng)時(shí)間）>X1（培養(yǎng)溫度）>X4（初始pH值）>X3（裝液量）>X6（轉(zhuǎn)速）。其中，X1（培養(yǎng)溫度）、X2（接種量）和X5（培養(yǎng)時(shí)間）為極顯著影響因素（P<0.01），所以確定其為進(jìn)一步優(yōu)化的關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

為確定對(duì)產(chǎn)酶影響極顯著的3個(gè)因子的試驗(yàn)最大響應(yīng)值所在區(qū)域，逐步增大這3個(gè)因素的試驗(yàn)水平，采用最陡爬坡路徑方法，將溫度（A）、接種量（B）和時(shí)間（C）分別設(shè)置為30～50 ℃、6%～10%、16～24 h，以CMC酶活性作為判定指標(biāo)。各顯著因素的變化方向和試驗(yàn)結(jié)果，由表5可知， 試驗(yàn)號(hào)為2、3、4處理對(duì)應(yīng)的酶活性最高，可達(dá)33.98 U/mL。綜上所述，溫度、接種量和時(shí)間最適范圍分別為35～45 ℃、7%～9%、18～22 h。

2.4.3 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

通過對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果與最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的充分分析，在逼近最大響應(yīng)的區(qū)域內(nèi)，以溫度（35～45 ℃）、接種量（7%～9%）和時(shí)間（18～22 h）為自變量、CMCase活性為響應(yīng)值進(jìn)行B-B響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。由試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（表6）可知，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合分析，得到影響CMCase活性的回歸方程為：CMCase酶活力=34.95+0.90A+0.84B+2.30C+0.06AB+0.43AC+0.23BC-2.55A2-4.00B2-3.28C2。

對(duì)模型回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。失擬項(xiàng)F=0.98>0.05（不顯著），P<0.000 1（極顯著水平）。[JP2]根據(jù)回歸方程的決定系數(shù)R2=0.987 7>[JP]0.9和校正系數(shù)R2Adj=0.971 9>0.9，可知98%數(shù)據(jù)的可變性可用此模型來(lái)解釋，并且預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間的相關(guān)性較好。綜上所述，該回歸模型具有較好的擬合效果，用來(lái)確定最適產(chǎn)酶條件是可靠的。分析回歸模型可發(fā)現(xiàn)，交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)CMCase活性的影響不顯著，而一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)CMCase活性均有極顯著影響（P<0.01）。由圖3可知，由多元二次回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線，可直觀地觀察各因素間對(duì)CMC酶活性的交互影響作用，由圖3可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，A、B、C存在極大值點(diǎn)。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸模型的優(yōu)化分析，得到最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)為（41.05、8.12、20.74），即培養(yǎng)溫度為41.05 ℃、接種量為8.12%、培養(yǎng)時(shí)間為20.74 h。在此點(diǎn)預(yù)測(cè)的CMCase活性可達(dá)35.513 9 U/mL。為驗(yàn)證以上結(jié)果，結(jié)合實(shí)際情況把培養(yǎng)條件優(yōu)化為41 ℃、8.1%、21 h，[JP2]在最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方和最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得CMC酶活性為36.12 U/mL，[JP]與預(yù)測(cè)值相近，并且比優(yōu)化前提高了2.04倍。

3 討論與結(jié)論

采用生物法對(duì)纖維素進(jìn)行高值轉(zhuǎn)化可推進(jìn)資源的合理利用，對(duì)農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義［21］。國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素降解微生物的研究正在不斷深入完善，食草動(dòng)物由于其食性特點(diǎn)，其消化系統(tǒng)及糞便是纖維素降解菌的優(yōu)質(zhì)菌株來(lái)源。牦牛作為一種在青藏高原上生長(zhǎng)的食草動(dòng)物，具有抵御惡劣環(huán)境及耐粗飼的特性。毛婷等從天祝牦牛的糞便中分離篩選出1株降解玉米秸稈的Bacillus pumilus菌株［22］。本研究以麥洼牦牛糞便為菌源，通過初篩復(fù)篩，篩選出了1株纖維素降解能力較高的菌株，命名為MY16，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，可初步確定MY16菌株為溶桿菌屬。

楊波等從鹿糞中篩選出了纖維素降解細(xì)菌A27和A36，其CMCase[JP]活性分別為0.158、0.042 U/mL［23］。崔登雪篩選分離了1株為枯草芽胞桿菌Bacillus subtils的菌株JK7，其纖維素酶活性最高可達(dá) 12.16 U/mL［24］。兩者相對(duì)來(lái)說纖維素酶活較低且差別較大，除了酶活性計(jì)算方法可能存在差異，還在于菌株自身的降解能力不同及產(chǎn)酶條件等尚需進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，通常采用的是單因素法。曾文婷等從竹鼠腸道中分離鑒定出了1株名為枯草芽孢桿菌GL-4的纖維素降解菌，并對(duì)其培養(yǎng)條件采用了單因素優(yōu)化法，得出其FPAase活性在溫度37 ℃、pH值8.0、時(shí)間 24 h 的培養(yǎng)條件時(shí)最高［25］。但單因素法僅能分析單一條件對(duì)酶活力的影響，不能考察多個(gè)條件間旳交互作用，而響應(yīng)面分析法能同時(shí)評(píng)價(jià)影響過程的各因素水平及其交互作用從而對(duì)過程進(jìn)行優(yōu)化。本研究在對(duì)MY16菌株進(jìn)行培養(yǎng)基單因素優(yōu)化的條件下，采用P-B試驗(yàn)篩選出影響其產(chǎn)酶條件的3個(gè)顯著性因素，再用最陡爬坡試驗(yàn)法確定其最適濃度范圍，最后對(duì)MY16菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件采用 B-B 響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化。確定菌株MY16的最佳培養(yǎng)條件為溫度41 ℃、接種量8.1%、時(shí)間 21 h，在最適培養(yǎng)基配方和最適培養(yǎng)條件下，CMCase活性可達(dá)36.12 U/mL，與優(yōu)化前相比，提高了2.04倍。與郭曉杰的試驗(yàn)結(jié)果［26］相比較，本研究的酶活力優(yōu)化效果更為明顯。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了主要有細(xì)菌、放線菌和真菌這3種類別的具有纖維素分解能力的微生物［27］。其中，細(xì)菌擁有生長(zhǎng)速度快、耐酸堿程度高、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其在纖維素降解的應(yīng)用上擁有巨大的應(yīng)用潛力［28］。本研究篩選出了1株Lysobacter sp. MY16（纖維素分解溶桿菌MY16），為纖維素降解微生物提供了更廣闊的選擇。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過誘變育種的方式提高產(chǎn)酶能力的方法已日漸運(yùn)用到菌種選育工作中。在今后的研究中，將采用誘變育種的方法對(duì)菌株進(jìn)行改良，以期為農(nóng)業(yè)廢棄物中纖維素的降解提供更優(yōu)質(zhì)的菌種。

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作者簡(jiǎn)介：姜立春（1977—），男，吉林梨樹人，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物方面研究。E-mail：jiang_lichun@126.com。