農耀斌 黃鴻娜 黃晶晶 毛德文 杜沅沁 宋文選 朱榮火 徐 健

1.貴港市人民醫(yī)院 (廣西 貴港, 537100) 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)脾胃肝病科

慢性肝病(CLD)在全球范圍內發(fā)病率持續(xù)上升,每年大約有200萬人死于肝硬變和肝癌[1]。盡管肝可以分化并增殖肝細胞、肝上皮細胞、膽管上皮細胞,具有修復肝臟損傷的能力,但肝臟的反復損傷會耗盡肝臟的再生能力,使纖維化進展為肝硬變,嚴重者發(fā)展為肝癌。當前預防及逆轉慢性肝病的治療手段有限。因此,研究CLD的有效治療是目前臨床上的迫切需求。Hippo信號通路可抑制導致肝臟顯著過度生長表型,在調節(jié)肝臟發(fā)育、再生,癌癥以及免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用[2,3]。本文論述Hippo信號通路在肝臟中的作用及對CLD新療法的潛在價值。

1 經(jīng)典Hippo信號通路

經(jīng)典Hippo信號通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn),而相應的哺乳動物絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Hippo缺失導致過度生長表型[4]。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶MST1和MST2與支架蛋白薩爾瓦多同源1形成復合體。MST1和MST2磷酸化并激活絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶LATS1和LATS2[5]。在多種絲氨酸殘基15上磷酸化YES相關蛋白1(Y AP),包括人類蛋白中的S127或小鼠蛋白中的S112。帶有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(TAZ)也被該復合體磷酸化,TAZ是YAP的類似物[6]。YAP-TAZ的磷酸化導致支架蛋白14-3-3與細胞質結合并將其隔離在細胞質中,最終通過F-box/WD重復序列包含蛋白1A將其作為蛋白酶體降解的靶點。當YAP和TAZ被低磷酸化時,它們可以移位到細胞核并與轉錄因子TEAD家族相互作用,介導靶基因的表達[7]。因此,典型的Hippo信號通路起著抑制YAP-TAZ活性的作用。

2 Hippo信號通路上游調控

2.1 細胞的極性和黏附性 Hippo信號通路的一個主要功能是限制細胞的增殖。Hippo信號調節(jié)部分是由參與連接形成細胞極性的蛋白質復合體介導的也可通過黏附性傳遞。有學者研究發(fā)現(xiàn),在多種類型的高密度上皮細胞中組裝緊密連接相關的Crumbs復合體可以增加YAP-TAZ的磷酸化,導致它們的細胞質隔離。腫瘤抑制因子肝激酶B1(LKB1)通過激活蛋白酶激活的受體蛋白(TAZ、LATS、MST),促進Scribble膜復合體,從而激活肝臟中Hippo信號,LKB1的肝臟特異性缺失會導致肝細胞增殖和肝腫大[8]。在肝臟角質形成細胞中,黏附連接蛋白α-Catenin通過與S127磷酸化的YAP和14-3-3形成細胞膜復合體來抑制YAP的活性,降低了YAP與蛋白磷酸酶2A21的可及性,抑制了肝細胞與細胞的黏連[9]。這表明細胞極性和黏附性復合體在調節(jié)肝臟中Hippo信號發(fā)揮重大作用。

2.2 生物力學調節(jié) 機械轉導也被認為是Hippo-YAP信號的一個重要調節(jié)因子。在肝臟中YAP-TAZ通過纖維的形成和小GTP酶Rho的活性,在體外生長于高細胞外基質(ECM)上經(jīng)歷轉錄、核移位活性增加。一項薈萃研究表明,纖維在原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞中觸發(fā)YAP激活,使肝細胞功能喪失,從肝細胞中特異性地刪除YAP 1,證明了機械轉導在調節(jié)肝細胞YAP活性中的關鍵作用[10]。除此之外,Hippo信號還受其他信號調控,如細胞的氧化應激和代謝調節(jié)[11]。

3 Hippo信號通路YAP-TAZ下游調控

Hippo通路下游調控通過抑制轉錄共激活因子YAP/TAZ、Yki 影響細胞的基因型。有研究表明,YAP和TAZ調節(jié)Notch信號、抗凋亡途徑、轉化生長因子-β(轉化生長因子β)信號、肌動蛋白聚合、Hedgehog信號、哺乳動物雷帕霉素復合體靶標1(MTORC 1)活性、核苷酸生物合成、AKT信號等共同影響肝臟,可通過調控下游抑制其轉錄活性起至關重要的作用[12,13]。

4 Hippo信號在肝臟再生中的信號傳遞

肝細胞和膽管細胞在肝臟損傷后,兩者都會停止靜止和增殖,以恢復肝臟,因此,肝臟具有極強的再生能力。研究發(fā)現(xiàn),當嚴重肝損傷時,膽管細胞能夠轉分化為肝細胞[14,15]。而Hippo在肝臟再生中的信號傳遞已成為研究的熱點。在急性肝損傷模型小鼠中表明,醋氨酚(APAP)過量會導致肝小葉壞死,后激發(fā)肝細胞的增殖,而在具有特異性高活性YAP信號的小鼠,可避免APAP誘導的肝損傷。這可能是由于將APAP代謝成其細胞毒性代謝物所需的基因表達減少所致,對APAP后MST1和MST2的藥物抑制可減少肝細胞死亡[16]。一項薈萃研究發(fā)現(xiàn),從肝細胞中缺失YAP1的小鼠表現(xiàn)出相同水平的肝損傷,但實驗組中由于wnt-β-catenin誘導的肝細胞增殖更快,更有利于肝臟炎癥反應的再生速度[17]。這表明Hippo信號通路在肝再生過程中具有動態(tài)功能。有學者研究發(fā)現(xiàn),小鼠肝部分切除模型中,可誘導肝細胞增殖,直到肝臟恢復正常大小。早期通過肝細胞內磷酸化(非活性)YAP減少和核YAP定位增加,后MST1和MST2的藥理抑制促進了小鼠肝部分切除后肝細胞的增殖和肝再生[18],而肝星狀細胞(HSCs)中的YAP信號也可促進了肝部分切除后的肝再生[19]。一項實驗評估YAP-TAZ在肝再生中的細胞類型特異性作用,小鼠急性肝損傷研究中,造成小葉中心肝細胞死亡,在接觸CCl4肝細胞短時間顯示出YAP-TAZ信號的強烈激活,缺失YAP1和WWTR1并不損害CCl4誘導的肝損傷后的肝再生,而刪除YAP1和WWTR1在膽管細胞中膽汁淤積導致肝再生延遲,這表明肝臟能夠激活替代途徑來補償特定信號途徑的抑制[13]。

5 Hippo信號通路在肝癌中的作用

5.1 Hippo信號通路在肝細胞癌作用 肝細胞癌(HCC)在人HCC標本中發(fā)現(xiàn)有YAP的核聚積,YAP的激活與HCC亞型(Hippo途徑基因、肝干細胞基因)相關,YAP1基因缺乏突變表明Hippo途徑的抑制或在腫瘤發(fā)生過程中[20]。在肝癌中上游機制YAP的激活尚未完全明確。在小鼠中已證明膽汁酸超載可促進肝臟腫瘤的發(fā)生[21]。研究發(fā)現(xiàn),肝臟腫瘤發(fā)生的驅動因素之一為糖原積累,糖原液滴可通過激活YAP促進腫瘤發(fā)生,多項肝細胞癌樣本研究中,早期的惡性病變和小的腫瘤結節(jié)顯示出高糖原含量,經(jīng)過液液相分離的凝聚糖原示,MST1或MST2與糖原結合蛋白Laforin強烈結合,滯留在糖原小滴中,導致YAP在細胞系(HepG2細胞、小鼠肝細胞)中激活和核轉位[22]。肝癌中致癌途徑酪氨酸激酶受體與信號通路相互作用。YAP激活是通過EGFR信號在肝細胞癌中激活PI3K-PDK1誘導,YAP和EGFR抑制劑在肝癌細胞系可協(xié)同誘導細胞毒作用[23]。在肝癌患者腫瘤樣本的分析發(fā)現(xiàn),細胞外基質蛋白多糖集聚蛋白的基因表達增加,會激活YAP活性使肝癌細胞系的腫瘤發(fā)生[23]。有學者研究發(fā)現(xiàn),在肝癌模型中癌基因誘導的小鼠表明,腫瘤基質細胞的激活過過Y AP-TAZ的高活性作用并降低了維替普芬對腫瘤的穿透,證明肝癌耐藥的另一種機制是YAP依賴的藥物轉運受損[24]。已證實通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生是YAP在肝細胞癌中轉錄活性的作用。Camargo等研究表明,NUAK2活性增加肌動蛋白張力及觸發(fā)肌動蛋白聚合促進YAP活性,并且抑制減少了YAP驅動的腫瘤發(fā)生。此外,肝癌細胞侵襲、存活和遷移受激活Notch信號及TEAD4依賴的方式誘導JAG1的YAP活性發(fā)生[25]。

5.2 Hippo信號通路在肝母細胞瘤中作用 肝細胞癌中YAP和β-連環(huán)蛋白存在拮抗關系,在促進肝母細胞瘤方面有協(xié)同作用,在肝母細胞瘤細胞中,YAP-TAZ促進了氨基酸轉運體核苷酸生物合成SLC38A1的表達,觸發(fā)了下游mTORC1的激活和腫瘤發(fā)生[26]。一項薈萃研究表明,在肝母細胞瘤小鼠模型中,腫瘤細胞亞群中的凋亡驅動使YAP-S127A/成分活性的β-連環(huán)蛋白驅動導致腫瘤顯著退化,而存活的腫瘤細胞中部分恢復了肝細胞分化功能,這提示靶向YAP治療肝母細胞瘤可能是一種有效的治療方法[27]。

5.3 Hippo信號通路在膽管細胞瘤中作用 YAP是膽管癌的致癌因素之一。YAP激活與膽管癌細胞侵襲、增殖、染色體不穩(wěn)定性、血管生成及化療耐藥有關[28]。雙重SB-HDTVI介導的NICD和AKT在膽管細胞中的表達導致快速膽管癌細胞的形成[29]。在膽管癌的NICD/Y AP-S127A小鼠模型中,YAP的下游靶點激活mTORC1,Rptor的缺失抑制了腫瘤的發(fā)展[30]。在YAP-AKT驅動的膽管癌細胞中,發(fā)現(xiàn)FGFR信號可上調膽管癌細胞中YAP的表達,抑制劑(PAN-FGFR)可降低腫瘤負擔,因此,機械轉導被認為是膽管癌發(fā)生的另一調節(jié)因素。實驗中YAP-Y357促進膽管癌細胞中的核定位,是通過FAK直接磷酸化實現(xiàn),致癌的FAK和AKT的過表達可導致膽管癌細胞的快速發(fā)展[31]。在膽管癌細胞中刪除WWTR1和YAP1可顯著降腫瘤負擔,除了腫瘤細胞本身外,瘤周肝細胞特異性缺失會增加腫瘤負擔,而在肝細胞癌和膽管細胞癌中亦有瘤周肝細胞中YAP的激活,從而降低了腫瘤負擔[29]。

5.4 Hippo信號通路和癌癥免疫力 Hippo信號通路在癌癥免疫中扮演著新的角色。目前,癌癥免疫治療領域取得了較大的進展。如重新激活T細胞促進腫瘤細胞殺傷的抗PD1/PDL1治療,復發(fā)(耐藥)仍然是臨床上待以解決的問題[32]。研究發(fā)現(xiàn),YAP-TAZ具有抑制抗腫瘤免疫反應的作用,通過TAZ和YAP誘導人黑色素瘤、乳腺癌細胞株和肺癌中PDL1的表達,而PDL1的調控也因物種而異(在小鼠細胞系中不能復制)[33,34]。有研究發(fā)現(xiàn)YAP-TAZ在腫瘤細胞中的表達可促進獲得性免疫抗癌反應,LAT S1和LAT S2的缺失在體外促進了腫瘤的生長,如將腫瘤細胞移植到具有免疫活性的同基因小鼠中,體內的腫瘤生長會受到抑制,此外,增強抗腫瘤免疫與LAT S1和LAT S2的缺失增加了富含核酸的細胞外小泡的產生,刺激I型干擾素反應密切相關[35]。在肝臟中炎癥中YAP-TAZ的激活起促進作用。肝細胞中觸發(fā)免疫細胞由YAP(Lats1/Lats2、Mst1/Mst2)激活的缺失。在小鼠中促進免疫逃避、巨噬細胞募集和腫瘤發(fā)生靠肝細胞致癌的YAP激活誘導CCL2表達相關[36]。相關研究發(fā)現(xiàn),在小鼠NASH模型中,抑制肝細胞中上皮剪接調節(jié)蛋白2(ESRP2)的表達,由慢性炎癥期間釋放的促炎細胞因子所致,ESRP2負責Nf2成熟形式的剪接,ESRP2的缺失會導致YAP-TAZ149活性增加,表明其存在正反饋循環(huán)[37]。因此,YAP誘導的炎癥在腫瘤進展中的作用有待考究。

另有研究對YAP活性的正調節(jié)因子的抑制劑、轉錄調節(jié)因子(溴域包含蛋4),這些抑制物缺乏對 Hippo信號通路的特異性[38]。研究發(fā)現(xiàn),肝臟腫瘤發(fā)生過程中YAP的關鍵下游靶點是NUAK2,其藥物抑制作用單獨抑制了YAP驅動的活體腫瘤生長。有學者研究發(fā)現(xiàn),針對特定類型的細胞抑制YAP-TAZ作用,可特異性對Hippo信號途徑干擾RNA(SiRNA)而配制成靶向肝細胞的脂質納米粒[38,39]。Mooring等[40]研究表明,肝細胞特異性的YAP-TAZ缺失通過肌纖維母細胞擴張及減少炎癥來減少接觸CCl4時的肝纖維化。

6 Hippo信號在慢性肝損傷中的信號傳遞

慢性肝損傷再生與YAP信號相關。慢性膽管炎共性為膽管反應,根據(jù)其損傷程度,膽管反應的細胞可能起源于肝細胞的去分化或膽管細胞的增殖,而Hippo信號正是此過程的關鍵調節(jié)因子,在膽管結扎膽管細胞模型小鼠中,Mx1-Cre缺失肝臟中的YAP 1會削弱BDL78后的膽管反應,增加YAP活性,減少肝細胞的增殖,從而肝細胞的壞死增加[41]。此外,膽管細胞及肝細胞中小鼠YAP 1的缺失,在4-二氫氯仿(DDC)、3,5-二乙氧基甲酰-1飼養(yǎng)中,膽管反應顯著減少,由于CK19+細胞的增殖減少和凋亡增加作用[42,43]。此外,Li等[44]探討肝細胞去分化是膽管反應細胞的主要來源研究發(fā)現(xiàn),其編碼依賴于ATP的SWI/SNF染色質重塑復合體的一個成分,YAP和ARID1a結合是由DDC誘導的HNF4SOX9+肝細胞中的基因發(fā)揮作用,在分離的ARID1A缺失的肝細胞中,靶部位與YAP結合靶基因的表達顯著減少。可見促進YAP介導的轉錄在肝臟再生過程中ARID1A起著至關重要的作用。而在肝細胞中ARID1A和NF2特異性缺失,可激活YAP-TAZ轉錄活性、誘發(fā)肝臟過度生長,甚至肝癌[45]。

7 總結與展望

Hippo信號通路在肝臟中具有細胞類型特異性、復雜性、上下文特異性的作用,包括再生、發(fā)育及癌癥的發(fā)生。雖然Hippo信號通路在干擾疾病方面的研究已經(jīng)取得了進展,但有許多方面仍需要我們去探討,例如YAP誘導的炎癥在腫瘤進展中的作用等。在目前研究成果仍未能滿足臨床需求,開發(fā)抗YAP-TAZ治療肝腫瘤的藥物是一個新的研究方向。同時,調控Hippo信號避免促進肝臟再生的信號失活,可預防腫瘤的發(fā)生。此外,控制肝細胞向膽管細胞轉化的關鍵轉錄或表觀遺傳機制是未來努力的方向。