楊青博 梁佳蕊 孟永宏 劉靚 郭玉蓉 鄧紅

摘要? 以泡菜為原料分離和篩選蘋果汁中具有優(yōu)良發(fā)酵潛力的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）菌株，采用形態(tài)學、生理學和遺傳學對LAB菌株進行鑒定，并評價其在模擬胃腸環(huán)境中的生存能力和發(fā)酵性能。結果表明：從泡菜中篩選的2株菌株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei WFC 414）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum WFC 502）；WFC 414和WFC 502在蘋果汁中發(fā)酵48 h其活菌數(shù)分別達到8.81和9.33 log CFU/mL；2種菌株在模擬胃液（2 h）和腸液（4 h）中，其存活率分別達到92.0%、95.0%和80.7%、83.6%。在4 d的乳酸發(fā)酵過程中，WFC 414和WFC 502降低了蘋果汁中可溶性糖和蘋果酸的含量，產(chǎn)生了大量的乳酸（分別為3.48、5.94 mg/mL）。發(fā)酵蘋果汁揮發(fā)性香氣成分改變，酯類和醛類減少，醇類、酸類和酮類的含量升高，增加了果汁的甜香、果香、花香味。試驗篩選的乳酸菌WFC 414和WFC 502在發(fā)酵果汁行業(yè)有很好的應用潛力。

關鍵詞? 乳酸菌；篩選；發(fā)酵；蘋果汁；評價

中圖分類號? TS201.3? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）09-0139-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening， Identification and Evaluation of Lactic Acid Bacteria WFC 414 and WFC 502 for Apple Juice Fermentation

YANG Qing-bo1， LIANG Jia-rui1， MENG Yong-hong1，2.3 et al

（1. College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062; 2. National Research ＆ Development Center of Apple Processing Technology， Xian， Shaanxi 710119; 3.Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources， Ministry of Education， Xian， Shaanxi 710119）

Abstract? The lactic acid bacteria with excellent fermentation potential were separated and screened for fermented apple juice using pickles as materials in this experiment. These strains were identified with the methods of morphology， physiology and genetics. The fermentation potential and survival ability in a simulated gastrointestinal environment of these strains were evaluated. The experimental results showed that two LAB strains with excellent fermentation potential were Lactobacillus paracasei WFC 414 and Lactobacillus plantarum WFC 502. The viable counts of WFC 414 and WFC 502 in fermented apple juice for 48 h reached 8.81 and 9.33 log CFU/mL respectively， while their survival rates reached 92%， 95%， and 80.7%， 83.6% respectively， in a 2 h simulated gastric fluid and 4 h simulated intestinal fluid. During lactic acid fermentation of 4 d， WFC 414 and WFC 502 reduced the content of soluble sugars and malic acid in apple juice and produced large amounts of lactic acid （3.48 and 5.94 mg/mL respectively）. There was alteration of volatile aroma components in fermentation apple juice， esters and aldehydes were reduced by both strains， while the content of alcohols， acids and ketones was elevated to increase the sweet， fruity， floral aroma of fermented apple fruit juice. These results suggest that WFC 414 and WFC 502 have great potential for application in the fermented juice industry.

Key words? Lactic acid bacteria;Screen;Fermentation;Apple juice;Evaluation

基金項目? 國家自然科學基金面上項目（2017YFD0400700）。

作者簡介? 楊青博（1999—），女，陜西西安人，碩士研究生，研究方向：食品科學。*通信作者，教授，博士，從事蘋果加工與生物發(fā)酵工程研究。

收稿日期? 2023-06-25

微生物發(fā)酵是最常用的食品加工保存方法之一［1］，食物在有益微生物（如lactic acid bacteria，LAB）的作用下，含有的糖類、蛋白質(zhì)、脂類等被分解轉化為獨特的風味和營養(yǎng)成分［2-3］，其中發(fā)酵乳制品酸奶和奶酪等一直廣受世界各地消費者的歡迎。但隨著人們對乳糖不耐受和高膽固醇危害的認識不斷加深，以水果蔬菜等為基礎的發(fā)酵果蔬汁類產(chǎn)品吸引了消費者和食品研究人員的更多關注［4］。目前乳酸菌（LAB）發(fā)酵在果蔬植物發(fā)酵中的應用廣泛［4］，且LAB 廣泛被認為是一種可在機體腸道內(nèi)定殖的益生菌，被證明具有緩解肥胖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，調(diào)控認知功能障礙等多種生物活性［5］，因此發(fā)酵已發(fā)展為一種精心設計的用于制造功能性食品的生物技術。

蘋果含有多種生物活性物質(zhì)，攝入可預防慢性病、癌癥和心血管疾?。?］。鮮榨蘋果汁（not form concentrate，NFC）最大程度保存了蘋果的有效成分（但NFC 保鮮期很短），含有大量的碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［7］，是 LAB 發(fā)酵的優(yōu)良底物。LAB通過發(fā)酵果汁中的碳水化合物產(chǎn)生乳酸，可改善其風味和口感，提高果汁營養(yǎng)和質(zhì)量，并延長果汁貨架期［8-9］。同時，LAB 發(fā)酵的蘋果汁也可改善巴氏殺菌、蒸煮等加工步驟造成的蘋果汁（如濃縮果汁，form concentrate，F(xiàn)C）的不良變化 ［10-11］。但可應用于蘋果汁發(fā)酵的 LAB 菌株十分有限，因此，篩選出更多適合蘋果汁發(fā)酵并能在腸道中定殖的LAB菌株，以增加果汁用益生菌，及擴大發(fā)酵食品領域是亟待解決的問題。

泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其主要由蔬菜上自然附著的微生物發(fā)酵而成，其菌種復雜多樣，營養(yǎng)豐富，更適于食品的發(fā)酵［12］。研究也發(fā)現(xiàn)，與自然界中的微生物相比，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出的 LAB 能夠使果汁產(chǎn)生更加令人滿意的風味，可以對發(fā)酵過程進行標準和安全的控制，并穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量［13-14］。

筆者以泡菜為原料分離LAB，篩選出在發(fā)酵蘋果汁時具有高活性和產(chǎn)香能力強的LAB菌株，對其進行生理生化和基因鑒定，并通過對菌株生長活力，在模擬胃腸道環(huán)境中的存活率，蘋果汁有機酸和可溶性糖含量以及揮發(fā)性香氣化合物等指標進行分析，評價所選定的菌株發(fā)酵蘋果汁的性能優(yōu)劣，為發(fā)酵蘋果汁專用菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供試驗依據(jù)，進一步為豐富新型發(fā)酵果汁領域產(chǎn)品種類及開發(fā)健康營養(yǎng)的商業(yè)化蘋果汁的益生菌類產(chǎn)品提供基礎數(shù)據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料與設備

4種泡菜：購自華潤萬家超市（品牌為甘肅隴漿源、四川鮮籮、沈陽榆園、沈陽比美味）；紅富士蘋果：采自陜西省長武縣蘋果園。試劑：抗壞血酸、甘油、KH2PO4、 H3PO4、 NaCl、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、酒石酸、草酸等，購自天津天利公司；3-辛醇、果糖、 葡萄糖、蔗糖、蘋果酸等購自阿拉??；乙腈、甲醇等購自科密歐。生化鑒定管：青島海博生物公司。MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 肉湯：購自北京奧博星公司。試驗設備：榨汁機，惠人設備公司；恒溫培養(yǎng)箱，培英實驗設備有限公司；高速臺式離心機，賽默飛儀器公司；高效液相色譜，安捷倫；恒溫水浴鍋，杜甫儀器廠；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，日本島津公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 泡菜中菌株的分離與保存。

分別吸取4種泡菜汁各0.1 mL，稀釋后接種于MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。挑取不同泡菜固體培養(yǎng)基上的單個菌落各20個，再進行2次劃線純化培養(yǎng)，純化后的菌株在MRS肉湯中于37 ℃培養(yǎng)24 h得到菌懸液，并置于50%甘油中保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2? 新鮮蘋果汁的準備和發(fā)酵。

挑選新鮮無病蟲害的紅富士蘋果，將蘋果削皮，去核，切成小塊，并立即在0.5%抗壞血酸溶液中浸泡15 s，后使用榨汁機榨取蘋果汁，將分離掉果渣的果汁再用濾布過濾得到蘋果清汁，然后將鮮榨蘋果汁進行巴氏殺菌（果汁加熱至90 ℃并保持微沸20 s），最后趁熱將果汁灌裝入已滅菌的玻璃瓶中，加蓋后倒扣放置，待其自然冷卻至室溫即可得到巴氏殺菌的蘋果汁［10］（pasteurized apple juice，PAJ）。

將“1.2.1”中活化后的菌懸液以 6 000 r/min于4 ℃離心5 min，去上清，并用生理鹽水洗滌菌體2次后等體積重懸。再以 1%（v/v）的接種量接種到巴PAJ中，使發(fā)酵前的果汁中活菌數(shù)約為6 log CFU/mL，在37 ℃下厭氧發(fā)酵48 h，可得到發(fā)酵蘋果汁（fermented apple juice，F(xiàn)AJ）［9，14］。

1.2.3? 菌株的篩選。

初篩采用感官鑒評法對FAJ進行嗅聞，去除發(fā)酵后香氣不明顯和產(chǎn)生明顯不愉快氣味的菌株進行［15］。然后用無菌生理鹽水的標準連續(xù)稀釋法對蘋果汁發(fā)酵前后的活細胞進行計數(shù)。將稀釋后的FAJ樣品接種在MRS瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑選出發(fā)酵過程中活細胞數(shù)增加最多和最快的菌株。同時，將FAJ稀釋后涂在補充有0.7% CaCO3的MRS瓊脂平板上，在37 ℃下倒置培養(yǎng)48 h，觀察是否形成溶鈣圈（有溶鈣圈的菌株被認為有可能是LAB）。20名經(jīng)過培訓的志愿者（10名男性和10名女性）對FAJ的氣味感官特性進行嗅聞評估（香氣分為果香、甜香、草香、花香和刺鼻），采用9分制（0=無，9=特別強）進行打分，并繪制蜘蛛網(wǎng)圖。

1.2.4? 菌株的鑒定和進化樹構建。

1.2.4.1? 生理生化鑒定。①過氧化氫酶活性。將菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，向培養(yǎng)基上的菌落滴加3%過氧化氫溶液，觀察一段時間，產(chǎn)生氣泡則為陽性反應。②明膠液化。將高壓滅菌后的明膠培養(yǎng)基倒入試管中垂直放置凝固，挑取菌株于明膠培養(yǎng)基高層約2/3深度穿刺接種，20 ℃培養(yǎng)7 d。觀察到固體培養(yǎng)基液化則為陽性反應。③吲哚試驗。將菌落接種于鄧亨氏蛋白胨水溶液中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，加入二甲苯2 mL，搖勻后靜置片刻，再沿試管壁加入2 mL吲哚試劑，二甲苯下層液體變紅則為陽性反應。④硫化氫試驗。將菌株穿刺接種于試管中的醋酸鉛培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察到培養(yǎng)基變黑則為陽性反應。

1.2.4.2

糖發(fā)酵試驗。使用生化鑒定管將每個菌株分離物分別與七葉苷、纖維二糖、甘露醇、果糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖接種，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。生化管中由紫色變?yōu)辄S色表示產(chǎn)生了酸，是一種陽性反應。

1.2.4.3? 菌株的DNA鑒定和進化樹構建。對篩選出的菌株16S DNA進行提取、擴增和測序，然后通過美國國家生物技術信息中心（NCBI）的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與儲存在BQ GenBank-EMBL上的已注冊菌株序列進行比對，確定為同源性大于97%的物種。接著選擇相關研究中報道的不同LAB菌株序列，用MEGA X 10.0.2軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹［16］。

52卷9期??????????? 楊青博等? 蘋果汁發(fā)酵用乳酸菌WFC 414和WFC502的篩選·鑒定與評價

1.2.5? 菌株在模擬胃腸道條件下存活率的測定。

模擬胃液（simulated gastric juice，SGJ）和模擬腸液（simulated intestinal juice，SIJ）按照Moayyedi等［17］的方法制備。將1 g LAB細胞接種到9 mL無菌SGJ和SIJ溶液中，37 ℃下以50 r/min的速度在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2和4 h。之后在MRS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)計數(shù)，并計算存活率。

1.2.6? 蘋果汁中可溶性糖和有機酸含量的測定。

將PAJ和FAJ樣品于12 000 r/min離心2 min，上清液通過0.22 μm聚醚砜膜過濾后使用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）對果汁中可溶性糖和有機酸含量進行測定，根據(jù)標準溶液的保留時間和標準曲線進行鑒定和定量。

1.2.7? 蘋果汁揮發(fā)性香氣成分的測定。

1.2.7.1? 頂空固相微萃取。將5 mL蘋果汁樣品和2 g NaCl在20 mL頂空瓶中混合，并加入10 μL 3-辛醇標準品（100 mg/L溶于甲醇）作為內(nèi)標。頂空瓶中加入轉子，于50 ℃水浴鍋中60 r/min磁力攪拌30 min，再使用手動SPME纖維采樣器（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，2 cm）進行萃取，使纖維暴露在頂空瓶中的上部氣體中，繼續(xù)在50 ℃水浴鍋中60 r/min磁力攪拌30 min。之后，將取樣器立即插入GC注射器，在250 ℃下熱解吸3 min。

1.2.7.2? 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）分析。揮發(fā)性香氣物質(zhì)通過GC/MS儀器分離，儀器配備了DB-WAX毛細管柱（30 cm×250 mm×0.25 μm）。使用氦氣（99.999%）作為載氣，流速為3 mL/min。氣相色譜條件：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速度升至100 ℃保持5 min，再以4 ℃/min的速度升至230 ℃保持10 min。質(zhì)譜通過電子電離（EI）模式在70 eV下掃描，得到35～500 m/z 的范圍。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有都進行3組平行試驗，數(shù)據(jù)以平均值（Mean）±標準差（SEM）表示。柱狀圖和折線圖使用 Origin 2021 軟件繪制。單因素方差分析（One-way ANOVA）結合多重比較（Tukey 檢驗），確定組間顯著差異。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用方差分析進行評估，比較試驗采用 SPSS 20.0 的鄧肯檢驗進行驗證；P<0.05 的值被認為具有統(tǒng)計學意義。

2? 結果與分析

2.1? 傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的分離與篩選

研究表明，通過 LAB 發(fā)酵降低pH能夠提高果汁的抗菌性，并提供口感柔和的酸味［18］；此外，發(fā)酵果汁的香氣對最終產(chǎn)品的影響至關重要［19］。因此，應篩選出在發(fā)酵蘋果汁時具有較強的香氣產(chǎn)生能力及較高的活細胞數(shù)，以及明顯降低pH的菌株。從4種泡菜中共分離出80株細菌。首先根據(jù)感官分析對每個菌株的發(fā)酵蘋果汁氣味進行嗅聞，以初篩菌株；其中20個菌株發(fā)酵產(chǎn)生了不可接受的氣味，17個菌株發(fā)酵未產(chǎn)生明顯的香氣，32個菌株發(fā)酵產(chǎn)生較淡的香氣，11個菌株發(fā)酵后產(chǎn)生強烈的香氣。

該試驗對具有強產(chǎn)香能力的這11個菌株進行了二次復篩，結果見表1。由表1可知，WFC 414和WFC 502菌株表現(xiàn)出較強的降低pH和活細胞數(shù)生長能力，發(fā)酵后pH分別為3.97±0.07和3.74±0.05，活菌數(shù)分別為（8.81±0.13）和（9.33±0.12）log CFU/mL，且2株菌在添加碳酸鈣的培養(yǎng)基中都產(chǎn)生了溶鈣圈。

按照“1.2.3”中的方法經(jīng)過氣味感官評價可知（圖1），WFC 414和WFC 502具有較為突出的果香、甜香和花香，較淡的草香，無刺鼻味。因此，選定WFC 414和WFC 502這2個株菌作為蘋果汁發(fā)酵用菌株，并對2個菌株的其他特性進行研究。

2.2? 菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建

2.2.1? 菌株形態(tài)學、生理生化和糖發(fā)酵試驗鑒定。

按照“1.2.4”中的方法進行試驗，通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)WFC 414 和 WFC 502 均為革蘭氏陽性、無運動性、無芽孢的短桿菌（圖2）。2株菌的生化檢測與糖發(fā)酵試驗結果見表2。由表2可知，2株菌均為過氧化氫酶活性陰性，是不液化明膠，不產(chǎn)生吲哚，不產(chǎn)生硫化氫的菌株。

表2顯示，WFC 414 和 WFC 502 對七葉苷、纖維二糖、甘露醇、果糖、水楊苷、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖都有陽性反應，WFC 502 能發(fā)酵蜜二糖和棉子糖，WFC 414 不能。WFC 414 的特性與干酪乳桿菌組的特性相似，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）屬于干酪乳酸桿菌組，它們有許多共同的特征，其表型特別相似［20］。而WFC 502與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的特性一致。盡管這些鑒定方式可以在物種水平上有效區(qū)分菌株，但在遺傳水平上的鑒定更加有力［21］。

2.2.2? 菌株的 DNA 鑒定和進化樹構建。

乳酸菌的微觀和生理生化鑒定只能初步確定其與菌種表型特征的相似性，并不意味著基因型的親緣關系是相近的。試驗進一步通過提取和測序得到2菌株的16S rRNA基因部分片段，在NCBI BLASTn中輸入2株菌的基因片段進行比對，結果顯示，WFC 414（登錄號：OP735581）與 L.paracasei序列的同源性高于 98%，WFC 502（登錄號：OP735580）與L.plantarum的基因序列有 99%的一致性。用鄰接法［16，22］重建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）顯示了這2株菌株的 16S rRNA 基因序列與其他已報道的 LAB 菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關系。

通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹的拓撲結構和菌株的相對位置，確定了WFC 414和WFC 502的菌種屬性。WFC414與L.paracasei菌種的系統(tǒng)發(fā)育支系具有相近的基因型。L.paracasei通常分離自腸道和植物中，并被廣泛、商業(yè)化地應用于發(fā)酵水果、飲料、酸奶等食品中［23］。WFC 502與L.plantarum菌種的系統(tǒng)發(fā)育支系的自舉值為100；L.plantarum是發(fā)酵果汁中常見的LAB，它還被發(fā)現(xiàn)有抑制結腸直腸腫瘤和減輕小鼠的氧化應激等作用［24］?？傊鶕?jù)微觀形態(tài)、生理生化測試以及系統(tǒng)發(fā)育分析，2個篩選菌株WFC 414和WFC 502可以分別確定為L.paracasei和L.plantarum。

2.3? 篩選的菌株在模擬胃腸道環(huán)境中的存活情況

胃液中的酸會抑制和殺死進入胃中的大多數(shù)細菌，能夠耐受胃液和膽汁鹽中的環(huán)境并抵抗酶的消化，是LAB在人體消化系統(tǒng)中生存，在腸道中定殖并發(fā)揮其益生菌功能所需要的特性。試驗篩選的乳酸菌WFC 414和WFC 502在模擬胃液和腸液中的耐受性結果見圖4A、圖4B。

圖4A顯示，當暴露在含有 0.3%胃蛋白酶的低 pH（2.0）的 SGJ 中 2 h 后，WFC 414和WFC 502的相對活力均有所下降。WFC 414的活細胞數(shù)在2 h出現(xiàn)了明顯下降，WFC 502的活細胞數(shù)在1 h明顯減少，但在2 h減少不明顯。2株菌在SGJ中的不同變化過程可能是由于對酸性條件敏感性的不同，WFC 502比WFC 414更敏感，pH的突然變化使其活細胞數(shù)在1 h發(fā)生快速下降。

圖4B顯示，當WFC 414和WFC 502暴露在含有0.2%胰蛋白酶和0.6%膽汁鹽的SIJ中4 h后，WFC 414和WFC 502的相對存活率分別為80.7%和83.6%。在SIJ中的前3 h，WFC 414的活細胞數(shù)持續(xù)下降。然而，WFC 502的活細胞數(shù)僅在1 h減少，最后3 h的變化不明顯。一些乳酸菌只對低pH條件或膽汁鹽條件有很強的耐受性，但在有胃蛋白酶或胰蛋白酶的模擬胃腸環(huán)境下存活率較低，這一現(xiàn)象可能是由于酶的存在破壞了細菌細胞，導致其對低pH和膽汁鹽敏感［25-26］。一些研究使用谷物纖維或多糖固定和保護細菌細胞免受不利因素的影響［27］，然而，這可能會影響果汁產(chǎn)品的口感和味道。因此，篩選出對胃腸道消化有強抵抗力的 LAB 作為果汁發(fā)酵劑至關重要。

由于WFC 414和WFC 502在模擬胃腸道條件下培養(yǎng)后，其存活率很高，試驗認為它們具有較好的益生菌潛力。

2.4? 發(fā)酵蘋果汁中可溶性糖和有機酸的變化

果糖、葡萄糖和蔗糖是蘋果汁中主要的糖類，它們可以被乳酸菌利用和消耗［28］。經(jīng)WFC 414 和WFC 502 發(fā)酵后，蘋果汁中3種糖含量均有所下降，結果見表3。

由表3可知，發(fā)酵2 d后，WFC 414、WFC 502使FAJ中的果糖分別減少了5.40、4.94 mg/mL；之后的2 d中WFC 414繼續(xù)減少了1.81 mg/mL的果糖（而WFC 502不再消耗果糖）。葡萄糖在WFC 414和WFC 502 4 d的發(fā)酵過程中一直保持下降趨勢，最終減少了7.09 mg/mL（P<0.05）和7.47 mg/mL（P<0.05）。FAJ中的蔗糖含量要比果糖和葡萄糖低得多，其消耗量也很小，發(fā)酵4 d后，WFC 414和WFC 502 FAJ中的蔗糖分別降低了2.59和2.36 mg/mL。Jahandideh等［29］在使用LAB發(fā)酵藍莓汁時也觀察到類似現(xiàn)象，不同的LAB對可溶性糖的代謝因菌株而異。

蘋果酸是蘋果汁中最重要的有機酸之一，其向乳酸的轉化是LAB發(fā)酵過程的標志［30］。由表4可知，未發(fā)酵的PAJ中蘋果酸濃度為（2.44±0.07） mg/mL，未檢測到乳酸。發(fā)酵2 d后，觀察到WFC 414和WFC 502對蘋果酸的消耗高達98%和99%。與此同時，菌株產(chǎn)生的蘋果酸酶催化蘋果酸產(chǎn)生乳酸，乳酸含量達到（2.63±0.02）和（3.61±0.12） mg/mL；繼續(xù)發(fā)酵2 d后，蘋果酸含量不再下降，而乳酸含量繼續(xù)顯著增加到（3.48±0.12）和（5.94±0.10） mg/mL，這表明LAB可能有其他的碳源代謝途徑。同時，發(fā)酵后生成的乳酸具有其特有的氣味，對果汁的香氣產(chǎn)生了影響。結合圖1分析，WFC 502中較高的乳酸含量可能使其具有更多的果香和草香，而WFC 414中較少的乳酸突出了甜味和花香味。

在PAJ和FAJ中都檢測到少量的丙酮酸，其含量變化不大。丙酮酸是三羧酸循環(huán)和糖酵解等生物體代謝途徑的中間產(chǎn)物，其可以由葡萄糖通過糖酵解途徑產(chǎn)生，但也可以通過乳酸發(fā)酵途徑轉化為乳酸［31］，其含量可能呈現(xiàn)動態(tài)平衡。FAJ中草酸含量的變化趨勢與丙酮酸相似，沒有顯著性。發(fā)酵前后的蘋果汁中未檢測到檸檬酸和酒石酸，這一結果可能與蘋果品種有關。

2.5? 發(fā)酵蘋果汁中揮發(fā)性香氣成分的變化

果汁中的揮發(fā)性香氣對消費者評價產(chǎn)品有特定的影響。因此，探究WFC 414和WFC 502發(fā)酵對蘋果汁香氣的改變也是綜合評價菌株的方式之一。由表5可知，在PAJ和FAJ中共檢測到59種揮發(fā)性化合物成分，其中有19種醇類，20種酯類，7種醛類，3種酮類，6種酸類以及4種其他類。

醇類是PAJ和FAJ中最豐富的香氣成分之一，醇類能夠為果汁賦予高級的香氣，并且可以作為其他芳香化合物的良好溶劑，促進香氣的保留。PAJ中醇類的種類不多，但含量占總揮發(fā)性化合物含量的48.79%。果汁中的1-己醇有助于產(chǎn)生果香和花香；2-甲基-1-丁醇和1-己醇在PAJ中的含量明顯高于其他醇類，在發(fā)酵后的FAJ中也有不同程度的增加，它們被認為是蘋果汁中的關鍵醇類。

此外，WFC 414發(fā)酵產(chǎn)生了大量的乙醇（108.97 μg/L）、6-甲基-5-庚烯-2-醇（72.64 μg/L）和香葉醇（49.10 μg/L）；這種菌株能夠?qū)⑵咸烟呛桶被徂D化為乙醇，在果汁中產(chǎn)生更明顯的甜香，香葉醇和芳樟醇的產(chǎn)生使FAJ表現(xiàn)出玫瑰和柑橘的香氣。WFC 502發(fā)酵提高了反式-2-己烯醇（11.28 μg/L）的含量（具有樹葉、核桃和水果香氣），Han等［32］的研究中也有類似的結果。2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丁烯-1-醇、1-辛烯-3-醇和1-壬醇在2種發(fā)酵的FAJ中都有產(chǎn)生，它們分別具有像葡萄酒、野莓、蘑菇、新鮮和橙子的香味。WFC 414和WFC 502的發(fā)酵明顯減少了蘋果汁中的1，3-辛二醇含量。因此，乳酸菌的發(fā)酵促進了醇類的產(chǎn)生，豐富了FAJ的背景香氣。

酯類是對蘋果汁香氣貢獻最大的揮發(fā)性化合物之一，是果味香氣的主要來源。在PAJ中共檢測到13種酯類，其中最主要的是2-甲基丁基乙酸酯，這是新鮮蘋果汁的香氣特征物質(zhì)，賦予果汁果味和甜味。PAJ中其他突出的酯類（如丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸壬酯、2-苯基乙酸乙酯），在WFC 414和WFC 502的發(fā)酵過程中幾乎完全被消耗。酯類的減少與其自身的揮發(fā)性有關，也可能是乳酸菌高酯酶的活性促進了酯的降解，在LAB發(fā)酵的楊桃汁和甜瓜汁中也觀察到同樣現(xiàn)象［33］。除了2-羥基-3-甲基戊酸甲酯（果味和焦糖味）在WFC 414發(fā)酵過程中還產(chǎn)生了3種新的酯，即3-羥基己酸乙酯（果味）、異戊酸香葉酯（果味和玫瑰香味）、棕櫚酸甲酯（蠟質(zhì)和鳶尾味）。WFC 502發(fā)酵也增加了3種新的酯類，分別為1，2-乙二醇二乙酸酯（花香味和酒精味）、庚基乙酸酯（朗姆酒和梨香味）、乙酸橙花酯（甜味和柑橘味）。

此外，還檢測到果汁中的一些萜類和酚類化合物，但WFC 414和WFC 502的發(fā)酵都減少了α-法尼烯含量（柑橘味和草藥味），并去除了苯酚（帶有令人不愉快的塑料和橡膠味）。WFC 414發(fā)酵還產(chǎn)生了反式芳樟醇氧化物（呋喃類），增強了FAJ的花香味；WFC 502發(fā)酵產(chǎn)生了丁香酚，使FAJ具有丁香和蜂蜜的香味。香氣是評價蘋果汁的重要指標之一，LAB發(fā)酵是豐富蘋果汁香氣的有效途徑，盡管有些化合物濃度閾值很低，它們?nèi)匀辉诎l(fā)酵過程中影響著蘋果汁的香氣特征和質(zhì)量，這還需要進一步深入探討。試驗篩選的乳酸菌WFC 414和WFC 502發(fā)酵果汁FAJ比PAJ含有更多的揮發(fā)性酸（如2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸和辛酸），酸類物質(zhì)有些會釋放出不易被公眾接受的氣味，但它們也賦予了FAJ獨特的微生物發(fā)酵的香氣［34］。

3? 結論

從泡菜中分離并篩選確定了2個在發(fā)酵蘋果汁中具有令人滿意的細胞活力及產(chǎn)生優(yōu)良香氣能力的菌株，經(jīng)過表型和基因型的鑒定確定2株菌分別為副干酪乳酸桿菌（L.paracasei WFC 414）和植物乳酸桿菌（L.plantarum WFC 502）；這2個菌株在體外模擬的胃腸道環(huán)境中均具有較高的存活率。WFC 414 和 WFC 502 發(fā)酵降低了蘋果汁中的可溶性糖含量（主要是果糖和葡萄糖）；充分代謝了蘋果酸，并產(chǎn)生了大量的乳酸。WFC 414 和 WFC 502 發(fā)酵也使蘋果汁中的揮發(fā)性香氣成分發(fā)生了變化，2菌株都降低了酯類的種類和含量，上調(diào)了果汁的甜香、果香、花香和來自醇類、酮類和酸類的獨特發(fā)酵氣味。

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