左丹丹 尚靜 黃云

摘要? ［目的］研究來(lái)自全國(guó)范圍內(nèi)蕓薹根腫菌的遺傳多樣性，并探索ISSR分子標(biāo)記與Williams生理小種鑒定結(jié)果之間的關(guān)系。［方法］對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，將篩選出的引物對(duì)48株根腫菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增的多態(tài)性條帶建立根腫菌聚類分析圖，對(duì)根腫菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，并與Williams生理小種鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。［結(jié)果］100條ISSR引物中篩選出3條引物能擴(kuò)增48株根腫菌DNA，獲得清晰條帶。ISSR聚類分析結(jié)果可將11號(hào)生理小種與其他生理小種區(qū)分開來(lái)，但不能以Williams生理小種鑒定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)將根腫菌完全區(qū)分開來(lái)，并且根腫菌的地理來(lái)源與其遺傳距離并無(wú)相關(guān)性。［結(jié)論］該研究為利用分子手段鑒別根腫菌生理小種的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 蕓薹根腫菌；ISSR；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)? S432.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）09-0079-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Evaluation of Genetic Diversity of Plasmodiophora brassicae

ZUO Dan-dan1， SHANG Jing2， HUANG Yun2

（1.Meishan Pharmaceutical College， Meishan， Sichuan 620200;2.Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract? ［Objective］To study the genetic diversity of Plasmodiophora brassicae and to explore the relationship between ISSR markers of Plasmodiophora brassicae and Williamsrace identification results. ［Method］100 ISSR primers were screened， and the selected primers were used to amplify the DNA of 48 P.brassicae from all over the country. Based on the amplified polymorphic bands， a cluster analysis chart was established to analyze the genetic diversity of P.brassicae and compare the results with Williamsrace identification.［Result］Three primers were screened out of 100 ISSR primers to amplify the DNA of 48 Plasmodiophora brassicae to obtain clear bands. The results of ISSR clustering analysis could distinguish the Williamsrace No.11 from other races， but could not completely distinguish Plasmodiophora brassicae， and the geographical origin of P.brassicae had no correlation with its genetic distance.［Conclusion］This study lays a certain foundation for the molecular identification of Plasmodiophora brassicae.

Key words? Plasmodiophora brassicae;ISSR;Molecular marker;Genetic diversity

作者簡(jiǎn)介? 左丹丹（1993—），女，貴州貴陽(yáng)人，講師，碩士，從事根腫病及中草藥種植研究。*通信作者，教授，從事植物病理研究。

收稿日期? 2023-07-07；修回日期? 2023-07-28

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的主要發(fā)生在十字花科作物上的一種世界性土傳病害［1-2］，隨著全球范圍內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與運(yùn)輸，根腫菌會(huì)隨著商品的運(yùn)輸而傳播。研究發(fā)現(xiàn)，根腫病發(fā)病時(shí)最高可導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上，危害面積可達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)面積的30%以上［3］，對(duì)十字花科植物的產(chǎn)量和品質(zhì)危害嚴(yán)重。根腫病的主要癥狀為植株根部膨大，秋天葉片變黃，春天營(yíng)養(yǎng)輸送受到阻礙，植株逐漸枯萎，這些癥狀都會(huì)導(dǎo)致作物的產(chǎn)量以及質(zhì)量受到嚴(yán)重影響［4-5］?，F(xiàn)已研究出劃分根腫菌生理小種的幾種鑒別系統(tǒng)，使用范圍最廣的是Williams鑒別系統(tǒng)和ECD鑒別系統(tǒng)。不論是Williams還是ECD鑒別方法，都耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)力需要量大，結(jié)果易受環(huán)境影響，且由于根腫菌田間分離系的異質(zhì)性的影響，生理小種鑒定結(jié)果的解釋通常會(huì)受不均勻反應(yīng)限制［6］。此外，致病基因型可能會(huì)被病根的非致病基因型所掩蓋［7-8］。

前人已有研究表明，根腫菌田間分離系的遺傳多樣性能使病原菌克服植株抗性［9］，這對(duì)根腫病抗性品種的研究是一個(gè)挑戰(zhàn)［10］。近幾年，分子標(biāo)記已用于鑒別根腫菌田間分離系［11-16］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間（ISSR）分析是常用的測(cè)定遺傳多樣性技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)是有很多可見位點(diǎn)，豐富的多態(tài)性，可靠的鑒別信息以及更低的技術(shù)要求及花費(fèi)［17］。因此，ISSR已被廣泛用于檢測(cè)很多物種的遺傳多樣性及變異性［18-24］。

根腫菌現(xiàn)有的生理小種鑒別體系存在很多問(wèn)題，如耗時(shí)長(zhǎng)，勞動(dòng)量需求大，結(jié)果不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響。近年來(lái)，利用分子標(biāo)記方法區(qū)分根腫菌生理小種的研究越來(lái)越多，用分子方法建立起一套快速、科學(xué)的蕓薹根腫菌生理小種鑒定體系已成為研究趨勢(shì)。筆者通過(guò)ISSR分子標(biāo)記方法，對(duì)來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的根腫菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，形成的UPMGA聚類分析圖與生理小種鑒別結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以期探索不同地理來(lái)源的根腫菌與其遺傳背景的關(guān)系以及生理小種的分布與其遺傳背景之間的關(guān)系，為利用分子手段建立生理小種體系的研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 菌株來(lái)源

菌根主要采自我國(guó)根腫病高發(fā)地區(qū)的9個(gè)省市。菌根材料清洗干凈，室內(nèi)晾干后儲(chǔ)藏在-20 ℃冰箱備用。48個(gè)根腫菌材料采樣地點(diǎn)見表1。菌株生理小種采用Williams鑒別體系進(jìn)行鑒定。

1.2? 菌懸液的制備

休眠孢子懸浮液的制備參照馬淑青［25］的方法并進(jìn)行修改：取保存于-20 ℃冰箱內(nèi)的腫根，在25 ℃下腐熟5 d。將根瘤切成小塊，用勻漿機(jī)加入無(wú)菌水打磨3 min左右，打磨后的液體通過(guò)8層紗布過(guò)濾，濾液移入50 mL干凈離心管，靜置10 min左右。將靜置液體的上清液及上層的灰色沉淀移入另一支50 mL干凈離心管中，加30 mL無(wú)菌水懸浮，5 000 r/min離心5 min。留沉淀，加入5 mL 50%蔗糖溶液，用渦旋振蕩儀振蕩，使其混合均勻，5 000 r/min離心10 min。上清液移入另一支50 mL干凈離心管，加45 mL無(wú)菌水，5 000 r/min離心10 min，沉淀溶于45 mL無(wú)菌水中，5 000 r/min離心10 min，留沉淀（該步驟重復(fù)2～3次），沉淀溶于5 mL滅菌水中。4 ℃保存?zhèn)溆茫?4 h內(nèi)提取DNA。

1.3? 休眠孢子DNA提取及DNA質(zhì)量檢測(cè)

DNA的提取采用傳統(tǒng)CATB方法并進(jìn)行改良。配制1.0%瓊脂糖凝膠，倒膠點(diǎn)樣成像，將跑出清晰條帶的DNA保存?zhèn)溆茫磺逦?、被降解的棄去?/p>

1.4? ISSR-PCR擴(kuò)增

ISSR引物來(lái)自加拿大Brithsh Colunbia大學(xué)公布的100條引物，由江蘇金唯智生物技術(shù)合成公司合成。ISSR-PCR反應(yīng)體系總體積15 μL，其中包含1 μL DNA模版（80 ng/μL），0.5 μL引物（10 μmol/L），7.5 μL 2×PCR Mastermix（每1 mL含40 U Taq酶）以及6 μL ddH2O。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序包括94 ℃預(yù)變性持續(xù)5 min，30 s 94 ℃變性、45 s Tm ℃ 復(fù)性、2 min 72 ℃延伸、7 min 72 ℃后延伸共重復(fù)40次，最后于12 ℃ 保存。PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行退火溫度和引物的預(yù)篩選。條帶結(jié)果用2%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

ISSR屬于顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，相同移位上有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，弱帶也記為“1”，形成只有“1”和“0”的二次元數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYSpc-2.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立UPGMA樹狀圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)引物的擴(kuò)增結(jié)果，從100條引物中篩選出3條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性好的引物，分別是888、889、890（圖1～3）。將出現(xiàn)頻率為5%～95%的條帶視為多態(tài)性條帶，3條ISSR引物對(duì)病原菌共擴(kuò)增出44條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為43，多態(tài)性比例為97.73%，平均每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)14.33（表2）。3條引物中引物889的多態(tài)性比例最小，為94.11%，另外2條的多態(tài)性比例均達(dá)到100%。引物擴(kuò)增條帶大小在250～4 000 bp，引物的擴(kuò)增條帶數(shù)在1～17。

2.2? 根腫菌ISSR遺傳多樣性分析

結(jié)果表明，48株根腫菌菌株之間的遺傳相似系數(shù)為0.58～1.00。聚類結(jié)果顯示（圖4），同是來(lái)自江西省南昌市南昌縣的33號(hào)、34號(hào)菌株聚在兩大不同類群上，33號(hào)歸為類群Ⅰ，34號(hào)歸為類群Ⅱ，2菌株遺傳相似系數(shù)只有0.580 5，而來(lái)自四川省涼山州冕寧縣的27號(hào)菌以及來(lái)自安徽省宣城市績(jī)溪縣的39號(hào)菌遺傳相似系數(shù)為1.00，來(lái)自黑龍江省哈爾濱阿城區(qū)的44號(hào)菌以及來(lái)自四川省德陽(yáng)市羅江區(qū)的46號(hào)菌遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.954 5，這說(shuō)明菌株的地理來(lái)源與其遺傳背景相關(guān)性不大。同為11號(hào)生理小種的30號(hào)以及34號(hào)菌歸為類群Ⅱ，遺傳相似系數(shù)為0.772 7，而遺傳相似系數(shù)高達(dá)1.00的27號(hào)以及39號(hào)的菌株為4號(hào)生理小種，遺傳相似系數(shù)為0.954 5的1號(hào)以及2號(hào)菌株，遺傳相似系數(shù)為0.931 8的10號(hào)和11號(hào)菌株以及遺傳相似系數(shù)為0.931 8的33號(hào)、38號(hào)菌株也都是4號(hào)生理小種。4號(hào)生理小種被聚類到多個(gè)支上，同為4號(hào)生理小種的31號(hào)菌和1號(hào)菌遺傳相似系數(shù)為0.647 3，說(shuō)明ISSR聚類分析結(jié)果可以將11號(hào)生理小種與其他生理小種區(qū)分開來(lái)，4號(hào)生理小種遍布遺傳背景差異較大的菌至遺傳背景差異較小的菌。同為7號(hào)生理小種的18號(hào)菌以及14號(hào)菌遺傳相似系數(shù)為0.782 4，但與同為7號(hào)生理小種的46號(hào)菌株的遺傳相似系數(shù)只有0.725 6，說(shuō)明ISSR聚類分析結(jié)果并不能以Williams生理小種鑒定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)把不同根腫菌完全區(qū)分開來(lái)。

3? 討論

關(guān)于根腫菌遺傳多樣性，國(guó)外從1996年就開始進(jìn)行研究。Mller等［26］用RAPD引物對(duì)根腫菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果

表明，引物OPA09對(duì)3個(gè)單孢系擴(kuò)增出了相同的條帶，引物

OPA07擴(kuò)增條帶的結(jié)果與ECD生理小種鑒定結(jié)果一致。Yano等［27］用32條RAPD引物對(duì)來(lái)自日本7個(gè)地區(qū)的16個(gè)

根

腫菌樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，UPGMA聚類結(jié)果顯示，9號(hào)生理小種的2個(gè)菌單獨(dú)聚在一類，與4號(hào)生理小種和1號(hào)生理小種的菌樣區(qū)分開來(lái)，但不能把對(duì)白菜抗病品種有致病性的5個(gè)菌和其他11個(gè)菌區(qū)分開來(lái)。Manzanares-Dauleux等［15］用19個(gè)RAPD引物對(duì)來(lái)自7個(gè)不同田塊的37個(gè)根腫菌單孢分離系進(jìn)行分析，并用some鑒別體系對(duì)這37個(gè)單孢系進(jìn)行生理小種的鑒別，結(jié)果表明，屬于P1生理小種的菌都能在約1 200 bp處擴(kuò)增出1條特異的共有的1個(gè)片段——OPLl4（1 200），對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行膠回收、克隆轉(zhuǎn)化和測(cè)序，建立其SCAR標(biāo)記，設(shè)計(jì)出了用于檢測(cè)P1生理小種的特異性引物。吳健雄［28］用13條RAPD引物對(duì)來(lái)自湖北的24個(gè)根腫菌進(jìn)行擴(kuò)增，并將條帶圖進(jìn)行UPGMA聚類，聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Williams生理小種鑒定結(jié)果與聚類結(jié)果不能一一對(duì)應(yīng)，同一小種間也存在著遺傳差異。柴阿麗等［29］利用肌動(dòng)蛋白和多聚泛素蛋白這2個(gè)位點(diǎn)基因，設(shè)計(jì)出特異性引物對(duì)ActF1/ActR1 和UbiF1/UbiR1 對(duì)來(lái)自我國(guó)11個(gè)省份、12個(gè)寄主的43個(gè)根腫菌樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，根腫菌遺傳變異與地理來(lái)源密切相關(guān)，與寄主無(wú)關(guān)。任靜［30］對(duì)40 份來(lái)源于不同省份和地區(qū)的根腫菌進(jìn)行了SSR 多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，根腫菌生理小種的遺傳分化與其地理來(lái)源有密切關(guān)系。許路陽(yáng)［31］篩選出4 個(gè)SRAP引物組合，對(duì)72 個(gè)根腫菌樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能將9 號(hào)生理小種分離開來(lái)。沈旭［32］采用RAPD 和SRAP 方法對(duì)48 個(gè)根腫菌單孢系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)RAPD 和SRAP 能在一定程度上對(duì)單孢系按照生理小種和地理位置進(jìn)行分類，但并不能完全準(zhǔn)確地區(qū)分生理小種。馬坡等［33］根據(jù)SSR引物聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的根腫菌大多聚類到一起，但同時(shí)存在變異。趙輝等［34］利用SSR技術(shù)對(duì)32 個(gè)主栽油菜品種上分離的 100株油菜根腫病菌的遺傳分化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，油菜根腫病菌的遺傳分化與地理來(lái)源和寄主品種都有著一定相關(guān)性，但主要依賴地理來(lái)源間的差異，相近地理距離的根腫菌有著更近的親緣關(guān)系。

筆者嘗試用ISSR分子標(biāo)記方法將11號(hào)生理小種與其他生理小種的菌區(qū)分開來(lái)，且遺傳相似系數(shù)較高的菌為相同生理小種，這是用ISSR方法探索根腫菌與生理小種之間的關(guān)系，這對(duì)于用分子手段鑒別根腫菌生理小種的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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