王效德 后曉超 李青青 司玉婷 周小平 徐桂萍

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22(普諾賽公司);瑞馬唑侖(恒瑞醫(yī)藥);2-ME2(HIF-1α抑制劑)(MCE公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(索萊寶公司);HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗體、羊抗兔二抗(CST公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HT22細(xì)胞置于含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,在37℃,含有5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 OGD/R誘導(dǎo)[7]HT22細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,用高壓PBS清洗2遍后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基,后將細(xì)胞在含有1% O2、5% CO2、94% N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,導(dǎo)致HT22細(xì)胞缺氧。6 h后進(jìn)行復(fù)氧,棄掉不含血清培養(yǎng)基,重新加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,含5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 篩選瑞馬唑侖作用濃度 將OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]用不同濃度的瑞馬唑侖進(jìn)行處理,24 h后加入MTT試劑,放回溫箱繼續(xù)孵育4 h,4 h后吸除上清,加入DMSO溶液,孵育10 min后,酶標(biāo)儀在570 nm的波長下測(cè)量光密度(OD),細(xì)胞存活率=(OD處理組/OD對(duì)照組)×100%。

1.5 細(xì)胞分組 將HT22細(xì)胞分為對(duì)照組、OGD/R組、瑞馬唑侖組、2-ME2(HIF-1α抑制劑)組、瑞馬唑侖+2-ME2組。對(duì)照組不做處理,正常培養(yǎng);OGD/R組進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo);瑞馬唑侖組進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo)并加入50 μg/mL瑞馬唑侖;2-ME2組進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo)并加入0.5 μmol/L 2-ME2[9];瑞馬唑侖+2-ME2組進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo)并加入50 μg/mL瑞馬唑侖和0.5 μmol/L 2-ME2。藥物均在再灌復(fù)氧注期間給予。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組HT22細(xì)胞活力 24 h后將5組HT22細(xì)胞每孔加入CCK-8溶液(10 μL),放回溫箱孵育2 h,酶標(biāo)儀在450 nm的波長下測(cè)量OD值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5組HT22細(xì)胞凋亡率 24 h后收集5組HT22細(xì)胞,用PBS進(jìn)行漂洗后根據(jù)AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作,流式細(xì)胞儀檢測(cè)5組HT22細(xì)胞凋亡率。

1.8 透射電子顯微鏡觀察5組HT22細(xì)胞自噬小體的形成 24 h后將5組HT22細(xì)胞棄去上清,預(yù)冷PBS輕輕洗滌3遍,胰酶消化細(xì)胞,離心后棄去上清,加入戊二醛固定液過夜固定細(xì)胞,采用超薄切片機(jī)切片,然后將切片用醋酸鈾-枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染,透射電子顯微鏡觀察HT22細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.9 Western blot檢測(cè)5組HT22細(xì)胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá) 24 h后將5組HT22細(xì)胞棄去上清,預(yù)冷PBS輕輕洗滌2遍,加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,將獲得蛋白用BCA法進(jìn)行定量,取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,將條帶通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至PVDF膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜用脫脂乳進(jìn)行封閉,然后再依次過夜4℃孵育一抗(HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ),室溫孵育二抗,將膜ECL避光顯色,掃描條帶保存圖像,并用Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度瑞馬唑侖對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率影響 不同濃度瑞馬唑侖均升高HT22細(xì)胞存活率(P<0.05),當(dāng)50 μg/mL瑞馬唑侖時(shí)細(xì)胞存活率顯著升高,且濃度再次增加時(shí)細(xì)胞存活率變化不明顯,因此本研究后續(xù)選擇50 μg/mL瑞馬唑侖處理細(xì)胞。見表1。

表1 不同濃度瑞馬唑侖對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率影響 %,

2.2 5組HT22細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組比較,OGD/R組HT22細(xì)胞OD450值顯著下調(diào)(P<0.05);與OGD/R組比較,瑞馬唑侖組顯著上調(diào),2-ME2組顯著下調(diào)(P<0.05);與瑞馬唑侖組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組HT22細(xì)胞OD450值顯著下調(diào)(P<0.05);與2-ME2組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 5組HT22細(xì)胞OD450值比較 n=6,

2.3 5組HT22細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較,OGD/R組HT22細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05);與OGD/R組比較,瑞馬唑侖組顯著下調(diào),2-ME2組顯著上調(diào)(P<0.05);與瑞馬唑侖組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組HT22細(xì)胞凋亡率顯著性上調(diào)(P<0.05);與2-ME2組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組顯著下調(diào)(P<0.05)。見表3,圖1。

圖1 5組HT22細(xì)胞凋亡率比較

表3 5組HT22細(xì)胞凋亡率比較 n=6,%,

2.4 5組HT22細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組HT22細(xì)胞形態(tài)正常,線粒體結(jié)構(gòu)完整;與對(duì)照組比較,OGD/R組HT22細(xì)胞線粒體出現(xiàn)裂變,并有少量自噬小體存在;與OGD/R組比較,瑞馬唑侖組HT22細(xì)胞胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量增加,線粒體裂變明顯增加;2-ME2組HT22細(xì)胞胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量減少;與瑞馬唑侖組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組HT22細(xì)胞自噬小體數(shù)量減少。見圖2。

圖2 5組HT22細(xì)胞自噬小體形成(醋酸軸-枸椽酸鉛染色×10 000)

2.5 5組HT22細(xì)胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,OGD/R組HT22細(xì)胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05);與OGD/R組比較,瑞馬唑侖組均顯著上調(diào),2-ME2組均顯著下調(diào)(P<0.05);與瑞馬唑侖組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組均顯著下調(diào)(P<0.05);與2-ME2組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表4,圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)5組HT22細(xì)胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá);A 對(duì)照組;B OGD/R組;C 瑞馬唑侖組;D 2-ME2組;E 瑞馬唑侖+2-ME2組

表4 5組HT22細(xì)胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)比較 n=6,

3 討論

海馬是對(duì)大腦缺血缺氧非常敏感的部位。海馬神經(jīng)元受損可引起認(rèn)知障礙,其中神經(jīng)元凋亡是其重要表現(xiàn)形式[10],因此降低海馬神經(jīng)元凋亡可緩解大腦缺血再灌注時(shí)腦損傷。自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑,可以清除受損的細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11],因此尋找可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并引起適度自噬的藥物具有重要意義。

缺血再灌注導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷,常作為體外研究腦缺血再灌注損傷理想模型[12-13],本文結(jié)果顯示,OGD/R誘導(dǎo)后HT22細(xì)胞活力顯著性降低,凋亡率顯著升高,表明OGD/R誘導(dǎo)導(dǎo)致HT22細(xì)胞損傷。

瑞馬唑侖目前正在開發(fā)中,具有快速鎮(zhèn)靜及更快的恢復(fù)等特點(diǎn)[14]。Xu等[1]研究表明在腦缺血再灌注大鼠模型中瑞馬唑侖可減少梗死體積,減輕皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,表明瑞馬唑侖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究首先篩選瑞馬唑侖作用濃度,然后檢測(cè)瑞馬唑侖干預(yù)后HT22細(xì)胞活力以及凋亡情況,結(jié)果顯示瑞馬唑侖干預(yù)后HT22細(xì)胞活力增加,凋亡率顯著降低,表明瑞馬唑侖對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用。

自噬和凋亡常相互串?dāng)_,適度自噬可及時(shí)清除受損細(xì)胞器,從而防止進(jìn)一步損傷[15],自噬水平在生理?xiàng)l件下較低,但在缺氧條件下可以增加[16],這種增加會(huì)加重傷害,但也可以起到保護(hù)作用[17]。自噬的有效控制對(duì)于開發(fā)缺氧誘導(dǎo)的腦損傷的新治療策略非常重要。有研究表明腦缺血再灌注后增強(qiáng)自噬,減輕腦缺血區(qū)神經(jīng)損傷,保護(hù)腦組織[18],另有研究表明OGD/R誘導(dǎo)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,抑制自噬后加重神經(jīng)元凋亡和損傷[19],上述研究表明適度促進(jìn)自噬將保護(hù)神經(jīng)元。本文結(jié)果顯示瑞馬唑侖干預(yù)細(xì)胞后自噬小體數(shù)量增加表明瑞馬唑侖促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬。

線粒體是細(xì)胞能量代謝中心,在缺氧時(shí)對(duì)細(xì)胞死亡信號(hào)非常敏感,也是活性氧攻擊的“目標(biāo)”[20],HIF-1α/BNIP3是研究較多的線粒體自噬通路,研究表明HIF-1α/BNIP3介導(dǎo)自噬可保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[7]?；谝郧暗难芯?我們假設(shè)瑞馬唑侖通過激活HIF-1α/BNIP3通路發(fā)生自噬,從而發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,瑞馬唑侖干預(yù)后HIF-1α、BNIP3蛋白水平顯著性升高,表明瑞馬唑侖激活HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,本文用HIF-1α抑制劑2-ME2干預(yù)細(xì)胞,抑制HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路從而抑制線粒體自噬,結(jié)果顯示與OGD/R組比較,HT22細(xì)胞損傷加重,活力下降,凋亡率升高,表明抑制HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路加重HT22細(xì)胞損傷。與2ME2組比較,瑞馬唑侖+2-ME2組HT22細(xì)胞損傷減輕,表明瑞馬唑侖可通過增強(qiáng)自噬從而減輕OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷。

綜上所述,瑞馬唑侖可通過激活HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡,從而減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。但本研究尚存在不足之處,是否存在其他通路調(diào)近代此過程仍需進(jìn)一步研究。