董思林 趙振軍 石慧

DOI：10.16783/j.cnki.nwnuz.2024.03.006

收稿日期：2023-12-20;修改稿收到日期：2024-02-20

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1003600）

作者簡介：董思林（1997—），女，黑龍江雞西人，碩士研究生.主要研究方向為毒理學(xué).

E-mail：2501231248@qq.com

*通信聯(lián)系人，男，副教授，博士.主要研究方向為毒理學(xué).

E-mail：zf@ytu.edu.cn

摘要：以HSPA1L基因敲除（HSPA1L-/-）雄性小鼠為研究對象，觀察甲狀腺組織形態(tài)和細(xì)胞凋亡情況，分析Caspase-3蛋白表達(dá)，探討叔丁醇（TBA）的毒性以及HSPA1L在此過程中的作用機制.結(jié)果表明，HSPA1L-/-小鼠甲狀腺的重量隨TBA劑量增加而顯著降低（P<0.05）；甲狀腺上皮濾泡細(xì)胞隨TBA劑量增加而增大，高劑量組甲狀腺濾泡甚至發(fā)生融合現(xiàn)象；甲狀腺細(xì)胞凋亡增強，甲狀腺組織Caspase-3表達(dá)量極顯著增加（P<0.01）.HSPA1L-/-小鼠對TBA暴露更為敏感，TBA造成的傷害顯著增強，提示HSPA1L可能通過負(fù)調(diào)控Caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài).

關(guān)鍵詞：HSPA1L；敲除小鼠；叔丁醇；甲狀腺；凋亡

中圖分類號：Q 256??? 文獻標(biāo)志碼：A??? 文章編號：1001-988Ⅹ（2024）03-0048-07

Effects of tert-butanol exposure on thyroid in HSPA1L

knockout male mice

DONG Si-lin，ZHAO Zhen-jun，SHI Hui

（College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China）

Abstract：

In this study，male mice with HSPA1L gene deletion were studied to observe the thyroid tissue morphology and cell apoptosis，analyze the expression of Caspase-3 protein，and explore the toxicity of TBA and the potential mechanism of HSPA1L.The results showed that the thyroid weight of HSPA1L-/- mice decrease

significantly with the increase of TBA dose（P<0.05）.Thyroid? epithelial follicular cells enlarged with the increase of

TBA dose，and follicular fusion even occured in the high dose group.Cell apoptos

of thyroid tissue were significantly enhanced.The expression of Caspase-3 in thyroid tissue was very significantly increased（P<0.01）.This study showed that HSPA1L-/-mice were more sensitive to TBA exposure，and the damage caused by TBA was significantly enhanced，suggesting that HSPA1L had strong protective effects on inhibiting apoptosis and maintaining cell homeostasis.

Key words：HSPA1L;knockout mice;tert-butanol;thyroid;apoptosis

叔丁醇（TBA， C4H10O）由于其高結(jié)晶溫度（24 ℃）、高蒸汽壓、易升華等特點被視為一種理想的凍干溶媒，可解決水難溶性藥物凍干制劑的制備難題［1-2］，是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工領(lǐng)域的有機溶劑，但是TBA的毒性不容忽視.目前，關(guān)于TBA的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外藥典均未收載［3］.探討TBA的毒性及作用機制，對規(guī)范TBA安全使用具有重要意義.HSPA1L屬于HSP70家族， HSPA1L作為一種應(yīng)激蛋白，在保護細(xì)胞免于凋亡、氧化損傷和基因損傷等方面起關(guān)鍵作用［4］.涉及HSPA1L的應(yīng)激包括缺氧、暴露于紫外線和化學(xué)物質(zhì)、病毒制劑、營養(yǎng)缺乏、手術(shù)、情緒和機械應(yīng)激等［5-8］.

研究表明，HSPA1L蛋白在睪丸、肺等組織中發(fā)揮重要作用，與生殖和腫瘤等有關(guān)［9-11］，但HSPA1L蛋白在甲狀腺中的作用鮮有報道.甲狀腺由甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞組成，促進新陳代謝和生長發(fā)育.甲狀腺對環(huán)境因素的影響非常敏感.研究表明，雙酚A［12-15］、多氯聯(lián)苯［16-19］、高氯酸鹽［20］、重金屬［21］、壬基酚［22］、輻射［23-24］等都會影響甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能.

叔丁醇作為一種廣泛使用的有機溶劑，需關(guān)注其安全性，但其對甲狀腺的影響報道較少.美國國家毒理學(xué)計劃（NTP，1995）研究發(fā)現(xiàn)，在5，10和20 mg·mL-1TBA暴露濃度下，雄性小鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞增生顯著.叔丁醇對雄性大鼠和雌性小鼠有致癌活性，在雄性大鼠中觀察到腎小管腺瘤或癌變事件增加，在雌性小鼠中可觀察到甲狀腺濾泡細(xì)胞腺癌事件有所增加［25］.

文中以HSPA1L-/-雄性小鼠作為研究對象，分析TBA對該小鼠甲狀腺的毒性以及HSPA1L在此過程中的可能作用機制，探討TBA的安全用量，為確定TBA的安全使用標(biāo)準(zhǔn)提供一定的理論依據(jù).

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗動物

C57BL/6野生（WT）型小鼠由濟南朋悅動物有限公司提供，HSPA1L-/-（KO）型小鼠由山東大學(xué)實驗動物中心提供，體重18～25 g，飼養(yǎng)于煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房內(nèi).實驗鼠及實驗方法均符合煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物實驗福利倫理審查要求（B202104-8）.

1.1.2? 主要試劑

動物基因組DNA快速抽提試劑盒，Gel-Red（10000x）、DNA Ladder（0.2-12kb）、PCR Kit with Taq、蘇木素伊紅（hematoxylin-eosn staining，HE）染色試劑盒，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光），WesternBlot凝膠試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司.Caspase-3一抗抗體購自Abcam，二抗購自中山金橋.

1.2? 方法

1.2.1? 小鼠基因型鑒定

剪取2周齡幼鼠的尾部組織0.5 cm提取gDNA，進行PCR擴增.小鼠HSPA1L基因引物序列如下：F1：5′-GAACAAAG ATAGGAAGCCCG-3′，F(xiàn)2：5′-AATGAGGTCCTT TCCTGGCTG-3′，R：5′-GATGACAGAAGTTG TTTCCTTTGGG-3′.擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.待檢測核酸分子量為200～500 bp之間，使用1.5% 瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像儀下觀察條帶.

1.2.2? 叔丁醇暴露實驗

根據(jù)國家毒理學(xué)計劃（NTP）的報告，在一項為期2年的實驗中，飲用水中含2%的TBA對雄性大鼠和雌性小鼠致癌（NTP，1995），本研究選擇0.5%（5 mg·mL-1）TBA作為低劑量組，2%（20 mg·mL-1）TBA作為高劑量組.將野生（WT）型和HSPA1L-/-（KO）型小鼠各分為3組，每組分別暴露于不同濃度的TBA（0，5，20 mg·mL-1）.將TBA直接溶解于飲用水中，動物在此條件下暴露6周后，處死小鼠并收集甲狀腺器官.暴露過程中，每日測量所有組小鼠的體重（BW）和飲水量.

1.2.3? 甲狀腺組織采集及組織病理學(xué)觀察

HSPA1L-/-、WT雄性小鼠頸椎脫臼處死后迅速分離出甲狀腺，用PBS沖洗干凈后吸干水分稱重，器官指數(shù)計算公式為：器官指數(shù)=器官重量/體重.另將甲狀腺組織用4%多聚甲醛固定24 h后進行石蠟包埋、組織切片，HE染色后于顯微鏡下觀察.

1.2.4? 細(xì)胞凋亡檢測

甲狀腺組織的石蠟切片脫蠟后滴加不含DNase的蛋白酶K（20 μg·mL-1），37 ℃孵育15 min；PBS清洗3次，加50 μL TUNEL檢測液，37? ℃避光孵育1 h；PBS清洗3次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察.

1.2.5? 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測

甲狀腺組織的石蠟切片脫蠟后微波爐高火熱激修復(fù)30 min；PBS清洗3次，BSA封閉1 h后，加一抗4 ℃過夜，PBS洗滌后加入熒光標(biāo)記的二抗避光孵育1 h；PBS清洗3次，DAPI孵育5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察.

1.3? 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件、Prism9.0對實驗數(shù)據(jù)進行雙向方差分析，并用Orign軟件繪圖，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2? 結(jié)果與分析

2.1? 叔丁醇暴露實驗

由表1可知，小鼠體重隨周齡增加而增加，但是各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義.由表2可知，高劑量TBA暴露組小鼠飲水量稍少于低劑量組及對照組，但各組每日飲水量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義.

2.2? 基因型鑒定結(jié)果

如圖1所示，WT小鼠擴增出530bp的單條帶，HSPA1L-/-小鼠擴增出343bp的單條帶，雜合基因型小鼠擴增出343bp和530bp的兩條帶.圖1中，1，3，4為HSPA1L-/-小鼠；2，5，6為雜合小鼠；7為WT小鼠.

2.3? WT，HSPA1L-/-雄性小鼠甲狀腺器官重量、臟器系數(shù)分析

HSPA1L-/-小鼠甲狀腺重量隨TBA劑量增加而降低，低劑量組與對照組差異顯著（P<0.05）；高劑量組與對照組差異極顯著（P<0.01）（圖2（a））.

甲狀腺臟器指數(shù)均顯著降低，低劑量組與高劑量組差異顯著（P<0.05）；高劑量組與對照組差異極顯著（P<0.01）.20 mg·mL-1TBA暴露組野生型小鼠與HSPA1L-/-小鼠差異顯著（P<0.05）（圖2（b））.

2.4? WT，HSPA1L-/-小鼠甲狀腺組織病理學(xué)切片分析

病理結(jié)果顯示（圖3），對照組甲狀腺濾泡大小中等，上皮細(xì)胞為單立方或短柱狀，細(xì)胞排列整齊；HSPA1L-/-小鼠甲狀腺濾泡腔隨TBA劑量增加而增大.高劑量組甲狀腺濾泡腔明顯擴大，充滿紅色膠體，少量濾泡腔融合形成巨大濾泡（見紅色箭頭），上皮細(xì)胞萎縮變性（紅色三角形）且部分區(qū)域被炎性細(xì)胞浸潤（藍(lán)色三角形）.

2.5? WT，HSPA1L-/-小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡情況

凋亡結(jié)果顯示，對照組HSPA1L-/-小鼠及對照組野生型小鼠幾乎無凋亡信號，隨著TBA劑量增加，5 mg·mL-1組和20 mg·mL-1組HSPA1L-/-小鼠可見大量凋亡信號（圖4（a））.低劑量組、高劑量組與對照組HSPA1L-/-小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率差異顯著（P<0.01）.野生型小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡信號不明顯，各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義.低、高劑量組野生型小鼠與HSPA1L-/-小鼠間凋亡率存在極顯著差異（P<0.001）（圖4（b））.

2.6? WT，HSPA1L-/-小鼠甲狀腺凋亡蛋白表達(dá)

野生型各劑量組及對照組HSPA1L-/-小鼠Caspase-3處于低表達(dá)狀態(tài)，但Caspase-3蛋白在 HSPA1L-/-小鼠低劑量組及高劑量組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及部分紅細(xì)胞中處于高水平表達(dá)（圖5（a））.用ImageJ分析免疫熒光強度，結(jié)果顯示野生型小鼠各實驗組間熒光信號無較大差異；與對照組相比，TBA低劑量和高劑量組HSPA1L-/-小鼠Caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著增強（P<0.05）.低劑量及高劑量TBA組HSPA1L-/-小鼠與野生型小鼠間存在顯著差異（P<0.01）（圖5（b））.

3? 討論

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌器官之一，主要功能是調(diào)節(jié)機體各種代謝和生長發(fā)育.甲狀腺由大量的濾泡和濾泡旁細(xì)胞組成.濾泡內(nèi)充滿均質(zhì)的嗜酸性膠質(zhì)，膠質(zhì)就是濾泡上皮細(xì)胞分泌的甲狀腺激素.

HSPA1L屬于應(yīng)激或熱休克蛋白家族，在多種組織細(xì)胞中發(fā)揮作用.HSPA1L在生殖系中組成型高表達(dá)，保護男性生殖細(xì)胞免受熱和氧化等外部壓力，具有在多重應(yīng)激后提高睪丸細(xì)胞存活的能力［26］.HSPA1L與精子活動性和精子發(fā)生關(guān)系密切，低活動性精子中HSPA1L表達(dá)顯著降低；與年輕動物相比，老齡動物睪丸中HSPA1L表達(dá)顯著降低，影響精子發(fā)生［27］.HSPA1L也與炎性腸病和肺癌等疾病發(fā)生關(guān)系密切［28］.

本研究結(jié)果顯示，叔丁醇暴露時，HSPA1L-/-小鼠甲狀腺質(zhì)量減輕；TBA高劑量組HSPA1L-/-小鼠甲狀腺濾泡細(xì)胞變形，囊內(nèi)膠狀物質(zhì)擴張，部分濾泡細(xì)胞甚至發(fā)生融合，甲狀腺組織損傷嚴(yán)重.TBA高劑量組HSPA1L-/-小鼠甲狀腺濾泡可見大量凋亡信號，而野生型小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡不明顯，表明HSPA1L可能具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，HSPA1L缺失導(dǎo)致抑制作用減弱，細(xì)胞凋亡增強.

細(xì)胞凋亡通常包括內(nèi)源性途徑、外源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三種.Caspase-3是三條凋亡信號通路的交匯點，是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要執(zhí)行分子，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)蛋白，其激活后可導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆性凋亡［29-30］.HSPA1L是Hsp70家族成員之一，研究表明HSP70在Caspase凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，HSP70在腫瘤細(xì)胞中通過下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和蛋白酶活性起到拮抗凋亡的作用［31-32］.本研究中， TBA低劑量組和高劑量組HSPA1L-/-小鼠Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加，甲狀腺組織細(xì)胞凋亡程度顯著增強.HSPA1L-/-小鼠叔丁醇暴露較野生型小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡更為嚴(yán)重，提示HSPA1L可能通過負(fù)調(diào)控Caspase-3表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài).

盡管叔丁醇用途廣泛，但其毒性不容忽視，TBA應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)國內(nèi)外藥典尚未收載.研究表明，B6C3F1小鼠在飲用水中接觸TBA，TBA濃度為20 mg·mL-1時會降低小鼠存活率并增加濾泡細(xì)胞腺瘤或癌的發(fā)病率［25］. 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞暴露于TBA（20 mg·mL-1） 6 h，細(xì)胞存活率低于對照組80%［33］.TBA（20 mg·mL-1）可導(dǎo)致肝臟小葉中心肥大和肉芽腫，顯著誘導(dǎo)生殖毒性，野生型組小鼠附睪重量減少.TBA對ALDH2-/-小鼠的毒性作用更為顯著，即使暴露于較低濃度的TBA中，ALDH2-/-小鼠的肝損傷和生殖毒性也增加了.基因缺失也許是TBA誘導(dǎo)毒性的一個風(fēng)險因素［34］.本研究中，隨TBA劑量增加，野生型小鼠甲狀腺變化不顯著，但HSPA1L-/-小鼠甲狀腺變化顯著，臟器指數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著增強，HSPA1L缺失使甲狀腺對TBA作用更敏感，與已有報道相似［34］.

綜合上述研究，推測叔丁醇使用濃度低于20 mg·mL-1較為安全.但研究也發(fā)現(xiàn)，叔丁醇對實驗動物作用效果不一致.對雄性大鼠和雌性小鼠有致癌活性，在雄性大鼠中腎小管腺瘤或癌變增加，雌性小鼠中甲狀腺濾泡細(xì)胞腺癌增加.但雌性大鼠中未發(fā)現(xiàn)致癌證據(jù)，雄性小鼠中的證據(jù)難以解釋［35］.因此，叔丁醇的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)還需要進一步研究來規(guī)范.

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（責(zé)任編輯? 陸泉芳）