張俊先 張凱程

［摘 要］2023年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予卡塔林·卡里科和德魯·魏斯曼以表彰他們在核苷堿基修飾方面的發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)使得開發(fā)出針對COVID-19的有效mRNA疫苗成為可能。mRNA疫苗的研發(fā)和利用是全球的熱點。文章從與2023年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎相關(guān)的內(nèi)容，mRNA疫苗的研發(fā)歷程、技術(shù)原理、作用機制及制備過程，mRNA疫苗的臨床應用，mRNA疫苗的發(fā)展前景等方面為中小學生科普mRNA疫苗的相關(guān)知識。

［關(guān)鍵詞］諾貝爾生理學或醫(yī)學獎；mRNA疫苗；研發(fā)

［中圖分類號］? ? G633.91? ? ? ? ［文獻標識碼］? ? A? ? ? ? ［文章編號］? ? 1674-6058（2024）05-0095-04

2023年10月2日，瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡學院的諾貝爾大會宣布，將諾貝爾生理學或醫(yī)學獎項授予匈牙利裔美國科學家卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和美國科學家德魯·魏斯曼（Drew Weissman），以表彰他們在核苷堿基修飾方面的發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)為mRNA疫苗前所未有的開發(fā)速度作出了重要貢獻，使得開發(fā)出針對COVID-19的有效mRNA疫苗成為可能。本文從四個方面為中小學生科普mRNA疫苗的相關(guān)知識。

一、與2023年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎相關(guān)的內(nèi)容

（一）mRNA相關(guān)知識

mRNA即信使RNA，mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，其大小在幾百個核苷酸至數(shù)千個核苷酸之間，一般不穩(wěn)定，壽命較短。mRNA數(shù)占細胞總RNA數(shù)的1%～5%。

mRNA在成熟過程中會發(fā)生RNA編輯，RNA編輯是指通過化學修飾或堿基轉(zhuǎn)化使mRNA的堿基序列發(fā)生改變，從而導致遺傳信息發(fā)生改變。

RNA病毒感染人體時，RNA正鏈翻譯出所需的蛋白質(zhì)，RNA正鏈又在RNA復制酶的作用下復制成雙鏈RNA，雙鏈RNA解旋釋放出正鏈RNA，繼續(xù)翻譯蛋白質(zhì)，負鏈RNA則作為RNA復制的模板。

（二）兩位科學家的研究成果

卡塔林·卡里科和德魯·魏斯曼兩位科學家的研究成果如表1所示。

（三）疫苗知識

滅活疫苗：選免疫應答能力強的病菌首先進行人工培養(yǎng)，再用物理或者化學方法將其殺滅制成疫苗，這類疫苗是死疫苗。

減毒活疫苗：病原體經(jīng)過甲醛處理后，毒性亞單位的結(jié)構(gòu)改變，毒性減弱，但結(jié)合亞單位的活性保持不變，即保持了抗原性。這種疫苗接種后會在體內(nèi)生長繁殖，接近自然感染，激發(fā)的免疫時間長。

類毒素疫苗：有些病原微生物自身所產(chǎn)生的致病作用并不是它本身，而是由它產(chǎn)生的外毒素在起作用，外毒素是一種特殊蛋白質(zhì)，也具有抗原性。類毒素在人體內(nèi)刺激可以產(chǎn)生更高濃度的抗體，免疫效果較好。

mRNA疫苗：mRNA疫苗是繼傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗之后的第三代疫苗。mRNA疫苗分為病毒衍生的自我擴增型和非復制型兩種。自我擴增型mRNA疫苗不僅可以編碼目標抗原，還可以編碼病毒的復制機制。這樣相對低劑量的這類疫苗可以產(chǎn)生高水平的抗原表達。非復制型mRNA疫苗只含有體外轉(zhuǎn)錄好的編碼抗原蛋白的mRNA，且這種合成的mRNA在人體內(nèi)無法自我復制，其結(jié)構(gòu)簡單，體積小，對插入目標抗原轉(zhuǎn)錄本的大小限制更少。由于mRNA進入人體內(nèi)不插入宿主的基因組，因此這種疫苗具有較強的安全性。

mRNA疫苗的特有優(yōu)勢是：①mRNA只在細胞質(zhì)內(nèi)表達抗原，并不進入細胞核；②mRNA沒有感染性，也容易被降解，沒有感染風險；③mRNA能表達出特定的靶蛋白，修飾或優(yōu)化使其穩(wěn)定性和翻譯效率提高；④mRNA的設(shè)計和合成方法簡單方便，容易開展工廠化生產(chǎn)。

二、mRNA疫苗的研發(fā)歷程、技術(shù)原理、作用機制及制備過程

（一）mRNA疫苗的研發(fā)歷程

1961年，雅各布、悉尼·布雷內(nèi)和馬修·梅塞爾森通過實驗證實了mRNA的存在，mRNA被發(fā)現(xiàn)。

1978年，科學家用脂質(zhì)體將 mRNA 轉(zhuǎn)運到小鼠和人類細胞中，以誘導蛋白質(zhì)表達。

1984年，分子生物學家湯姆·馬尼亞蒂斯 （Tom Maniatis） 和邁克爾·格林 （Michael Green）等人用RNA合成酶和其他材料，人工合成了具有活性的mRNA。

1987年，梅爾頓發(fā)現(xiàn)mRNA能激活或抑制蛋白質(zhì)的表達；1987年底，羅伯特·馬龍（Robert Malone）將mRNA鏈與脂肪滴混合，發(fā)現(xiàn)人體細胞能吸收mRNA并產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這是一項里程碑式的實驗。

1993年，開始針對流感病毒的mRNA疫苗在鼠身體上的測試。

1995年，開始針對癌癥的mRNA疫苗在鼠身體上的測試；1995年，卡塔林·卡里科誘導細胞產(chǎn)生了具有治療作用的蛋白質(zhì)。

1997年，卡塔林·卡里科和德魯·魏斯曼開發(fā)了一種基于mRNA的 HIV/AIDS 疫苗，但將其注射到小鼠體內(nèi)后，引發(fā)了大規(guī)模的炎癥。發(fā)現(xiàn)原因是：合成的mRNA會激活一系列Toll樣受體的免疫傳感器［1］，它們會充當病原體的危險信號。隨后，兩人發(fā)現(xiàn)重新排列mRNA的一個核苷酸（尿苷）的化學鍵，并用天然的修飾堿基，即用假尿苷代替尿苷的mRNA堿基，可以大大減少炎癥反應，這樣，他們就發(fā)現(xiàn)了防止mRNA觸發(fā)破壞性免疫反應的方法，清除了mRNA疫苗在臨床應用上的關(guān)鍵障礙。

2013年，德國慕尼黑大學醫(yī)院醫(yī)學中心對狂犬病mRNA疫苗進行首次臨床試驗。

2015年，開始對流感的納米mRNA疫苗進行首次臨床試驗。

2017年，開始進行mRNA腫瘤疫苗應用于治療黑色素瘤患者的臨床試驗［2］。雖然mRNA疫苗已進入臨床試驗，但一直沒有正式投入臨床應用。

2020年，新冠疫情蔓延全球，危害人類生命。為此，美國食品藥品監(jiān)督管理局通過了Moderna和BioNTech兩家公司的新冠mRNA疫苗授權(quán)，并開始疫苗接種，這使得mRNA疫苗在研發(fā)和應用方面進展加快，對拯救人類生命起了很大的作用。

（二）mRNA疫苗的技術(shù)原理、作用機制及制備過程

1. mRNA疫苗的修飾技術(shù)

mRNA疫苗是一種外源核酸，進入人體內(nèi)容易被識別和降解。保證mRNA疫苗的穩(wěn)定性和免疫活性的方法為采用修飾技術(shù)，主要包括：①通過引入抗反轉(zhuǎn)帽子的類似物，能提高mRNA的翻譯效率，在抗反轉(zhuǎn)帽子的類似物的基礎(chǔ)上修飾Cap結(jié)構(gòu)，能提高mRNA的穩(wěn)定性，防止核酸外切酶對其降解；②修飾Poly（A）尾巴的長度（保持在100至120個核苷酸），可以調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率；③5′UTR的長度和結(jié)構(gòu)對翻譯起始有重要影響，3'UTR區(qū)域引入Kozak序列能加強起始密碼子的識別， 在5′UTR和3'UTR區(qū)域內(nèi)引入穩(wěn)定元件增加可調(diào)控序列，讓mRNA更容易翻譯，避免錯誤啟動，能顯著提高mRNA的穩(wěn)定性；④優(yōu)化mRNA序列，修飾核酸，減少固有免疫激活，提高翻譯效率；⑤在mRNA開放閱讀框（ORF）中，用常用密碼子去代替不常用密碼子，可以提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率［3］。

2. mRNA疫苗的作用機制

mRNA疫苗發(fā)揮作用一般需要經(jīng)過以下步驟：一是mRNA被各種載體包裹；二是通過注射進入人體；三是包裹mRNA的脂質(zhì)體通過胞吞進入細胞內(nèi)；四是mRNA在細胞內(nèi)釋放后利用人體細胞器翻譯并表達抗原蛋白，刺激人體產(chǎn)生相應免疫反應。如圖1所示是mRNA疫苗的作用機制圖。

3. mRNA疫苗的制備過程

第一步，從冷庫中提取病毒的DNA。

第二步，將大腸桿菌以及質(zhì)粒的細胞裝在實驗瓶中并促使細胞生長繁殖。

第三步，將生長繁殖了一晚的細菌轉(zhuǎn)移至一個含300升營養(yǎng)液的容器里，發(fā)酵混合物。

第四步，將發(fā)酵四天后的細菌用一種化學物質(zhì)來分解細菌的細胞壁，采集并凈化DNA。

第五步，將提取出來的質(zhì)粒進行質(zhì)量檢測，以確認剛剛生產(chǎn)的質(zhì)粒病毒基因序列并沒有出現(xiàn)變異。

第六步，把病毒基因從環(huán)狀切割成直線段，即把環(huán)狀質(zhì)粒切割開來。

第七步，將已經(jīng)很純的混合物進行凈化，用于濾出任何殘留的細菌或質(zhì)粒片段，凈化DNA。

第八步，將每瓶DNA冷凍、裝袋、密封，放入一個裝有足夠干冰的容器里進行運輸。

第九步，解凍DNA，并摻入由mRNA組成的部分，一段時間后，酵素將DNA模板轉(zhuǎn)化為mRNA，即進行DNA到mRNA的轉(zhuǎn)變。

第十步，需要反復測試過濾后的mRNA，以確保其精確度以及基因序列的準確性，即mRNA檢測。

第十一步，將mRNA在-20 ℃下冷藏、打包和再次運輸。

第十二步，準備mRNA，收到mRNA的包裹后，保持冷凍直到需要用時。

第十三步，準備脂質(zhì)，這種物質(zhì)能保護mRNA進入人體細胞時不會被破壞。

第十四步，制作mRNA疫苗，當脂質(zhì)和mRNA 片段相遇時，電極以毫微秒的速度將它們聚集起來，mRNA 片段被納米脂肪粒包裹起來形成一個疫苗顆粒。

第十五步，準備疫苗瓶，并清洗和高溫消毒。

第十六步，罐裝疫苗。將0.45毫升疫苗注射到一個瓶子，稀釋后，成為6個劑量的疫苗。

第十七步，打包、冷藏和測試。灌注完的疫苗經(jīng)過檢查貼上標簽，然后放進盒子里打包，盒子要在-70 ℃的極冷溫度下冷凍數(shù)天，同時送檢該批次的疫苗。

第十八步，打包和運輸成品疫苗。給測試合格的疫苗裝上溫度計，并放45磅的干冰。

這樣，mRNA疫苗就制備好了，下一步就是接種疫苗了。

三、mRNA疫苗的臨床應用

mRNA疫苗技術(shù)的落地，是人類文明史上的又一次“盜火”。目前，mRNA疫苗制備技術(shù)不斷更新，多種mRNA疫苗研發(fā)速度快，并在臨床研究和臨床應用上取得了較好的結(jié)果。

目前，全球范圍內(nèi)布局mRNA疫苗的三巨頭分別是德國的BioNTech和CureVac、美國的Moderna。我國布局該領(lǐng)域的主要有艾博生物、珠海麗凡達、斯微生物、深信生物、藍鵲生物、美諾恒康、瑞吉生物、海昶生物、厚存納米、嘉晨西海等企業(yè)，它們有的是中外合資企業(yè)，有的是海歸團隊創(chuàng)立的企業(yè)。

首個用于疾病預防的mRNA疫苗是流感疫苗，由于流感病毒容易發(fā)生變異，因此缺少有效的廣譜性疫苗?，F(xiàn)在研發(fā)的mRNA疫苗對甲型流感具有明顯的預防保護作用。針對SARS-CoV-2引起的疫情，多個國家采用多種技術(shù)進行相關(guān)疫苗的研發(fā)。BNT162b2疫苗和mRNA-1273疫苗，臨床試驗效果較好；已開展了肺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤樹突狀細胞疫苗的臨床試驗。另外，mRNA疫苗在抗細菌和寄生蟲感染方面也有應用。

四、mRNA疫苗的發(fā)展前景

mRNA疫苗是一種新型疫苗，它改變疫苗接種方式，為預防傳染病提供新的解決方案，并為人們提供一種更安全、更有效的疫苗接種方式。

mRNA疫苗在研發(fā)、生產(chǎn)等方面具備諸多優(yōu)勢。一是研發(fā)周期短、抗原選擇范圍廣（廣泛應用于預防傳染病、抗腫瘤以及蛋白替代療法等領(lǐng)域）；二是安全性高；三是有效性高且穩(wěn)定；四是生產(chǎn)難度低、速度快且安全；五是能同時激活體液免疫和細胞免疫，效果顯著。

我國“十四五”醫(yī)藥工業(yè)規(guī)劃就提升mRNA疫苗供應能力及其質(zhì)量技術(shù)水平提出了新的要求。由于RNA病毒大多數(shù)為單鏈，遺傳信息一般在一條鏈上，且RNA病毒具有快速變異特性，因此mRNA疫苗市場需求巨大。

據(jù)統(tǒng)計，2020年，全球mRNA藥物市場規(guī)模（不含新冠）約為39億美元，預計到2025年超過63億美元。加上新冠方面，按照投產(chǎn)和接種進度，將為全球mRNA藥物行業(yè)帶來超690億美元的市場規(guī)模增幅。

［? ?參? ?考? ?文? ?獻? ?］

［1］? 陳彥，孫英.mRNA疫苗研究進展：2021年拉斯克獎臨床醫(yī)學研究獎 ［J］.首都醫(yī)科大學學報，2021（5）：893-899.

［2］? 生命科學前沿.mRNA疫苗制造的19個步驟：以新冠mRNA疫苗為例［EB/OL］.（2023-10-24）［2023-12-23］.https：//mp.weixin.qq.com/s？__biz=MzAxNzEwNjY2MA==&mid=2651110758&idx=5&sn=1517448

eda8adf95adb83f5ab8322cbd&chksm=801a8eedb76d07fb8dc1c80565ea4a783d627f47e411d4c2663214eb6173b67002077c9b5f35&scene=27.

［3］? 未來智庫.醫(yī)藥行業(yè)專題研究報告：mRNA疫苗前景廣闊［EB/OL］.（2022-02-21）［2023-12-23］.https：//zhuanlan.zhihu.com/p/470160697.

（責任編輯 黃春香）