李玥 王興榮 張彥軍 王紅梅 祁旭升

收稿日期：2024 - 01 - 18

基金項目：蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2022-RC-64）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學院科研條件建設(shè)及成果轉(zhuǎn)化項目（重點研發(fā)計劃）（2021GAAS04）；2022年省級重點人才項目（農(nóng)作物種質(zhì)資源保護利用與人才培養(yǎng)）（2022RCXM083）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學院青年基金項目（2023GAAS34）。

作者簡介：李? ?玥（1987 — ），女，山東濟南人，助理研究員，碩士，主要從事大豆種質(zhì)資源與遺傳育種研究工作。Email： lyue31@126.com。

通信作者：祁旭升（1966 — ），男，甘肅會寧人，研究員，主要從事大豆種質(zhì)資源與遺傳育種研究工作。Email： qixusheng6608@sina.com。

摘要：為篩選出大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定的適宜試驗條件，以大豆品種隴中黃601、懇鑒豆15、九農(nóng)29、長農(nóng)16為供試材料，采用蛭石法和濾紙法進行發(fā)芽試驗，運用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internally Transcribed Spacer，ITS）序列分析法進行發(fā)芽床篩選，測定各供試大豆品種的發(fā)芽率、硬實豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并進行了蛭石濕度和PEG-6000濃度篩選。結(jié)果表明，蛭石法發(fā)芽試驗能明顯減少大豆發(fā)芽試驗中產(chǎn)生霉菌的種類與數(shù)量，適宜在大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定中應(yīng)用。且在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%的條件下，不同大豆品種間的發(fā)芽率差異比較明顯，硬實豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)少，試驗數(shù)據(jù)可靠，可作為大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定試驗的適宜條件。且在此條件下，4個供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長農(nóng)16、懇鑒豆15。

關(guān)鍵詞：大豆；萌發(fā)期；抗旱性鑒定；蛭石法；發(fā)芽床；蛭石濕度；PEG-6000濃度

中圖分類號：S565.1? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2024）04-0337-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.04.007

Study on the Methods for Drought Resistance Identification of Different Soybean Varieties at Germination Stage

LI Yue， WANG Xingrong， ZHANG Yanjun， WANG Hongmei， QI Xusheng

［1. Crop Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in the Cold and Arid Northwest Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs

（Jointly Established by the Ministry and Province）， Lanzhou Gansu 730070， China］

Abstract： To select appropriate experimental conditions for the identification of drought resistance during the germination period of soybeans， varieties Longzhonghuang 601， Kenjiandou 15， Jiunong 29， and Changnong 16 were used as test materials. Germination tests were conducted using vermiculite and filter paper methods， with screening of germination beds through Internally Transcribed Spacer （ITS） sequence analysis. The germination rate， number of hard beans， and number of moldy beans were measured， along with selection for vermiculite moisture and PEG-6000 concentration. Results showed that the vermiculite method significantly reduced the types and quantities of molds in soybean germination tests， making it suitable for drought resistance identification during the germination period. At a vermiculite moisture of 170% and PEG-6000 concentration of 22%， significant differences in germination rates among the soybean varieties were observed， with fewer hard and moldy beans， providing reliable test data. These conditions are suitable for drought resistance identification tests during the soybean germination period. Under these conditions， the drought resistance of the 4 soybean varieties ranked from strongest to weakest as followed Longzhonghuang 601， Jiunong 29， Changnong 16 and Kenjiandou 15.

Key words： Soybean; Germination stage; Drought resistance identification; Vermiculite method; Germination bed; Vermiculite moisture; PEG-6000 concentration

大豆為豆科大豆屬一年生雙子葉草本植物，是世界上最重要的豆類作物，具有食用、飼用和釀造等多種應(yīng)用價值。大豆生長期需水較多，水分對大豆的產(chǎn)量形成具有重要的作用［1 - 2 ］。隨著全球氣候的變化，干旱已成為全球最大的自然災害之一，干旱脅迫下作物各時期的生長發(fā)育都會受到影響，成為影響作物產(chǎn)量的重要障礙因子［3 ］。萌發(fā)期是大豆整個生活史的關(guān)鍵階段，如果萌發(fā)期水分不足，容易出現(xiàn)缺苗斷壟現(xiàn)象，最終導致產(chǎn)量及品質(zhì)降低［4 - 6 ］。萌發(fā)期抗旱性鑒定也是大豆抗旱性鑒定研究的關(guān)鍵，鑒定大豆萌發(fā)期抗旱性、篩選抗旱種質(zhì)資源，對大豆抗旱品種選育、抗旱機理及干旱調(diào)控緩解機制研究具有重要意義。

國內(nèi)外研究表明，作物品種間萌發(fā)期的抗旱性存在很大差異。陳學珍等［7 ］在干旱脅迫下對20個大豆品種進行芽期抗旱性鑒定，獲得丹豆6、海94和蒙城小黑豆等3份抗旱性種質(zhì)；肖佳雷等［8 ］對78份大豆種質(zhì)資源進行了發(fā)芽期抗旱鑒定，獲得耐旱品種5個、較耐旱品種18個；Nayer等［9 ］對玉米品種704和301進行聚乙二醇（PEG-6000）誘導的水分脅迫研究表明，品種704的萌發(fā)率下降幅度高于品種301；Kumar等［10 ］和Delachiave等［11 ］一致認為，在干旱脅迫下，作物不同品種間差異顯著；Willanborb等［12 ］ 的研究顯示，包衣種子的萌發(fā)特性受到滲透脅迫的影響。研究者對不同大豆品種的抗旱性進行評價研究的結(jié)果顯示，不同品種抗旱性可歸為抗旱型品種、干旱敏感型品種和較抗旱型品種［13 - 16 ］。

利用聚乙二醇（PEG-6000）高滲溶液模擬干旱脅迫來研究種子萌發(fā)期的抗旱性是目前實驗室最常用的手段［4， 8， 17 - 20 ］。梁崢等［17 ］在30%的PEG- 6000濃度下研究了大豆子葉中幾種酶活性和可溶性蛋白含量的變化。張榮平等［18 ］采用15%、30%、45%等3種PEG-6000濃度處理大豆種子，研究了各處理對大豆種子下胚軸脂敘合酶活性及脯氨酸含量的影響。顧龔平等［19 ］采用20%的PEG-6000濃度處理研究了其對大豆幼苗活力和活性氧代謝的影響。舒英杰等［20 ］認為，室內(nèi)采用 PEG-6000 浸種法模擬干旱脅迫鑒定大豆發(fā)芽期耐旱性的適宜濃度為20%～25%。綜上研究結(jié)果認為，PEG-6000模擬干旱脅迫的濃度因作物和品種而異，利用濾紙作為基質(zhì)進行的發(fā)芽試驗，盡管采取了無菌處理和每天更換溶液，但在PEG-6000脅迫處理下與空白對照均會出現(xiàn)硬實豆和豆粒發(fā)霉的現(xiàn)象，這極大地影響了試驗數(shù)據(jù)的準確性，進而影響了對種質(zhì)資源的篩選評價。

本研究利用不同發(fā)芽床、不同濃度的 PEG- 6000 模擬干旱脅迫篩選處理濃度和不同蛭石濕度等試驗條件，分析適于進行大豆種子萌發(fā)期抗旱性鑒定的條件，以期為利用滲透脅迫鑒定大豆種子萌發(fā)期的抗旱性提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試大豆材料為隴中黃601、懇鑒豆15、九農(nóng)29、長農(nóng)16，均由國家作物種質(zhì)資源庫（甘肅分庫）提供，其中隴中黃601田間表現(xiàn)抗旱性較高，懇鑒豆15抗旱性較弱。供試蛭石（1～3 mm）和PEG-6000（Molecular Biology Grade）均采購于蘭州博域生物科技有限責任公司。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 濾紙法發(fā)芽試驗? ? 選擇大小、色澤一致，飽滿、種皮完好的大豆種子，用10% NaClO溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗4～5次。按照30粒/皿的標準置于直徑為15 cm、鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，分別加入30 mL體積濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液，置于光照培養(yǎng)箱中在（25±1）℃、光照16 h的條件下催芽培養(yǎng)，利用稱重法每天向培養(yǎng)皿中補充加水。3次重復。

1.2.2? ? 蛭石法發(fā)芽試驗? ? 按照設(shè)定的蛭石濕度（110%、130%、150%、170%、190%）將蛭石分別與溶劑（無菌水/濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液）混合均勻后，各取35 g平鋪在直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，按照30粒/皿的標準均勻放置用濕巾揉搓干凈的大豆種子，再覆蓋一層混合均勻的蛭石至培養(yǎng)皿上邊緣，用保鮮膜包好，在保鮮膜上扎10個小孔，放入人工培養(yǎng)箱中，在溫度為23 ℃、相對濕度為85%、光照16 h的條件下催芽培養(yǎng)。3次重復。

1.3? ?蛭石濕度確定

蛭石濕度=（溶液體積×100）/蛭石干重

發(fā)芽培養(yǎng)按照1.2.2 蛭石法發(fā)芽試驗設(shè)計進行。共設(shè)5個蛭石濕度，分別為110%、130%、150%、170%、190%，3次重復。于培養(yǎng)第7天統(tǒng)計大豆發(fā)芽數(shù)、硬實豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并計算各大豆品種的發(fā)芽率。

1.4? ?PEG-6000適宜濃度確定

共設(shè)5個PEG-6000濃度處理，分別為20%、21%、22%、23%、24%。3次重復。以1.3確定的蛭石濕度準備培養(yǎng)基質(zhì)，于培養(yǎng)第7天統(tǒng)計大豆發(fā)芽數(shù)、硬實豆數(shù)、發(fā)霉豆數(shù)，并計算各大豆品種的發(fā)芽率。

1.5? ?ITS序列分析

將2種方法中出現(xiàn)的不同顏色、不同形態(tài)的霉菌采用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit（Cat No. 47014 /47016） 進行核酸提取，檢測核酸完整度和濃度后送蘇州佳世生物技術(shù)有限公司進行ITS序列分析。使用高保真酶對DNA樣本進行擴增，并使用Invitrogen Qubit 4.0 熒光定量儀進行濃度定量。使用KAPA Hyper Prep Kit 進行文庫構(gòu)建，使用 Illumina NovaSeq 進行測序。

1.6? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用 Microsoft Excel 2013 整理試驗數(shù)據(jù)，用IBM SPSS 19 進行統(tǒng)計分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?萌發(fā)試驗發(fā)芽床確定

濾紙法發(fā)芽試驗和蛭石法發(fā)芽試驗均于試驗第7天分別出現(xiàn)5種和2種不同顏色、不同形態(tài)的霉菌（封三圖1），對其進行基因組DNA提取，并將提取的DNA樣品送蘇州佳世生物技術(shù)有限公司進行ITS序列分析，首先對原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進行過濾處理，對處理后的數(shù)據(jù)進行去接頭、拼接、過濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。將有效數(shù)據(jù)與真菌UNITE數(shù)據(jù)庫（https： //unite.ut.ee）按照97%的相似度進行比對，進行物種分類，獲得物種匹配數(shù)。ITS序列分析結(jié)果（封三圖2）顯示，濾紙法發(fā)芽試驗共出現(xiàn)9個屬（嗜熱真菌屬、德克酵母屬、念珠菌、根酶菌屬、布氏白粉菌屬、馬拉色菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、維多利亞維希尼克氏酵母）的真菌，蛭石法發(fā)芽試驗共出現(xiàn)3個屬（根酶菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬）的真菌，而且蛭石法發(fā)芽試驗中匹配上的霉菌數(shù)明顯比濾紙法的少。由此可見，蛭石法發(fā)芽試驗能明顯減少霉菌種類與數(shù)量，可保證發(fā)芽試驗結(jié)果的準確性。同時，蛭石法發(fā)芽試驗取消了清洗種子和每天加水的步驟，明顯降低了試驗工作量和試驗投入成本。綜上認為，蛭石發(fā)芽床更適宜進行大豆萌發(fā)期抗旱性研究，蛭石法可替代溶液濾紙法應(yīng)用于大豆萌發(fā)期的抗旱性研究。

2.2? ?蛭石濕度的確定

由圖3可知，隨著蛭石濕度的增加，各供試大豆品種的發(fā)芽率均呈先增加再降低的趨勢。其中在170%的蛭石濕度條件下，各供試大豆品種發(fā)芽率均達到90%以上（圖3-A）。在該條件下，懇鑒豆15的硬實豆數(shù)為3.0粒，隴中黃601、長農(nóng)16、九農(nóng)29的硬實豆數(shù)均為0（圖3-B）；懇鑒豆15、長農(nóng)16的發(fā)霉豆數(shù)均為2.0粒；隴中黃601、九農(nóng)29的發(fā)霉豆數(shù)均為0（圖3-C）。根據(jù)以上結(jié)果，最終確定發(fā)芽試驗最佳蛭石濕度為170%。

2.3? ?PEG-6000濃度篩選

從表1可以看出，4個大豆品種在不同PEG-6000濃度處理下發(fā)芽率均受到不同程度的抑制。當PEG-6000濃度達到23%以上時，4個供試大豆品種的平均發(fā)芽率均低于45%，出苗率過低，幼苗生活力極差，已失去生產(chǎn)意義，不適合用于模擬干旱脅迫。PEG-6000濃度為22%時，4個供試大豆品種的發(fā)芽率均在50%以上，且出現(xiàn)發(fā)霉豆數(shù)和硬實豆數(shù)的比例均低于PEG-6000濃度為20%、21%的處理，而硬實豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)情況的存在，會嚴重影響試驗的準確性，因此在發(fā)芽試驗中應(yīng)盡可能降低硬實豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)所占的比例。當PEG-6000濃度為22%時，不同大豆品種的發(fā)芽率有明顯差異，其中隴中黃601與其余品種差異均達顯著水平；九農(nóng)29與懇鑒豆15差異不顯著，但與長農(nóng)16差異達顯著水平；懇鑒豆15與長農(nóng)16差異不顯著。由此可見，22%的PEG-6000濃度適合作為模擬干旱脅迫的PEG濃度。且在此濃度脅迫下，4個供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長農(nóng)16、懇鑒豆15，與田間表現(xiàn)一致。

3? ?討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的前提，是對環(huán)境因素最為敏感的階段。隨著環(huán)境干旱的不斷加重，對種子萌發(fā)的影響也越來越大。目前，多數(shù)學者們采用PEG-6000模擬干旱脅迫用于篩選和鑒定作物的抗旱性，并在小麥、棉花、玉米、苜蓿、紫蘇等作物上篩選到了抗旱性較好的品種［21 - 25 ］。李鳳珍等［26 ］采用濾紙法發(fā)芽床，經(jīng)20% PEG-6000滲透脅迫處理，篩選出強抗旱性品種小紅麥；魯守平等［27 ］在 PEG-6000 模擬干旱脅迫條件下篩選出抗旱性較強的烏拉爾甘草1號和烏拉爾甘草2號。本研究采用PEG-6000模擬干旱法研究了大豆種質(zhì)資源抗旱性鑒定方法，將發(fā)芽床由普遍使用的濾紙?zhí)鎿Q為蛭石，大大降低了大豆較難解決的萌發(fā)發(fā)霉豆數(shù)和硬實豆數(shù)問題，提高了試驗結(jié)果的可靠性。最終確定大豆萌發(fā)期PEG-6000最適脅迫濃度為22%、蛭石最適濕度為170%。在該試驗條件下，降低了大豆萌發(fā)期研究中出現(xiàn)的較難解決的發(fā)霉豆數(shù)和硬實豆數(shù)問題，提高了試驗結(jié)果的可靠性，并可減少試驗工作量和投入成本。由此可見，蛭石法可替代溶液濾紙法用于大豆萌發(fā)期的抗旱性研究。

ITS序列分析結(jié)果表明，蛭石法發(fā)芽試驗能明顯減少大豆發(fā)芽試驗中霉菌的種類與數(shù)量，更適宜進行大豆萌發(fā)期抗旱性研究。在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%條件下，不同大豆品種間發(fā)芽率差異比較明顯，硬實豆數(shù)和發(fā)霉豆數(shù)少，試驗數(shù)據(jù)可靠，適合作為進行大豆萌發(fā)期抗旱性鑒定的適宜試驗條件。試驗結(jié)果還顯示，4個供試大豆品種的抗旱性表現(xiàn)由強到弱依次為隴中黃601、九農(nóng)29、長農(nóng)16、懇鑒豆15，這與田間表現(xiàn)一致。

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