張銀純 梁普平 郝虎

遺傳代謝性肝病(IMLD)是由于各種基因缺陷而導(dǎo)致肝臟代謝異常的一大類疾病,這類疾病的臨床表型差異顯著,以黃疸、肝臟腫大、肝細(xì)胞損害和低血糖為主要表現(xiàn),并常合并肝臟外損傷。其種類繁多,盡管每種疾病的發(fā)病率不高,但由于疾病譜廣,總體發(fā)病率較高[1-3]。IMLD包含多種不同的遺傳性罕見病,通常具有單一或多個(gè)致病基因,目前手術(shù)和藥物治療的方法非常有限,且療效欠佳并通常給患者帶來(lái)極重的負(fù)擔(dān)。隨著測(cè)序技術(shù)對(duì)致病基因的解析及分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因治療已經(jīng)發(fā)展為一種重要的遺傳疾病治療手段。目前靶向肝臟的基因治療已被認(rèn)為是除肝移植、肝再生治療外一種更高效、更安全且可能徹底治愈IMLD的方法[4],包括急性間歇性卟啉[5]、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥[6]、肝豆?fàn)詈俗冃訹7]、Crigler-Najjar綜合征[8]等。本文將概述基因治療在IMLD中的應(yīng)用進(jìn)展,總結(jié)分析當(dāng)前基因治療存在問題及潛在解決方案,以期為基因治療在IMLD中的研究和應(yīng)用提供借鑒和參考。

一、IMLD基因治療策略

基因治療包括體外基因治療和體內(nèi)基因治療兩種不同方式,IMLD的治療通常采用體內(nèi)基因治療的方式[9]。體外基因治療是將患者的細(xì)胞(通常是成體干細(xì)胞)從體內(nèi)分離在體外進(jìn)行培養(yǎng),然后向體外培養(yǎng)的細(xì)胞中導(dǎo)入能表達(dá)正?；虻妮d體,或者通過(guò)基因編輯修復(fù)體外培養(yǎng)細(xì)胞中的病因突變,最后將以上細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)以進(jìn)行疾病的治療。體內(nèi)基因治療則是直接使用病毒或非病毒載體將正常基因?qū)牖颊卟≡罨蛉韽亩鴱浹a(bǔ)突變基因的功能缺失,或者是直接向患者病灶或全身導(dǎo)入基因編輯工具從而在體內(nèi)修復(fù)患者突變基因的治療方法(圖1)?；蚓庉嬍峭ㄟ^(guò)位點(diǎn)特異性核酸酶定點(diǎn)切割靶基因進(jìn)而激發(fā)靶位點(diǎn)處DNA的損傷修復(fù),或者利用位點(diǎn)特異性堿基脫氨酶或DNA糖基化酶直接催化堿基的置換,從而修飾靶基因的遺傳工程技術(shù)。其主要包含鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶、單堿基編輯器(BE)和先導(dǎo)編輯器(PE)等。其中,基于規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)系統(tǒng)的Cas核酸酶、單堿基編輯器由于效率更高、使用更便利等優(yōu)勢(shì)而發(fā)展最為迅猛。如Cas核酸酶和單堿基編輯技術(shù)已被用于糾正人源化鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶小鼠模型[6]、肝豆?fàn)詈俗冃孕∈竽Ｐ蚚7]、甲基丙二酸血癥小鼠模型[10]和苯丙酮尿癥小鼠模型[11]等,其糾正了部分臨床表型且提升了模型小鼠的存活率。

圖1 IMLD基因治療策略和載體系統(tǒng)

二、基因治療遞送載體系統(tǒng)

體內(nèi)基因治療是IMLD最常用的基因治療策略,如何安全有效地實(shí)現(xiàn)靶基因特異遞送是基因治療藥物面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。目前體內(nèi)基因治療主要運(yùn)用兩種遞送系統(tǒng),即病毒和非病毒載體。其中病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)、慢病毒(LV)、腺病毒(AdV)、腺相關(guān)病毒(AAV)等。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、納米載體等[12-14](圖1)。與病毒載體相比,非病毒載體較為安全,其不依賴于病毒基因組,不受基因組包裝能力的限制,且通常具有較低的免疫原性,還可通過(guò)化學(xué)修飾進(jìn)行調(diào)節(jié),易于控制且成本較低?？紤]能高效用非病毒載體進(jìn)行遞送的僅有肝臟、脾臟等少數(shù)器官,而病毒載體如AAV載體則能靶向多種組織器官,如肝臟、神經(jīng)、肌肉等。同時(shí)病毒載體亦存在一些缺點(diǎn):如可能引起較為強(qiáng)烈的宿主免疫反應(yīng),載體隨機(jī)整合至基因組,包裝能力有限導(dǎo)致無(wú)法遞送大片的DNA。目前IMLD基因治療的載體主要包括AdV、AAV、LV和脂質(zhì)納米顆粒(LNP)[8],其具體特點(diǎn)見表1。

表1 IMLD基因治療常用的載體/遞送技術(shù)特點(diǎn)及應(yīng)用[8,12-14]

三、IMLD基因治療的應(yīng)用進(jìn)展

靶向肝臟的基因治療已成為IMLD最有效的方法之一,目前在多種疾病的診療研究中均取得一定的進(jìn)展,主要包括尿素循環(huán)障礙、有機(jī)酸血癥、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒈奖虬Y和糖原代謝障礙等。

1.尿素循環(huán)障礙:尿素循環(huán)障礙是指因參與尿素循環(huán)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷,導(dǎo)致氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨不能通過(guò)尿素循環(huán)形成尿素排出體外,引起血氨升高為特征的一組遺傳代謝病[15]。據(jù)估計(jì),尿素循環(huán)障礙總體發(fā)病率至少為1/35 000[16]。目前對(duì)于氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ缺乏癥的臨床前研究中,基于AAV的基因治療明顯改善了其臨床表型,提升了該小鼠模型的存活率,并使血氨和血氨基酸水平正常化[17]。鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥基因治療的研究較為廣泛,如Yang等[18]使用雙AAV系統(tǒng)遞送CRISPR/Cas9核酸酶至新生鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏小鼠模型中,一個(gè)AAV表達(dá)化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9),另一個(gè)表達(dá)gRNA并提供供體模板DNA,可修復(fù)10%肝細(xì)胞突變。Wang等[19]使用了雙AAV系統(tǒng),一個(gè)AAV載體遞送OTC基因,一個(gè)AAV載體則遞送CRISPR/Cas9進(jìn)行同源定向修復(fù)以糾正10%的OTC等位基因中的G>A突變,以此實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期修復(fù)。同時(shí),針對(duì)鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥基因治療的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)也在招募階段,包括Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT05345171)、Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT05092685)[20]。通過(guò)LNP等非病毒載體遞送mRNA,可有效糾正肝臟靶向和表型,包括鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥[21]、精氨琥珀酸裂解酶缺乏癥[22]和精氨酸酶缺乏癥[23]。

然而,AAV的基因治療在動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸诧@示出明顯的局限性,如CRISPR/Cas9編輯技術(shù)僅針對(duì)某些突變位點(diǎn),而為了克服這個(gè)問題,wang等[6]和Cunningham等[24]研究開發(fā)了整個(gè)轉(zhuǎn)基因整合策略,通過(guò)核酸酶介導(dǎo)的同源重組序列在宿主基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行整合,且在鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺陷小鼠模型中得以驗(yàn)證其有效性。

2.有機(jī)酸血癥:有機(jī)酸血癥也稱為有機(jī)酸尿癥,是由于體內(nèi)有機(jī)酸代謝過(guò)程中酶的功能缺陷,導(dǎo)致體內(nèi)有機(jī)酸及其旁路代謝產(chǎn)物蓄積,從而引起的一類疾病[25]。目前,在甲基丙二酸血癥、丙酸血癥和遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型等致病基因治療的臨床前研究也取得重要進(jìn)展,如AAV介導(dǎo)的基因編輯治療在新生和幼年甲基丙二酸血癥小鼠模型中均可糾正其臨床表型[16,26],同時(shí)也進(jìn)行了AAV介導(dǎo)的MUT基因Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT04581785),但試驗(yàn)過(guò)程中因患者出現(xiàn)血栓性微血管病變等并發(fā)癥而終止;LNP-mRNA基因治療也在小鼠模型中取得一定進(jìn)展[27],且正在招募Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT04899310)患者。而在丙酸血癥的基因治療中,LNP遞送PCCA-PCCB雙基因mRNA也可糾正丙酸血癥的臨床表型[28],且正在招募Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT04159103)患者。Dongho Choi團(tuán)隊(duì)[29]利用BE和PE成功糾正遺傳性酪氨酸血癥I型小鼠肝祖細(xì)胞,并通過(guò)再移植后延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。

3.肝豆?fàn)詈俗冃?肝豆?fàn)詈俗冃杂址Q為Wilson病,是由于ATP7B基因缺陷導(dǎo)致的銅代謝障礙性疾病,目前主要以銅螯合劑和鋅鹽治療為主。對(duì)于肝豆?fàn)詈俗冃缘幕蛑委熝芯枯^為廣泛,包括AAV8遞送全長(zhǎng)ATP7B基因治療[7,30]、雙AAV載體介導(dǎo)的ATP7B基因治療[31]均在成年Wilson小鼠模型中獲得了成功,同時(shí)目前針對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘蘑?Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT04537377、NCT04884815)也提示具有一定的臨床療效。

4.苯丙酮尿癥:苯丙酮尿癥是由于苯丙氨酸代謝途徑中的酶缺陷,導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積的代謝性疾病。目前對(duì)于苯丙酮尿癥的基因治療研究較為廣泛,Vonada等[32]開發(fā)了體內(nèi)慢病毒基因治療策略,通過(guò)Cypor酶系統(tǒng)解決生長(zhǎng)肝臟中AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)游離丟失的問題。通過(guò)AAV2/8載體遞送CRISPR/Cas9可糾正苯丙酮尿癥小鼠模型突變位點(diǎn),但肝細(xì)胞編輯效率較低[33]。AAV介導(dǎo)的單堿基編輯器有效糾正了苯丙酮尿癥小鼠的錯(cuò)義突變,并使體內(nèi)苯丙氨酸水平正常化[11]。同時(shí),LNP-mRNA介導(dǎo)的基因編輯也具有同樣療效[34-35]。

5.其他IMLD:(1)糖原累積?、馻型是一種由于G6PC基因突變導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸酶活性不足,糖原在肝臟、腎臟和小腸中過(guò)度累積的常染色體隱性遺傳病。AAV8介導(dǎo)的G6PC基因靶向肝臟治療,可減少玉米淀粉的使用和維持血糖水平正常[36],目前正進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT03517085)。mRNA治療也在該疾病中具有糾正低血糖和減少肝臟腫瘤發(fā)生的療效[37],其Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT05095727)也正處于招募階段。(2)Crigler-Najjar綜合征是由膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)活性降低或缺乏所導(dǎo)致的非結(jié)合性高膽紅素血癥。研究者將GeneRide系統(tǒng)與靶向插入位點(diǎn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)合,在Crigler-Najjar綜合征小鼠模型中將編輯效率提高20～50倍,且預(yù)測(cè)部位未觀察到脫靶效應(yīng)[38]。最近Généthon開發(fā)的基因療法GNT0003,利用AAV8載體表達(dá)編碼UGT1A1的轉(zhuǎn)基因,有效降低患者血清膽紅素水平[39]。(3)轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性是由于TRR基因突變導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白而引起多臟器淀粉樣變性。LNP遞送TRR基因CRISPR/Cas9編輯(NTLA-2001)的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果提示患者血清中的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白水平明顯降低[40],并且已經(jīng)進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT06128629)患者招募。(4)α1-抗胰蛋白酶缺乏癥是以血清α1-抗胰蛋白酶缺乏為特征的遺傳性疾病,可導(dǎo)致慢性肺臟和(或)肝臟疾病。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)同源定向修復(fù)校正突變基因可防止突變型α1-抗胰蛋白酶的積累,且校正后的肝細(xì)胞具有存活優(yōu)勢(shì)[41]。

四、存在問題和潛在解決方案

眾所周知,基因治療的遞送需克服復(fù)雜的細(xì)胞和組織障礙,將遺傳信息傳遞到靶細(xì)胞中,被校正的細(xì)胞數(shù)量或正?；虮磉_(dá)量均需足夠多才能達(dá)到矯正缺陷的治療作用。同時(shí)還需長(zhǎng)期維持這些作用,逃避免疫或細(xì)胞內(nèi)的清除機(jī)制。同時(shí)要考慮機(jī)體免疫反應(yīng)、致癌性風(fēng)險(xiǎn)、高劑量載體毒性作用等。

1.免疫反應(yīng):目前大多數(shù)成功的用于臨床前和臨床研究的AAV僅限于天然的衣殼血清型,由于人類長(zhǎng)期暴露于野生型AAV中,通常攜帶抗衣殼中和抗體,因此在臨床上應(yīng)用存在明顯的局限性?？笰AV中和抗體的存在是全身輸送的一個(gè)重要障礙,這些中和抗體干擾AAV進(jìn)入靶細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞核內(nèi)的解包裝,從而阻止了轉(zhuǎn)導(dǎo)[42]。因此多種抑制AAV中和抗體的方法被開發(fā),包括衣殼修飾、表面偶聯(lián)和封裝、血漿分離、B和(或)T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)、IgG裂解蛋白酶等[43]。如通過(guò)雷帕霉素與AAV載體聯(lián)合組裝合成的疫苗可有效阻斷抗衣殼介導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫[44]。使用聚合物、脂類和水凝膠的表面栓系和包封均能保護(hù)AAV衣殼免受中和抗體的侵襲,使其能夠逃避免疫系統(tǒng)的檢測(cè)和抗體反應(yīng)。最近有研究已經(jīng)證明,通過(guò)將免疫球蛋白或人血清與共價(jià)偶聯(lián)AAV顆粒的珠子孵育,可在體外去除中和抗體/因子[45]。

2.高載體劑量毒性:一些臨床前研究發(fā)現(xiàn)了AAV載體引發(fā)的炎癥反應(yīng),尤其是針對(duì)AAV高劑量給藥。研究人員對(duì)恒河猴與仔豬予高劑量AAV9(2×1014vg/kg)后,出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、肝衰竭和休克等不良反應(yīng)[46]。Wilson團(tuán)隊(duì)[47]也指出了使用高劑量基因療法的動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。Audentes公司[48]主導(dǎo)的ASPIRO試驗(yàn)(NCT03199469)由于采用高劑量AAV病毒載體(3×1014vg/kg)治療X連鎖肌小管性肌病從而導(dǎo)致3例受試患者死亡。以上研究均證實(shí)AAV病毒載體高劑量使用有可能導(dǎo)致的不良后果。據(jù)報(bào)道AAV的肝毒性是由先天免疫反應(yīng)或適應(yīng)性免疫反應(yīng)介導(dǎo)的常見不良事件,可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)緩解[49],同時(shí)這些并發(fā)癥往往更易發(fā)生在已致病的肝臟中[48],因此高劑量載體的毒性背后的機(jī)制尚不清楚。

3.致癌風(fēng)險(xiǎn):基因治療的病毒載體有可能插入到人體的原癌基因中去并將其激活,從而導(dǎo)致癌癥。一項(xiàng)歷經(jīng)十年針對(duì)患血友病的狗接受AAV基因治療的研究發(fā)現(xiàn),AAV的使用可能會(huì)增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)的基因組變化[50],但具體致癌情況需要較長(zhǎng)時(shí)間的隨訪觀察。同時(shí)在一項(xiàng)X-連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷臨床試驗(yàn)中,受試者也出現(xiàn)白血病的并發(fā)癥[51]。而在對(duì)1例經(jīng)基因治療的B型血友病患者發(fā)展為肝癌的事件調(diào)查中,發(fā)現(xiàn)該病毒載體不太可能是導(dǎo)致肝癌的原因[52]。因此,AAV載體是否真的會(huì)致癌仍是一個(gè)懸而未決的問題。目前AAV基因治療相關(guān)的致癌風(fēng)險(xiǎn)多受病毒載體劑量、啟動(dòng)子活性和患者注射年齡等復(fù)雜因素的影響[8],其具體機(jī)制尚未完全清楚。

4.倫理風(fēng)險(xiǎn):基因治療技術(shù)的發(fā)展為目前無(wú)法治愈的IMLD等遺傳疾病的治療帶來(lái)新希望,但也存在一定的倫理風(fēng)險(xiǎn)。因此,早在2015年華盛頓召開的人類基因編輯國(guó)際峰會(huì)上就明確指出“禁止出于生殖目的而使用基因編輯技術(shù)改變?nèi)祟惻咛セ蛏臣?xì)胞”。而目前普通基因治療針對(duì)的是體細(xì)胞,由于基因治療導(dǎo)致的基因組變異不會(huì)遺傳給下一代,所以倫理風(fēng)險(xiǎn)較小。目前進(jìn)一步提高公眾對(duì)基因治療的認(rèn)識(shí),不斷完善知情同意制度,完善相關(guān)法律法規(guī),加強(qiáng)國(guó)家對(duì)基因編輯的監(jiān)管審批,才能實(shí)現(xiàn)基因治療在人類疾病更好的應(yīng)用。

五、總結(jié)與展望

目前針對(duì)IMLD的基因治療取得了巨大進(jìn)展,包括病毒載體、非病毒載體等的不斷更新?lián)Q代都為各種IMLD基因治療提供了更安全的選擇。對(duì)載體與宿主相互作用、基因治療存在的局限性和問題日益了解,都為完善和改進(jìn)下一代基因治療載體提供了新見解。隨著遞送技術(shù)和基因編輯技術(shù)的改進(jìn),未來(lái)將有更多IMLD患者受益于基因治療。