徐庭瑞 付 鈺 呂雯昊 馬 寧 張 莉

口腔頜面部軟硬組織的缺損嚴(yán)重影響患者的口腔功能,采用自體組織進(jìn)行修復(fù)是一種理想的方式,但自體組織存在著來源不足和供區(qū)二次損傷的缺點(diǎn)[1]。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為口腔組織的修復(fù)與再生提供了新的思路。組織工程的原理是在體外模擬體內(nèi)的組織微環(huán)境，將種子細(xì)胞接種至支架材料上培養(yǎng)形成工程化組織再植入體內(nèi)修復(fù)或再生體內(nèi)缺損組織或器官，生長因子和外部物理因素也是組織工程中的重要要素[2，3]。支架材料在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）形成期間為再生的細(xì)胞提供機(jī)械支持，是組織工程的核心部分[4]。其中具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性的天然生物材料被廣泛用于制備支架。脫細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized extracellular matrix，dECM）作為一種天然生物材料在組織再生中體現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注dECM，并對其在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了一些基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面的探索。本文對dECM 的研究現(xiàn)狀作一綜述，旨在為dECM在口腔組織再生中的應(yīng)用提供參考。

一、dECM的概念、來源和分類

dECM 是指經(jīng)物理法、化學(xué)法及生物法等方式脫去組織或器官中的細(xì)胞后形成的生物材料，其可以直接作為支架材料，也可以加工后形成顆粒、水凝膠或生物墨水等形式加以應(yīng)用[5，6]。dECM 保留了ECM 的基本結(jié)構(gòu)和大部分有機(jī)成分，具有良好的生物相容性、可降解性和誘導(dǎo)組織再生能力[7，8]。根據(jù)ECM的起源，dECM可分自體dECM、同種異體dECM和異種dECM 三大類，其中同種異體dECM 和異種dECM 應(yīng)用較廣泛[8]。根據(jù)ECM 的來源，dECM 可分為組織或器官來源和細(xì)胞來源兩類。組織或器官來源的dECM 是指通過對組織或器官進(jìn)行脫細(xì)胞處理而形成的三維立體結(jié)構(gòu)，這種dECM 保留了原組織或器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，因此其生物學(xué)性能更接近天然ECM[9]。細(xì)胞來源的dECM 是指對體外培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的特異性ECM 進(jìn)行脫細(xì)胞處理后獲得的材料，與組織或器官來源的dECM 相比，細(xì)胞來源的dECM相對更容易獲取[10]。目前報(bào)道的應(yīng)用于口腔組織再生的dECM 包括脫細(xì)胞牙髓（decellularized dental pulp，DDP）、牙周膜dECM、骨脫細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized bone extracellular matrix，dbECM）、顳下頜關(guān)節(jié)盤dECM、小腸粘膜下層dECM、脫細(xì)胞神經(jīng)移植物（acellular nerve grafts，ANGs）和脫細(xì)胞牙胚等，不同dECM 的三維結(jié)構(gòu)和成分的差異使其在口腔組織再生中發(fā)揮不同的作用[4]。

二、dECM的主要成分和作用

dECM 主要包含各種細(xì)胞因子、糖胺聚糖和蛋白成分[11]。細(xì)胞因子在體內(nèi)釋放后可以直接作用于細(xì)胞，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的功能中起著重要作用。糖胺聚糖，主要包括肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和透明質(zhì)酸，是一類高度水化、具有凝膠性質(zhì)的物質(zhì)，這些聚合物可以通過與各種結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞因子相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞活動[12]。各類蛋白成分在dECM中同樣發(fā)揮著重要的作用。結(jié)構(gòu)蛋白或纖維蛋白，包括膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白等以纖維的形式存在，這些蛋白質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使組織或器官能夠承受重復(fù)的壓力和張力[6]。層粘連蛋白和纖連蛋白表面具有特定的受體結(jié)合位點(diǎn)，它們作為一個橋梁將ECM 與基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，傳遞各種信息及調(diào)節(jié)細(xì)胞行為[13]。dECM中保留的主要成分有重要的意義，移植于體內(nèi)組織缺損部位后可以通過激活多種信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，參與組織的修復(fù)和再生[14，15]。

三、dECM與口腔組織再生

1.牙髓組織

DDP 是牙髓再生中常用的一種dECM，由人或動物的牙髓組織經(jīng)酶和化學(xué)物質(zhì)脫細(xì)胞處理制成，其可以為干細(xì)胞增殖和分化提供合適的微環(huán)境[16]。DDP 中保留的血管內(nèi)皮生長因子-A 和成纖維細(xì)胞生長因子-2 可以使人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的含激酶插入?yún)^(qū)受體和血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1 表達(dá)上調(diào)，在牙髓再血管化過程中發(fā)揮作用[17]。Hu L等[18]用1 mm 厚的人磨牙牙根切片作為載體搭載豬DDP 和hDPSCs 后移植到裸鼠皮下，2 月后發(fā)現(xiàn)牙根切片內(nèi)有髓樣組織和礦化組織的生長，并在再生的髓樣組織中觀察到了血管樣結(jié)構(gòu)。除了DDP 以外，其他組織的dECM也可以促進(jìn)牙髓再生。Bakhtiar H 等[19]將人羊膜dECM 接種hDPSCs 后置入完成預(yù)備和消毒的牙根根管內(nèi)，將牙根植入小鼠顱骨7 周后可見高度血管化的髓樣組織充滿根管。以上結(jié)果提示dECM 在牙髓再生血管化過程中發(fā)揮了重要作用，但實(shí)現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生還需要誘導(dǎo)干細(xì)胞多向分化。研究表明dECM 可通過Wnt/β-catenin 信號通路上調(diào)Wnt3a 基因的表達(dá)，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化生成血管、神經(jīng)和牙本質(zhì)，在牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生中發(fā)揮作用[20]?；诖死碚?，有學(xué)者[21]發(fā)現(xiàn)DDP 水凝膠支架可以使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）的牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1、Ⅰ型膠原和牙本質(zhì)涎磷蛋白表達(dá)水平升高并促進(jìn)hBMMSCs 牙源性分化。另有研究[22]表明DDP水凝膠可以促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和血管生成細(xì)胞分化。牙髓再生標(biāo)準(zhǔn)在于牙髓充滿血管、神經(jīng)元形成和牙本質(zhì)的沉淀，其關(guān)鍵因素在于牙髓血管網(wǎng)絡(luò)的重建[23]。dECM 在牙髓再血管化和誘導(dǎo)干細(xì)胞多向分化中具有重要作用，這為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生過程中血管、神經(jīng)和牙本質(zhì)的形成提供了重要基礎(chǔ)。水凝膠形式的dECM 具有良好的流動性和可塑性，有望為牙髓生理性再生提供一種新的可能途徑，但其能否在復(fù)雜的根管環(huán)境中發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步的研究。

2.牙周膜

慢性牙周炎是導(dǎo)致牙周組織喪失最常見的因素，常規(guī)的牙周基礎(chǔ)治療只能消除牙周組織的炎癥，防止牙周組織被進(jìn)一步破壞，但無法實(shí)現(xiàn)完整的牙周組織再生[24]。牙周膜的再生是牙周組織再生的關(guān)鍵，目前的一些生物合成材料和生物膜等在牙周膜再生中的作用有限，許多學(xué)者評價了dECM 在牙周膜再生中的作用。Nakamura 等[25]用十二烷基硫酸鈉對帶有牙齒的小鼠下頜骨進(jìn)行脫細(xì)胞處理，之后通過拔除牙齒制備了帶有牙周膜dECM 的小鼠下頜骨，發(fā)現(xiàn)牙周膜dECM 可以引導(dǎo)宿主細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和排列，使細(xì)胞與原來的牙周膜細(xì)胞排列相同，證明了牙周膜dECM 具有一定的引導(dǎo)組織再生能力。但是直接制備牙周膜dECM 比較復(fù)雜，且容易破壞牙周膜，提示應(yīng)用其他組織來源或細(xì)胞來源的dECM 有望成為一種嶄新策略。Xiong X 等[26]將人尿源性干細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后對其進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備成人尿源性干細(xì)胞脫細(xì)胞外基質(zhì)（decellularuzed extracellular matrix from human urine-derived stem cells，U-dECM），將人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）接種于U-dECM 上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)U-dECM 可以促進(jìn)hPDLSCs 的增殖和粘附。上述研究證實(shí)dECM 在牙周膜再生中具有一定的作用，未來可將不同干細(xì)胞來源的dECM 或其他組織來源的dECM應(yīng)用于牙周膜再生中。但長期的慢性炎癥會導(dǎo)致宿主間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量減少及牙周菌群失衡，如何使dECM 在這個復(fù)雜的環(huán)境中誘導(dǎo)牙周膜再生是今后研究的重點(diǎn)[27]。

3.骨組織

由創(chuàng)傷、感染和手術(shù)造成的頜骨缺損嚴(yán)重影響患者的美觀、咀嚼和吞咽，自體骨或同種異體骨移植是臨床上修復(fù)頜骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[28]，但自體骨來源有限及異體移植的倫理問題等缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)dbECM 在骨再生中具有很大的潛力。dbECM 通過化學(xué)物質(zhì)和酶等處理脫去骨組織中細(xì)胞成分獲得，它既保留了天然骨ECM 中的主要成分，同時具有良好的力學(xué)性能和誘導(dǎo)成骨能力[29]。Paduano F 等[30]研究表明牛dbECM 水凝膠可通過上調(diào)牙髓干細(xì)胞成骨特異性基因RUNX-2 基因、骨涎蛋白、骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達(dá)水平調(diào)控其成骨分化。另有學(xué)者[31]將豬dbECM 植入10 名眶底骨折的患者體內(nèi)進(jìn)行眶底重建，發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)具有良好的生物相容性并顯著促進(jìn)成骨。除了dbECM 以外，其他組織的dECM 也有促進(jìn)成骨的作用。Alksne M 等[32]制備了大鼠DPSCs 來源的DDP，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DDP 可以促進(jìn)DPSCs 的粘附、遷移和增殖，并且對DPSCs的成骨分化具有誘導(dǎo)作用。Guo K 等[33]對人牙進(jìn)行脫細(xì)胞脫鈣處理后植入大鼠顱骨缺損中，發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)成骨能力和良好的生物相容性。不同來源的dECM 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了良好的成骨能力，dbECM 可直接作為支架材料用于骨組織再生。但細(xì)胞來源的dECM 由于力學(xué)性能不足限制了其在骨組織工程中的應(yīng)用，將其與生物相容性良好的高分子材料復(fù)合制備成一種既具有良好的力學(xué)性能又可以保存dECM 生物學(xué)活性的支架材料是一種理想的方案[34]。

4.顳下頜關(guān)節(jié)盤

顳下頜關(guān)節(jié)盤是位于下頜骨髁突和顳骨關(guān)節(jié)窩之間的纖維軟骨樣組織，是顳下頜關(guān)節(jié)行使功能的主要組成部分和重要基礎(chǔ)，關(guān)節(jié)盤穿孔（disc perforation，DP）是常見的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病之一[35]。DP 的治療遵循一個循序漸進(jìn)的原則，首先是進(jìn)行保守治療如服藥、理療和透明質(zhì)酸關(guān)節(jié)腔注射等，對于保守治療無效的患者需要進(jìn)行關(guān)節(jié)盤切除、關(guān)節(jié)盤置換和關(guān)節(jié)重建等手術(shù)進(jìn)行治療，但術(shù)后并發(fā)癥和移植物使用壽命較短是目前面臨的挑戰(zhàn)[36]。采用dECM 修復(fù)或重建關(guān)節(jié)盤是治療DP 的一種新的研究方向。有學(xué)者[37]通過凍融循環(huán)、酶和化學(xué)物質(zhì)對豬顳下頜關(guān)節(jié)盤行脫細(xì)胞處理后再制備成豬顳下頜關(guān)節(jié)盤dECM 水凝膠并與支架材料復(fù)合，將載有大鼠肋軟骨細(xì)胞和L929 成纖維細(xì)胞的支架體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中SOX9 基因和Ⅱ型膠原纖維基因表達(dá)顯著上調(diào)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明載有細(xì)胞的支架可以促進(jìn)軟骨組織形成。另有學(xué)者[38]用小腸粘膜下層dECM 經(jīng)凍干、粉碎后制成一種與豬顳下頜關(guān)節(jié)盤大小和形狀相近的支架，將該支架植入切除關(guān)節(jié)盤的豬動物模型中，發(fā)現(xiàn)其在術(shù)后3 月形成一種顳下頜關(guān)節(jié)盤樣組織，該組織的主要成分和生物力學(xué)性能與天然關(guān)節(jié)盤相似。以上研究表明dECM 在促進(jìn)顳下頜關(guān)節(jié)盤再生時具有重大應(yīng)用價值，其不僅可以通過水凝膠形式進(jìn)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，還能作為支架材料加以應(yīng)用。但目前對于dECM 在顳下頜關(guān)節(jié)盤再生中具體機(jī)制的研究還較少，相信未來通過不斷研究可以將dECM 用于臨床治療，實(shí)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)盤的生理性修復(fù)。

5.神經(jīng)

口腔頜面部外傷、手術(shù)等容易造成神經(jīng)的損傷，其中下牙槽神經(jīng)的損傷較常見，通常由牙槽外科手術(shù)、正頜外科手術(shù)以及頜骨手術(shù)等引起。對于大于8 mm 的較長神經(jīng)缺損，修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植，但供體來源不足及供體區(qū)域的繼發(fā)性功能障礙是目前面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[39]。ANGs 作為一種天然支架，可通過神經(jīng)組織經(jīng)凍融、化學(xué)物質(zhì)脫細(xì)胞處理獲得。其不僅保留了天然神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)，而且去除了髓鞘、細(xì)胞等免疫源性物質(zhì)，在誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞（schwann cells，SCs）修復(fù)損傷神經(jīng)中具有重要作用[40]。有研究[41]表明ANGs 可通過誘導(dǎo)脊髓中神經(jīng)營養(yǎng)因子的高表達(dá)抑制JAK2/STAT3 信號通路促進(jìn)神經(jīng)再生。Shanti RM 等[42]對1 例下牙槽神經(jīng)損傷的患者用同種異體ANGs進(jìn)行修復(fù)，術(shù)后5月通過感覺檢測和兩點(diǎn)辨別感覺實(shí)驗(yàn)觀察到患者患側(cè)皮膚感覺功能恢復(fù)良好。但長段ANGs 移植可能會導(dǎo)致SCs 衰老進(jìn)而使神經(jīng)再生過程受到抑制[43]，提示選擇合適的干細(xì)胞使ANGs 再細(xì)胞化或補(bǔ)充外源性物質(zhì)以達(dá)到更為理想的修復(fù)效果是未來進(jìn)一步的研究方向[44]。

6.牙再生

牙再生是指利用生物材料、種子細(xì)胞和生長因子模擬天然牙發(fā)生、發(fā)育過程中上皮和間充質(zhì)的相互作用再生牙齒的過程[45]。有研究[46]在6 月大的豬頜骨中提取未萌出的鐘狀期牙胚進(jìn)行脫細(xì)胞處理制成脫細(xì)胞牙胚，接種豬牙源性上皮細(xì)胞、人牙髓細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞使脫細(xì)胞牙胚再細(xì)胞化，將其接種到豬的下頜骨中，術(shù)后6 月觀察到由牙釉質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙髓、牙本質(zhì)和牙周膜組成的生物工程牙。這表明dECM 在牙再生過程中有巨大的作用，但其如何通過多種復(fù)雜的信號通路誘導(dǎo)牙再生仍不明確。此外，實(shí)現(xiàn)具有特定尺寸和形狀的生物工程牙齒的再生及如何控制其萌出還需進(jìn)一步研究。

四、討論與展望

dECM 在口腔組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用是一個相對較新的課題，其在組織修復(fù)和再生中展現(xiàn)出了巨大的潛力。dECM 脫去了細(xì)胞及免疫成分，具有較低的免疫原性，這使異種來源的dECM 作為商業(yè)化產(chǎn)品用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為可能。其保留的生物活性物質(zhì)可以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控細(xì)胞信號通路的傳導(dǎo)和基因的表達(dá)，為干細(xì)胞移植和干細(xì)胞歸巢策略用于口腔組織再生奠定了基礎(chǔ)。組織、器官來源的dECM 可以直接作為支架材料用于口腔組織再生，但對于復(fù)雜的組織缺損無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)修復(fù)，未來結(jié)合3D 打印技術(shù)制備出高精度的dECM 支架材料是一種發(fā)展趨勢。細(xì)胞來源的dECM 力學(xué)性能較差，可以將其與生物相容性優(yōu)良、可降解的高分子材料復(fù)合制備支架材料或?qū)⑵渫扛灿谥Ъ鼙砻?。但目前dECM 在應(yīng)用中仍面臨一些難題，例如：①脫細(xì)胞過程可能會破壞dECM 結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致其有效成分的丟失；②其誘導(dǎo)不同口腔組織再生的具體機(jī)制尚未明確；③雖然目前關(guān)于dECM 的研究眾多，但進(jìn)入臨床試驗(yàn)的還很少。綜上所述，dECM 在口腔組織再生應(yīng)用中充滿了機(jī)遇和挑戰(zhàn)，相信日后通過一系列的研究，可以解決dECM 現(xiàn)有的缺點(diǎn)，最終實(shí)現(xiàn)其在口腔組織再生中的廣泛應(yīng)用。