尹慧芳

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)檢查長三角分中心

徐隆昌

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邱曉

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陳愛萍

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韋薇*

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細(xì)胞的生長需要復(fù)雜的營養(yǎng)支持，其中包括多種已知和未知的可溶性及膜結(jié)合生長因子、受體等。部分細(xì)胞可通過在培養(yǎng)基中添加胞外基質(zhì)蛋白和生長因子以滿足細(xì)胞生長所需條件，但某些類型的細(xì)胞生長和增殖則需要依賴于與其他細(xì)胞，例如滋養(yǎng)細(xì)胞的物理接觸，此時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞在一定程度上可提供培養(yǎng)基以外的細(xì)胞生長所需的必要條件[1]。滋養(yǎng)細(xì)胞通常為經(jīng)適當(dāng)處理后，自身不能分裂和增殖，但通過細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用或分泌一定的營養(yǎng)物質(zhì)，用以支持其他細(xì)胞生長、擴(kuò)增的一類細(xì)胞[1]。滋養(yǎng)細(xì)胞主要有兩方面的作用：旁分泌相互作用（paracrine interactions）、近 分泌和物理相互作用（juxtacrine and physical interactions）。旁分泌即分泌一系列的生長因子及細(xì)胞因子以促進(jìn)目的細(xì)胞的生長，最終可以通過在培養(yǎng)基中添加重組蛋白進(jìn)行取代。近分泌和物理相互作用則必須依賴于滋養(yǎng)細(xì)胞的存在，因?yàn)槠湫枰?xì)胞與細(xì)胞的接觸來介導(dǎo)近分泌信號(hào)通路及機(jī)械巢效應(yīng)（mechanical nest effects）[1]。此外，滋養(yǎng)細(xì)胞還能消除培養(yǎng)基毒性物質(zhì)和抑制因子，合成胞外基質(zhì)蛋白以調(diào)控目的細(xì)胞生長并作為細(xì)胞附著的基質(zhì)[1]。

目前，雖然有相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則提及滋養(yǎng)細(xì)胞，但均為概括性指導(dǎo)，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的使用和控制方面尚無專門的技術(shù)指南。為了幫助此類產(chǎn)品的開發(fā)和技術(shù)評(píng)價(jià)，本文基于當(dāng)前認(rèn)知并結(jié)合最新研究進(jìn)展，以基因編輯的人慢性髓系白血病細(xì)胞（K562 細(xì)胞）為例，結(jié)合相關(guān)指導(dǎo)原則和審評(píng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞系來源的滋養(yǎng)細(xì)胞的制備、使用及控制策略進(jìn)行了探討，以期為行業(yè)的發(fā)展和監(jiān)管措施的完善提供借鑒與思路。

一、使用和申報(bào)情況概述

滋養(yǎng)細(xì)胞因能促進(jìn)目的細(xì)胞的擴(kuò)增，已經(jīng)被應(yīng)用于自然殺傷（natural killer，NK）細(xì) 胞、腫瘤浸潤淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）細(xì)胞等的體外擴(kuò)增，并取得了良好的增殖效果。目前，滋養(yǎng)細(xì)胞主要包括：外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）及一些腫瘤來源的細(xì)胞系，例如人多發(fā)性骨髓瘤外周 血B 淋巴細(xì) 胞（RPMI8866細(xì)胞）、EB 病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞系（Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell line，EBV-LCL）、K562細(xì)胞、人B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（human B-lymphoblastoid cell line）721.221、人T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat）等[2-5]。其中，基因編輯的K562 細(xì)胞因其良好的促進(jìn)增殖作用而被廣泛研究和使用。研究表明使用基因編輯的K562 細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞能使NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率提高幾十到上萬倍[3-7]。

目前，國際上已有多款使用滋養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的NK 細(xì)胞和iPSC-NK 細(xì)胞產(chǎn)品獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)。我國也有使用滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品申請(qǐng)溝通交流或者獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)，主要集中在TIL細(xì)胞、NK 細(xì)胞及iPSCNK 細(xì)胞領(lǐng)域。

基于滋養(yǎng)細(xì)胞可能引入的外源因子污染、成瘤性和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，基因編輯的滋養(yǎng)細(xì)胞可能帶來的基因修飾系統(tǒng)殘留風(fēng)險(xiǎn)和可復(fù)制性病毒風(fēng)險(xiǎn)以及殘留檢測(cè)的復(fù)雜性，一般應(yīng)盡可能避免使用滋養(yǎng)細(xì)胞，如必須使用，則滋養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行殘留量檢測(cè)，以控制相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。因此，在研發(fā)早期，需要充分評(píng)估使用滋養(yǎng)細(xì)胞的必要性，遵循非必要不使用的原則，并積極探尋其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細(xì)胞可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)。但由于某些種類的細(xì)胞只有在滋養(yǎng)細(xì)胞存在時(shí)才能實(shí)現(xiàn)有效激活和增殖，且當(dāng)前無其他可比擬的替代物，因此，在某些情況下，滋養(yǎng)細(xì)胞的使用尚存在一定的必要性。

二、審評(píng)考慮

1.起始細(xì)胞

起始細(xì)胞是用來生產(chǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞的起始原材料，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量至關(guān)重要。例如，K562 為人慢性髓系白血病細(xì)胞系，為了保證起始原材料的安全性，細(xì)胞來源應(yīng)清晰可追溯。根據(jù)細(xì)胞系的來源、歷史培養(yǎng)和改造信息分析細(xì)胞系的適用性，還需關(guān)注歷史培養(yǎng)過程中可能的污染或引入的牛源性病毒、豬源性病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、人源性病毒的風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞篩選階段或后續(xù)的建庫階段都應(yīng)參考2020 年版《中國藥典》的要求進(jìn)行全面檢定，以綜合判斷細(xì)胞的適用性。

2.工程細(xì)胞株的構(gòu)建和建庫

K562 細(xì)胞表面表達(dá)的膜結(jié)合白介素12（IL-12）、白介素15（IL-15）可以極大地促進(jìn)K562細(xì)胞的促增殖能力。研究表明，使用表達(dá)膜結(jié)合IL-15 的K562細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，21 天后，NK 細(xì)胞擴(kuò)增了825 倍，與未增殖的NK 細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞端?？s短，在第24～42 天衰老并失去增殖能力；使用表達(dá)膜結(jié)合IL-21的K562 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，21 天后，NK 細(xì)胞擴(kuò)增了47 697 倍，與未增殖的NK 細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞端粒變長，在第42 天仍然維持著增殖能力[7]。不同修飾的滋養(yǎng)細(xì)胞不僅在促增殖能力方面存在差異，還可能會(huì)影響細(xì)胞終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，應(yīng)在構(gòu)建細(xì)胞株之初就評(píng)估其對(duì)細(xì)胞終產(chǎn)品可能產(chǎn)生的影響，以構(gòu)建符合需求的工程細(xì)胞株。當(dāng)前，通常使用基因修飾系統(tǒng)導(dǎo)入膜結(jié)合的IL-15（mbIL-15）/膜結(jié)合的IL-21（mbIL-21）、4-1BBL[2,7-8]，或者結(jié)合特定需求導(dǎo)入其他基因，或者進(jìn)行基因敲除，以擴(kuò)展滋養(yǎng)細(xì)胞的功能。

常見可用于編輯K562 細(xì)胞的基因修飾系統(tǒng)一般包括病毒載體（慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等）、質(zhì)粒DNA 或其他基因編輯工具等。由于各類基因修飾系統(tǒng)的差異，對(duì)編輯后K562 細(xì)胞質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)的影響可能不同。因此，除需要對(duì)細(xì)胞改造或修飾結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)外，同時(shí)應(yīng)關(guān)注和評(píng)估基因修飾系統(tǒng)引入的風(fēng)險(xiǎn)，包括病毒載體可能引入的可復(fù)制病毒風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在基因組中的移動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)等。

為了保證滋養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量可控和批間一致性，通常在經(jīng)過基因修飾后篩選單克隆細(xì)胞株，并建立細(xì)胞庫。此外，還應(yīng)結(jié)合篩選過程和相關(guān)檢測(cè)技術(shù)保證細(xì)胞的單克隆來源，單克隆細(xì)胞不僅能保證細(xì)胞的質(zhì)量均一性，還能為后續(xù)滋養(yǎng)細(xì)胞殘留檢測(cè)提供便利，并按照2020 年版《中國藥典》要求開展滋養(yǎng)細(xì)胞庫的檢定及穩(wěn)定性研究。在進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞庫的檢定時(shí)內(nèi)外源病毒因子檢測(cè)應(yīng)關(guān)注種屬特異性病毒、生物來源物料可能引入的病毒。還應(yīng)結(jié)合單克隆篩選和細(xì)胞庫建庫對(duì)基因插入位點(diǎn)、轉(zhuǎn)基因元件拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)行確認(rèn)，并關(guān)注基因修飾系統(tǒng)殘留及基因修飾系統(tǒng)所引入的風(fēng)險(xiǎn)。

3.生產(chǎn)工藝

滋養(yǎng)細(xì)胞制備工藝流程可能包括細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增、細(xì)胞收獲、細(xì)胞滅活及凍存等工藝步驟。制備時(shí)應(yīng)控制生產(chǎn)過程中可能引入的風(fēng)險(xiǎn)，確保生產(chǎn)工藝能生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、無增殖能力的滋養(yǎng)細(xì)胞。其中，細(xì)胞滅活工藝為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前主要采用輻照法進(jìn)行滅活。有研究表明，高能輻照可以在不影響細(xì)胞代謝的情況下抑制細(xì)胞分裂，是一種相對(duì)安全且高效的細(xì)胞滅活方法[1-2]。目前，常采用γ 輻照和X 射線進(jìn)行處理。有研究比較了這兩種不同輻照方式處理的K562細(xì)胞對(duì)NK 細(xì)胞增殖的影響。該研究采用這兩種方式對(duì)K562 細(xì)胞進(jìn)行處理，并在培養(yǎng)基中添加IL-12、IL-15后與PBMCs 共培養(yǎng)14 天。結(jié)果表明：與γ 輻照組相比，X 射線處理組NK 細(xì)胞增殖速度略低，NK 細(xì)胞純度相當(dāng)。且X 射線處理與γ 輻照的K562 細(xì)胞均未出現(xiàn)自身擴(kuò)增現(xiàn)象，單獨(dú)培養(yǎng)至第10 天細(xì)胞存活率約為16% 和13%；與NK 細(xì)胞共培養(yǎng)10 天后，K562 細(xì)胞殘留率均進(jìn)一步下降到0.5%。擴(kuò)增后的NK 細(xì)胞受體表達(dá)（CD16、CD57、NKG2A、NKG2C、CD8a、NKp30、NKp46、CD62L、NKG2D 和DNAM-1）水平相近，同時(shí)也表現(xiàn)出相似水平的細(xì)胞毒性作用[9]。由此可知，不同的輻照處理方式可能對(duì)NK細(xì)胞增殖速度、純度、NK 細(xì)胞受體表達(dá)水平等產(chǎn)生影響，實(shí)際中建議根據(jù)產(chǎn)品需要和操作的可及性選擇適合的細(xì)胞滅活處理方式。

為了確保滋養(yǎng)細(xì)胞無增殖能力，對(duì)輻照工藝進(jìn)行研究十分必要，主要對(duì)輻照強(qiáng)度、輻照時(shí)間、細(xì)胞密度等指標(biāo)進(jìn)行研究以確定工藝參數(shù)。此外，將輻照后的滋養(yǎng)細(xì)胞冷凍保存后使用，既可以減少每次輻照處理所帶來的批次差異，也可以減少輻照操作的次數(shù)，提高操作和使用的便利性，但需要開展研究以確認(rèn)冷凍對(duì)細(xì)胞以及產(chǎn)品質(zhì)量的影響。有研究比較了凍存對(duì)K562 細(xì)胞本身及NK 細(xì)胞培養(yǎng)的影響，其將基因編輯的K562-mb15-41BBL 細(xì)胞進(jìn)行100Gy γ 輻照后保存于90%FBS+10% DMSO 凍存液中。與新鮮的輻照細(xì)胞相比，凍存的輻照細(xì)胞4-1BBL 配體表達(dá)水平相近，但膜結(jié)合的IL-15 表達(dá)水平稍低[8]。共培養(yǎng)21 天后，NK 細(xì)胞的增殖速度相近，NK細(xì)胞純度稍低。兩組NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性、受體表達(dá)（sCD16、NKG2D、CD69、NKp30、NKp44、NKp46 和CD158b）及γ-干擾素釋放水平基本一致[8]。因此，實(shí)際中建議根據(jù)產(chǎn)品需求和相關(guān)操作選擇合適的工藝參數(shù)及保存方式。

4.質(zhì)量研究和質(zhì)量控制

通常滋養(yǎng)細(xì)胞需要進(jìn)行外觀、鑒別、理化性質(zhì)（細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞存活率）、純度（表達(dá)目的基因細(xì)胞比例）、活性（自身增殖能力、刺激細(xì)胞擴(kuò)增能力）、安全性（無菌、支原體、內(nèi)毒素）、特定基因表達(dá)情況（如適用）及相關(guān)雜質(zhì)等研究。其中，自身增殖能力的研究建議選用定量方法，建立細(xì)胞存活率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線，以了解滋養(yǎng)細(xì)胞在輻照后的生長/存活變化情況，為后續(xù)使用提供支持性數(shù)據(jù)。對(duì)于基因編輯的滋養(yǎng)細(xì)胞，建議對(duì)導(dǎo)入基因的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。細(xì)胞活性研究方面，可采用具有代表性的目的細(xì)胞樣本進(jìn)行多批次研究，以了解滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于不同供者來源/批次的目的細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)情況。雜質(zhì)研究方面，建議結(jié)合生產(chǎn)過程、細(xì)胞庫研究等制定合理的控制策略，還需要重點(diǎn)關(guān)注生物源性物料和基因編輯系統(tǒng)殘留及所引入的風(fēng)險(xiǎn)。此外，腫瘤組織來源的滋養(yǎng)細(xì)胞具有較高風(fēng)險(xiǎn)，建議應(yīng)進(jìn)行體外和體內(nèi)的成瘤性和致瘤性研究，必要時(shí)可納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，還建議對(duì)每批次的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行放行檢測(cè)，確保滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及無外源因子污染，必要時(shí)還應(yīng)建立滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照品以盡量減少批次間的差異。

5.滋養(yǎng)細(xì)胞的使用和控制策略

根據(jù)2020年版《中國藥典》要求，滋養(yǎng)細(xì)胞屬于風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)最高的原材料；在《美國藥典》（UnitedStatesPharmacopoeia）中，滋養(yǎng)細(xì)胞也屬于風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)最高的輔助原材料[10]。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎使用滋養(yǎng)細(xì)胞，并進(jìn)行嚴(yán)格控制。在研發(fā)早期需評(píng)估使用滋養(yǎng)細(xì)胞的必要性，尋找其他替代物或替代來源，并對(duì)生產(chǎn)過程中滋養(yǎng)細(xì)胞的使用量進(jìn)行研究，以期用最少的添加量生產(chǎn)出符合預(yù)期產(chǎn)量和效果的細(xì)胞產(chǎn)品。此外，還建議在生產(chǎn)過程中適當(dāng)步驟對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的殘留進(jìn)行定量研究，以了解滋養(yǎng)細(xì)胞被去除、降解或者被細(xì)胞利用的趨勢(shì)。盡管K562細(xì)胞經(jīng)過輻照處理，且易被生長的NK 細(xì)胞殺死，但仍需確保細(xì)胞終產(chǎn)品中盡可能沒有滋養(yǎng)細(xì)胞殘留，以保障患者安全。建議研究人員開發(fā)靈敏度高的檢測(cè)方法，例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)法[11]、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（ddPCR）檢測(cè)法等，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行專屬性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)限等驗(yàn)證，以保證檢測(cè)方法能對(duì)生產(chǎn)過程及終產(chǎn)品進(jìn)行有效表征，減少對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、臨床療效及安全性的影響。鑒于K562 細(xì)胞為腫瘤來源細(xì)胞系，還需關(guān)注其可能攜帶的致癌基因的風(fēng)險(xiǎn)控制，并對(duì)明確具有致癌性的基因進(jìn)行殘留檢測(cè)。另外，對(duì)終產(chǎn)品的成瘤性進(jìn)行研究時(shí)，還需要根據(jù)研究結(jié)果考慮其是否應(yīng)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。

三、研究展望

NK 細(xì)胞因其來源的多樣性和低免疫原性，易被開發(fā)為通用型細(xì)胞產(chǎn)品從而極大地降低治療費(fèi)用，成為近年來研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。NK 細(xì)胞常見的擴(kuò)增和激活方式就是利用滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，為此，本文結(jié)合當(dāng)前研究進(jìn)展，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的研究進(jìn)行了展望。首先，是滋養(yǎng)細(xì)胞來源。K562 來源細(xì)胞可以作為滋養(yǎng)細(xì)胞，也有研究采用前列腺癌來源的細(xì)胞系PC3PSCA 或者來源于T 淋巴細(xì)胞系細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞[12-13]。控制滋養(yǎng)細(xì)胞的來源，并對(duì)其培養(yǎng)歷史進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)控制，可增加其使用的安全性。其次，是滋養(yǎng)細(xì)胞的改造研究。目前通常使用基因修飾系統(tǒng)導(dǎo)入膜結(jié)合的IL-15（mbIL-15）/膜結(jié)合 的IL-21（mbIL-21）、4-1BBL 以增強(qiáng)K562 細(xì)胞的 促進(jìn)增殖能力[2,7-8]。未來還會(huì)有更多導(dǎo)入其他基因或者進(jìn)行基因敲除的研究以滿足對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的特定需求，或者進(jìn)一步提升其促進(jìn)增殖的能力以實(shí)現(xiàn)使用盡量少的滋養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到預(yù)期效果，或者通過基因編輯實(shí)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞自失活。再次，是滋養(yǎng)細(xì)胞的生產(chǎn)工藝研究。已有的相關(guān)研究主要為采用X 射線處理替代γ 輻照進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞滅活[9]，以及用凍存的輻照細(xì)胞代替新鮮輻照細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)[8]，此類研究能夠提高滋養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量可控性及批間一致性。最后，是滋養(yǎng)細(xì)胞的替代研究。替代研究可以分為多個(gè)階段或?qū)哟?，例如用?xì)胞系細(xì)胞或基因編輯的細(xì)胞系細(xì)胞（如K562 細(xì)胞）代替PBMCs 用于TIL 細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖，以減少不同來源的PBMCs帶來的差異性及提高檢測(cè)的便利性[14]；從滋養(yǎng)細(xì)胞中（如K562.mbIL21.4-1BBL）提取膜顆粒用于細(xì)胞（如NK 細(xì)胞）的擴(kuò)增，以克服滋養(yǎng)細(xì)胞可能帶來的污染和風(fēng)險(xiǎn)[15]。滋養(yǎng)細(xì)胞的替代研究能夠極大地降低使用滋養(yǎng)細(xì)胞所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

四、結(jié)語

滋養(yǎng)細(xì)胞已被研究應(yīng)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的培養(yǎng)中，筆者建議開發(fā)者在研發(fā)早期評(píng)估使用滋養(yǎng)細(xì)胞的必要性，遵循非必要不使用的原則，積極尋找其他替代物或替代來源以減少滋養(yǎng)細(xì)胞的使用。如必須使用滋養(yǎng)細(xì)胞，則需進(jìn)行嚴(yán)格的控制和檢測(cè)，以控制原材料和生產(chǎn)過程中可能引入的風(fēng)險(xiǎn)，包括挑選單克隆細(xì)胞株建立細(xì)胞庫，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的滅活進(jìn)行研究，確保滋養(yǎng)細(xì)胞自身無增殖能力，并對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的使用比例、自身增殖能力及對(duì)目的細(xì)胞的促增殖能力進(jìn)行研究等。在細(xì)胞產(chǎn)品的整個(gè)生產(chǎn)過程中需對(duì)殘留的滋養(yǎng)細(xì)胞或相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因以及蛋白殘留進(jìn)行表征和定量研究，以了解滋養(yǎng)細(xì)胞被去除、降解或者被細(xì)胞利用的趨勢(shì)。同時(shí)還需開發(fā)適當(dāng)?shù)臍埩魳?biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法以保證對(duì)過程及細(xì)胞終產(chǎn)品的有效表征，減少或者消除滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和安全性可能產(chǎn)生影響。