王露露

中國(guó)食品藥品檢定研究院

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

孫姍姍

中國(guó)食品藥品檢定研究院

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

丁波

煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

羅嬌依

中國(guó)食品藥品檢定研究院

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

曹進(jìn)*

中國(guó)食品藥品檢定研究院

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

食品安全是人類面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，人們對(duì)食品的關(guān)注已經(jīng)不僅僅局限于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還越來(lái)越重視其安全性。如何全面評(píng)價(jià)食品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品質(zhì)量全過(guò)程的把控頗為重要[1]。我國(guó)《食品安全法》[2]的實(shí)施為國(guó)內(nèi)食品安全提供了有力保障。食品質(zhì)量受原材料、生產(chǎn)加工、儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)榷喾N因素的影響，相關(guān)質(zhì)量問(wèn)題包括含有傳統(tǒng)的化學(xué)危害物、致病菌，以及以次充好、以劣質(zhì)原材料生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品、產(chǎn)地造假等[3-6]。

隨著人們生活質(zhì)量的提高，化妝品日漸成為生活必需品。根據(jù)中國(guó)香料香精化妝品工業(yè)協(xié)會(huì)不完全統(tǒng)計(jì)，2020 年我國(guó)化妝品生產(chǎn)企業(yè)主營(yíng)業(yè)務(wù)收入達(dá)3950億元[7]。隨著化妝品生產(chǎn)工藝的發(fā)展和銷量的高速增長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量和安全受到越來(lái)越多的關(guān)注。同時(shí)，隨著更多化妝品新材料被發(fā)現(xiàn)，如蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)，在提高產(chǎn)品質(zhì)量和功效的同時(shí)，相關(guān)安全問(wèn)題也在增加[8]。為保障化妝品質(zhì)量，加強(qiáng)化妝品質(zhì)量安全監(jiān)管，我國(guó)發(fā)布了《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》[9]，明確了化妝品禁限用組分。

蛋白質(zhì)分別作為主要營(yíng)養(yǎng)成分和新型化妝品材料存在于食品和相關(guān)化妝品中，參與決定了食品和化妝品質(zhì)量。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA 法）、Folin-酚試劑 法（也稱為L(zhǎng)owry 法）、考馬斯亮藍(lán)法（Braford 法）和凱氏定氮法等[10-12]。上述方法只能用于總蛋白含量測(cè)定，無(wú)法對(duì)具體的營(yíng)養(yǎng)蛋白或者過(guò)敏原進(jìn)行定性定量檢測(cè)，且研究通量低，具有局限性。蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)研究興起之后的又一新興領(lǐng)域，與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究方法相比，能夠用于蛋白質(zhì)的鑒定、定量、定位、蛋白結(jié)構(gòu)修飾分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究[13-15]，且研究通量高，研究范圍更加完整。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為相關(guān)科學(xué)研究提供了全新的思路和技術(shù)，已在藥品和生物制品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[16-17]。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸被應(yīng)用于食品和化妝品等領(lǐng)域，如品質(zhì)評(píng)價(jià)、風(fēng)險(xiǎn)發(fā)現(xiàn)、產(chǎn)品真實(shí)性檢驗(yàn)、產(chǎn)品摻雜摻假檢測(cè)和產(chǎn)品功效評(píng)價(jià)等[18-19]，其在食品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍和解決問(wèn)題如表1 所示。

表1 蛋白質(zhì)組學(xué)在食品和化妝品領(lǐng)域應(yīng)用對(duì)比

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)介紹

經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已形成了一套較為完整的分析流程，常規(guī)分析步驟主要包括：樣品前處理、分離、質(zhì)譜檢測(cè)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。其中，樣品前處理是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程中的關(guān)鍵步驟，影響分析穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和靈敏度[20]。傳統(tǒng)的樣品制備方法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，且大部分依靠手工操作，不可避免地存在人為誤差。值得關(guān)注的是，自動(dòng)化樣品制備平臺(tái)的相繼出現(xiàn)，如貝爾曼庫(kù)爾特的Biomek?NXP自動(dòng)化 工作站[21]和賽默飛的全自動(dòng)磁珠提取純化系 統(tǒng)KingFisher Flex 等，有助于提高生物標(biāo)志物候選物的通量和可重現(xiàn)的定量，在臨床、藥品和生物制品領(lǐng)域已經(jīng)有所應(yīng)用[22-23]。需要注意的是，在食品樣品制備領(lǐng)域，高通量樣品制備技術(shù)尚未得到應(yīng)用，大多仍依靠手工操作，其步驟煩瑣、樣品回收率偏低，有待進(jìn)一步優(yōu)化。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為食品相關(guān)研究打開(kāi)了新思路，不僅可以用于蛋白質(zhì)種類鑒定，還可用于蛋白質(zhì)含量檢測(cè)，以及分析不同物種、產(chǎn)地、生長(zhǎng)階段的食品蛋白質(zhì)組分和食品加工過(guò)程蛋白質(zhì)組變化等。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已在食品的諸多品類中有應(yīng)用，如農(nóng)產(chǎn)品、海產(chǎn)品、乳制品、肉類、微生物類以及食品過(guò)敏原等（表2）。

表2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)中基于質(zhì)譜的分析方法是食品質(zhì)量分析領(lǐng)域中發(fā)展較快的方法，研究流程分為Bottom-up型和Top-down型。前者又稱為鳥(niǎo)槍法，該技術(shù)流程一般分為以下幾步：樣品制備，即從樣品中分離凈化目標(biāo)物；蛋白質(zhì)酶解，將蛋白質(zhì)酶解為肽段；利用色譜技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行分離，隨后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。相較于Bottom-up技術(shù)，Top-down 技術(shù)的不同之處在于蛋白質(zhì)未經(jīng)酶解直接進(jìn)入質(zhì)譜，直接被裂解為肽段進(jìn)行分析。該方法成本高，目前應(yīng)用較少。蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在化妝品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

蛋白質(zhì)和多肽類原料在化妝品生產(chǎn)中的應(yīng)用日益增多，如膠原蛋白、蠶絲蛋白、牛奶提取蛋白、彈性蛋白、角蛋白、小麥水解蛋白等在各類化妝品中已有應(yīng)用。我國(guó)《已使用化妝品原料目錄（2021 年版）》[42]中屬于蛋白質(zhì)類和肽類的相關(guān)原料已有213種。蛋白質(zhì)類原料的應(yīng)用可以使化妝品具有抗衰老、美白、保濕等功效[43]，故該類原料已成為各大化妝品品牌的競(jìng)爭(zhēng)亮點(diǎn)和開(kāi)展基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。但由于有些內(nèi)源性蛋白質(zhì)或多肽具有相對(duì)較高的生物活性，可能具有致敏性，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注[44]。筆者查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前已有基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于化妝品中常見(jiàn)蛋白質(zhì)原料檢測(cè)方面的研究，但對(duì)于實(shí)際化妝品樣品中蛋白質(zhì)應(yīng)用檢測(cè)的蛋白組學(xué)技術(shù)研究尚未有報(bào)道。

3.1 化妝品中動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)原料的分析特點(diǎn)

目前，應(yīng)用于化妝品的蛋白質(zhì)類和肽類原料已有213 種，其中常用的動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)主要有膠原蛋白、角蛋白、骨膠原、胎盤蛋白（動(dòng)物）、彈性蛋白、牛奶蛋白等。該類原料的使用對(duì)皮膚具有一定功能性作用，在化妝品中應(yīng)用廣泛。然而，一些不法商家夸大宣稱或不恰當(dāng)宣傳其功效，從而誤導(dǎo)消費(fèi)者。此外，該類原料價(jià)格相對(duì)較高，部分原料對(duì)儲(chǔ)存條件有一定要求。因此，應(yīng)當(dāng)對(duì)該類原料使用的合規(guī)性多加關(guān)注，如實(shí)際產(chǎn)品與配方的一致性、原料的保管和來(lái)源等。

膠原蛋白是最常用于化妝品的動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)原料，因其具有保濕、再生和成膜特性，有助于皮膚保持適當(dāng)?shù)乃趾浚瑥亩虧?rùn)和軟化皮膚，還可防止機(jī)械損傷引起的皮膚和頭發(fā)損傷[45]。因此，膠原蛋白被廣泛應(yīng)用于美容領(lǐng)域。目前，膠原蛋白主要從哺乳動(dòng)物和魚(yú)皮中提取[46]，但哺乳動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白具有疾病傳染風(fēng)險(xiǎn)，魚(yú)皮中提取的膠原蛋白則具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。研究表明，海洋膠原蛋白中富含Ⅰ型膠原蛋白[47]，人皮膚中主要的膠原蛋白類型也是Ⅰ型[48]，且沒(méi)有疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，是化妝品領(lǐng)域較為理想的膠原蛋白。因此，有必要針對(duì)相關(guān)產(chǎn)品中的膠原蛋白類型及來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)。例如，有研究者利用離子阱質(zhì)譜儀鑒定Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的標(biāo)記肽，使用三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行含量測(cè)定[49]。還有研究者使用快速簡(jiǎn)便的液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）鑒定膠原蛋白標(biāo)記肽，該方法可以同時(shí)檢測(cè)6 種動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白[50]?？傊瑢?duì)于化妝品中的動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)原料，注重分析其來(lái)源和類型。

3.2 化妝品中植物來(lái)源蛋白質(zhì)原料的分析特點(diǎn)

植物蛋白對(duì)人體的皮膚具有較好的親和力，可以提高表皮保濕性能，同時(shí)具有成膜性[51]。植物蛋白含人體8 種必需氨基酸，能促進(jìn)表皮生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)組織、抗衰老、去角質(zhì)等。植物來(lái)源的蛋白質(zhì)類和肽類原料主要用于皮膚或頭發(fā)調(diào)理劑等個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。應(yīng)用于化妝品的植物蛋白主要分為2 種：植物蛋白水解物和水解物的衍生物。其中，水解植物蛋白在個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中的用途報(bào)道最多，共有140 余種配方，約有一半用于免洗產(chǎn)品，且涉及種類繁多，如大豆蛋白、小麥蛋白、燕麥蛋白、杏仁提取蛋白、玉米蛋白及其水解蛋白等[52]。值得關(guān)注的是，歐盟委員會(huì)已經(jīng)對(duì)歐盟化妝品法規(guī)（EC）No.1223/2009 中的“化妝品限用物質(zhì)清單”（附錄Ⅲ）進(jìn)行了修訂，限制了花生油和水解小麥蛋白在化妝品中的使用，規(guī)定化妝品中使用的花生油提取物或衍生物的蛋白最大濃度設(shè)定為0.5μg/ml，水解小麥蛋白中多肽的最大分子量平均值限制為3.5kDa[53]?？傊瑢?duì)化妝品中植物來(lái)源的蛋白質(zhì)類和肽類原料的關(guān)注重點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的該類原料進(jìn)行鑒定及含量檢測(cè)。

有研究者利用質(zhì)譜法對(duì)玉米酒糟的蛋白水解物進(jìn)行分析鑒定，鑒定出APLA、PLFP、LFLP、LPPYL、PLYPLP、NDWHTGPL、LPPYLPS、GSPFLGQ、SWQQPIVGG 等多個(gè)抗氧化活性肽[54]。也有研究者通過(guò)使用質(zhì)譜法確定了3 個(gè)表型組（WDEIA、AD、PR）的特定致敏譜，并通過(guò)LC-MS/MS 確定了幾種小麥過(guò)敏原[55]。還有研究者開(kāi)發(fā)了一種外標(biāo)肽段定量的高靈敏LCMS/MS 檢測(cè)方法，用于定量分析大豆樣品中Gly m 5.0101 的含量，通過(guò)對(duì)Gly m 5.0101 的特異性標(biāo)記肽NPFLFGSNR 定量，檢測(cè)各種大豆種子和豆粕中的痕量Gly m 5.0101[56]。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于食品和化妝品檢測(cè)相關(guān)研究面臨的問(wèn)題與建議

4.1 研究開(kāi)發(fā)過(guò)程中的問(wèn)題與建議

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展至今，從樣品制備、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集到質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析都取得了快速發(fā)展。其中，樣品制備是相關(guān)工作流程中的關(guān)鍵步驟，影響分析的穩(wěn)健性、準(zhǔn)確性和靈敏度，分析步驟主要包括細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)提取、分離、酶消化和脫鹽[57]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食品領(lǐng)域應(yīng)用面臨的一大問(wèn)題是蛋白質(zhì)回收率普遍偏低，如何有效提高提取效率是提高該類方法回收率的關(guān)鍵。在提取食品中蛋白質(zhì)時(shí)，大多通過(guò)使用裂解緩沖液提高提取效率。裂解緩沖液含有尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）等試劑。一般情況下，提取液成分復(fù)雜，需要對(duì)樣品中所含蛋白質(zhì)進(jìn)行富集和凈化。食品中蛋白質(zhì)富集凈化常用方法包括使用有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)沉淀蛋白和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電 泳（SDS-PAGE）分 離富集蛋白，根據(jù)檢測(cè)目的的不同選擇合適的方法?；瘖y品中的蛋白質(zhì)提取、富集方法與食品基本一致。需要注意的是，食品中蛋白質(zhì)組成復(fù)雜，高豐度蛋白質(zhì)或肽段可能會(huì)干擾低豐度蛋白質(zhì)或肽段的檢測(cè)，需要有效的預(yù)分離程序降低樣品的復(fù)雜性。此外，通過(guò)鳥(niǎo)槍法這種蛋白質(zhì)組學(xué)方法可將1 個(gè)蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為多個(gè)肽段，從而導(dǎo)致樣品復(fù)雜度增加[58]。在血液樣本中，利用高豐度蛋白質(zhì)去除試劑盒可以去除樣本中的高豐度干擾蛋白質(zhì)，提高檢測(cè)痕量生物標(biāo)志物的靈敏度[59]。目前，食品領(lǐng)域還未涉及高豐度蛋白質(zhì)去除試劑盒，主要利用凝膠電泳和液相色譜對(duì)蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行分離[60]。同時(shí)，除提高提取效率外，還可從質(zhì)譜端入手，提高蛋白質(zhì)鑒定效率，如所有理論碎片離子質(zhì)譜的順序窗口采集技術(shù)（SWATH-MS）使用相當(dāng)大的母離子分離窗口以系統(tǒng)且無(wú)偏的方式將給定樣品的所有離子化肽段落入指定質(zhì)量范圍內(nèi)，對(duì)所檢測(cè)的離子進(jìn)行全面的定性定量分析[61]。

4.2 使用方法過(guò)程中的問(wèn)題與建議

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜儀器性能的提升，質(zhì)譜法已被廣泛應(yīng)用于大分子蛋白質(zhì)和多肽的絕對(duì)定量研究領(lǐng)域。其中，利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）、平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）技術(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品可以對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)或者多肽進(jìn)行多重精確定量。利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行絕對(duì)定量分析時(shí)，需要使用標(biāo)準(zhǔn)化參考樣品，這是因?yàn)榇祟愌芯块g樣品比較在確定蛋白質(zhì)含量時(shí)所提供的信息只是相對(duì)的。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)絕對(duì)定量分析僅在有限數(shù)量的已知靶蛋白和肽上進(jìn)行，該技術(shù)主要受限于對(duì)合成和適當(dāng)表征的肽和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的需求。一方面，對(duì)于加標(biāo)回收率的評(píng)價(jià)大多只涉及酶解前加入標(biāo)準(zhǔn)肽段，回收率普遍較高，但只是評(píng)價(jià)了酶解過(guò)程的回收率，無(wú)法反映整個(gè)樣品前處理方法的真實(shí)回收率，實(shí)際應(yīng)加入目標(biāo)蛋白來(lái)評(píng)定真實(shí)回收率。另一方面，肽段標(biāo)準(zhǔn)品定值方法多樣，常用方法有質(zhì)量平衡法、氨基酸分析法、化學(xué)衍生化法和元素分析法等，但這些方法普遍耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。有研究者開(kāi)發(fā)了基于定量標(biāo)簽特異性吸收紫外線（UV）波長(zhǎng)用于標(biāo)記肽的基于UV 的定量新方法，該方法成本低、準(zhǔn)確度高，且能夠用于直接定量重組的UV 標(biāo)記肽，直接控制和監(jiān)測(cè)與肽溶解度、沉淀以及吸附等有關(guān)的問(wèn)題[62]。還有研究者使用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)內(nèi)在酪氨酸熒光的替代方法，表征了對(duì)應(yīng)合成的21殘基合成肽的熒光特性，并建立了一種涉及相對(duì)于非肽校準(zhǔn)物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯的定量方法[63]。目前，多肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只有HPLC 級(jí)別，純度僅大于95%，不能準(zhǔn)確反映樣品中肽段含量，建議相關(guān)部門盡快出品肽段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或者由方法使用者自行標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)肽段。