韓金蘭，張惠瑞

（河南省濮陽(yáng)惠民醫(yī)院 病理科，河南 濮陽(yáng) 457000）

結(jié)直腸癌為臨床常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，多見(jiàn)于40歲以上中老年男性群體，相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，此病患病在所有惡性腫瘤中居第三位，病死率居第五位［1］。目前針對(duì)早期結(jié)直腸癌臨床多以外科手術(shù)為主要治療方法，而對(duì)于病情已進(jìn)展至中期、晚期，且已錯(cuò)失手術(shù)最佳時(shí)機(jī)患者來(lái)說(shuō)，含奧沙利鉑的一線(xiàn)化療更具臨床優(yōu)勢(shì)［2］。盡管目前用于治療中晚期結(jié)直腸癌的手術(shù)及化療方案均已逐步成熟及規(guī)范化，但仍有部分患者治療后遠(yuǎn)期生存率較低，常規(guī)治療方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)肉眼無(wú)法察覺(jué)的微小轉(zhuǎn)移病灶的有效治療［3］。近年有研究指出［4-5］，基于遺傳學(xué)改變的錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR）表達(dá)缺失在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中有重要作用，與患者為微衛(wèi)星病灶不穩(wěn)定（MSI）也有密切關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步優(yōu)化中晚期結(jié)直腸癌患者的臨床治療方法，本研究旨在分析MMR基因表達(dá)情況與微衛(wèi)星病灶狀態(tài)及預(yù)后水平的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究以2020年7月至2022年7月河南省濮陽(yáng)惠民醫(yī)院收治的102例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，根據(jù)免疫組化檢測(cè)結(jié)果，將入組患者分為MMR表達(dá)缺失組（dMMR組，42例）和MMR完全表達(dá)組（pMMR組，60例），兩組患者一般資料比較見(jiàn)表1。本次研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（T63738）。

表1 兩組患者一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合結(jié)直腸癌診斷要點(diǎn)［6］；②經(jīng)臨床評(píng)估確認(rèn)為中期、晚期患者；③符合含奧沙利鉑一線(xiàn)化療指征且自愿接受化療；④均已知悉此次研究試驗(yàn)?zāi)康募皟?nèi)容，同意獲取并公開(kāi)既往臨床資料。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①早期結(jié)直腸癌者；②參與本研究前1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)其他相關(guān)化療者；③經(jīng)臨床評(píng)估預(yù)計(jì)生存周期不足1年者；④臨床資料缺失者。

1.2 方法

MMR基因檢測(cè)方法：①將病灶組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片后予以脫蠟，加入0.01 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖溶液修復(fù)切片組織中抗原；加入濃度為3%的過(guò)氧化氫溶液（海德潤(rùn)制藥，H11021382，3%）并于室溫下孵育10 min，然后封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。②應(yīng)用磷酸鹽緩沖液對(duì)樣本進(jìn)行反復(fù)沖洗，后加入1∶10的MMR單抗稀釋后孵育120 min；再次應(yīng)用磷酸鹽緩沖液（北京生物制品研究所，S10850002）反復(fù)沖洗并加入MMR單抗后再孵育30 min經(jīng)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行第3次反復(fù)沖洗后加入二氨基聯(lián)苯胺［北京沃凱生物科技有限公司，滬食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第1401615號(hào)］進(jìn)行原位雜交顯色反應(yīng)。③依次采用蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明并應(yīng)用中性樹(shù)膠予以封片后，于顯微鏡下隨機(jī)觀(guān)察3個(gè)400倍視野，評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度，若腫瘤組織中無(wú)任何細(xì)胞核染色則判定為MMR表達(dá)缺失，反之則為MMR陽(yáng)性。

含奧沙利鉑一線(xiàn)化療方法：首日取130 mg/m2奧沙利鉑（深圳海王藥業(yè)，H20031048，20 mL∶40 mg）加入至500 mL濃度為5%的葡萄糖溶液中稀釋后經(jīng)靜脈持續(xù)滴注2 h；第1～5天按500 mg/m2劑量經(jīng)靜脈注射5-氟尿嘧啶，每3周用藥1次；第1～14天按1 000 mg/m2劑量口服卡培他濱（上海羅氏制藥，H20073024，500 mg），2次/d，21 d為1個(gè)周期，所有患者均連續(xù)治療3個(gè)周期。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

①比較兩組患者的一般資料、臨床資料：一般資料包括性別、年齡、病程、疾病類(lèi)型、病灶直徑等；臨床資料包括腫瘤分化程度（低分化、中分化、高分化）、腫瘤浸潤(rùn)深度（T1～T4）、腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)受累情況（N0～N2）、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（M0、M1）［7］及微衛(wèi)星病灶狀態(tài)［微衛(wèi)星病灶穩(wěn)定（MSS）、微衛(wèi)星病灶檢測(cè)標(biāo)志物<40%（MSI-L）、微衛(wèi)星病灶檢測(cè)標(biāo)志物≥40%（MSI-H）］［8］。②結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的危險(xiǎn)因素分析［9］：由于自變量、因變量間存在非線(xiàn)性關(guān)系，本研究將存在MMR表達(dá)缺失設(shè)為自變量，其余單因素設(shè)為因變量，將存在一定差異的單因素納入Logistic多因素回歸分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為該因素為導(dǎo)致結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的危險(xiǎn)因素。③預(yù)后情況評(píng)估：依據(jù)實(shí)體腫瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［10］，以靶病灶最大直徑和為基數(shù)，若治療后直徑和較基線(xiàn)水平減小>30%時(shí)判定為完全緩解（CR），較基線(xiàn)水平減小20%～30%時(shí)判定為部分緩解（PR），較治療前減小不足20%但病灶未生長(zhǎng)時(shí)判定為病情穩(wěn)定（SD），較治療前病灶再次生長(zhǎng)則判定為疾病進(jìn)展（PD），CR、PR之和百分比記錄為病灶客觀(guān)緩解率（ORR），CR、PR、SD之和百分比記錄為疾病控制率（DCR）；記錄并對(duì)比兩組隨訪(fǎng)期間的無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）、總生存率（OS）、中位PFS以及中位OS，自隨機(jī)分化開(kāi)始，任何原因?qū)е禄颊卟∏檫M(jìn)展記錄為PFS，任何原因?qū)е禄颊咚劳鲇涗洖镺S［11］。④MMR表達(dá)缺失與MSI及預(yù)后的相關(guān)性分析［12］：經(jīng)Spearman相關(guān)性系數(shù)驗(yàn)證MMR表達(dá)情況與MSI、病灶ORR、DCR、中位PFS、中位OS的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS 22.0處理，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素分析結(jié)果顯示，兩組患者的年齡、病灶直徑、腫瘤分化程度、腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)受累情況、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及微衛(wèi)星病灶狀態(tài)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素分析 ［n(%)］

2.2 結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的Logistic多因素回歸分析

結(jié)合單因素分析結(jié)果，分別對(duì)P<0.05的單因素進(jìn)行賦值，具體賦值情況見(jiàn)表3。

表3 各單因素賦值情況

Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，年齡≥60歲、病灶直徑≥5 cm、腫瘤低分化、區(qū)域淋巴結(jié)受累N0、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0、MSI-L或MSI-H為導(dǎo)致結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

表4 不孕癥的Logistic多因素回歸分析

2.3 兩組患者的MSI及預(yù)后情況比較

經(jīng)含奧沙利鉑一線(xiàn)化療治療后，pMMR組的ORR、DCR、中位PFS、中位OS均高于dMMR組，MSI低于dMMR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組患者的預(yù)后情況比較

2.4 MMR表達(dá)缺失與MSI、預(yù)后情況的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性系數(shù)驗(yàn)證，MMR表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌的ORR、DCR、中位PFS、中位OS負(fù)相關(guān)，與MSI表達(dá)正相關(guān)，見(jiàn)表6。

表6 MMR表達(dá)缺失與MSI、預(yù)后情況的相關(guān)性分析

3 討論

結(jié)直腸癌為臨床常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，多見(jiàn)于中老年群體，近年隨國(guó)內(nèi)人口老齡化加劇，其患病率在逐步上升。目前針對(duì)早期結(jié)直腸癌，多以根治性手術(shù)為主要治療方法，但對(duì)于病灶已發(fā)生明顯浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中期、晚期患者，臨床更多會(huì)實(shí)施含奧沙利鉑的一線(xiàn)化療［13］。但實(shí)踐表明［14］，因存在部分肉眼難以識(shí)別的微小轉(zhuǎn)移病灶，部分患者經(jīng)上述一線(xiàn)化療治療后的遠(yuǎn)期生存期仍處于較低水平，深入分析結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制并探討其機(jī)制中的可控環(huán)節(jié)并予以針對(duì)性治療或可進(jìn)一步增加患者臨床獲益。近年隨分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步及發(fā)展，臨床逐步認(rèn)識(shí)到了遺傳學(xué)改變?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生及病情進(jìn)展中的重要作用。

已有的研究證實(shí)［15］，結(jié)直腸癌的MMR表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致微衛(wèi)星病灶不穩(wěn)定并增加微小病灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，除會(huì)加大臨床治療難度外，還可能進(jìn)一步提升病死風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，年齡≥60歲、病灶直徑≥5cm、腫瘤低分化、區(qū)域淋巴結(jié)受累N0、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0、MSI-L或MSI-H為導(dǎo)致結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失的危險(xiǎn)因素。目前已發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的MMR基因主要包括MLH1、MLH2、MSH6、PMS2等4種，當(dāng)上述MMR基因表達(dá)均為陰性時(shí)則判定為MMR表達(dá)缺失［16］。目前認(rèn)為，MMR表達(dá)缺失與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征存在密切關(guān)聯(lián)，MMR基因表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者預(yù)后相對(duì)較好，因此dMMR患者中大多區(qū)域淋巴結(jié)未受累且病灶未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［17］。MMR基因能有效矯正DNA堿基錯(cuò)配并抑制基因突變，對(duì)預(yù)防腫瘤發(fā)生或惡變均有積極意義，但當(dāng)MMR基因受外界生物因素及溫度變化干擾時(shí)，則無(wú)法識(shí)別DNA復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)配并促使MSI發(fā)生［18］。MSI為基因上由多個(gè)重復(fù)單位組成的單核苷酸區(qū)域，廣泛存在于人類(lèi)基因組，其分布均勻，具有多態(tài)性、可遺傳性等特征［19］。本研究中兩組患者的統(tǒng)一經(jīng)含奧沙利鉑方案化療后的預(yù)后情況、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，dMMR組內(nèi)患者多為高度MSI-H，其對(duì)應(yīng)的ORR、DCR較pMMR組更低，中位PFS、中位OS較pMMR組更短，提示若結(jié)直腸癌患者伴有MMR表達(dá)缺失或MSI-H時(shí)不適宜應(yīng)用一線(xiàn)化療進(jìn)行治療。馮強(qiáng)等［20］研究指出，MMR表達(dá)缺失且伴高度MSI者對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑在內(nèi)的一線(xiàn)化療似乎敏感性較低，該研究中，高度MSI患者應(yīng)用FOLFOX4方案治療后的病情復(fù)發(fā)時(shí)間較非MSI患者更短，提示此類(lèi)患者對(duì)含5-FU及奧沙利鉑的FOLFOX4化療方法敏感性較差，且該學(xué)者認(rèn)為，MMR蛋白的表達(dá)與MSI表達(dá)之間存在明顯相關(guān)性。曾輝光等［21］也認(rèn)為，MMR表達(dá)缺失所致MSI可對(duì)結(jié)直腸癌的5-FU基礎(chǔ)化療效果產(chǎn)生不利影響，為有效指導(dǎo)臨床治療，應(yīng)將MSI作為其常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。而本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性系數(shù)驗(yàn)證，MMR表達(dá)與結(jié)直腸癌的ORR、DCR、中位PFS、中位OS正相關(guān)，與MSI表達(dá)負(fù)相關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)了MMR表達(dá)與結(jié)直腸癌MSI及預(yù)后水平的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，結(jié)直腸癌MMR表達(dá)缺失可導(dǎo)致MSI，dMMR及高度MSI會(huì)影響患者含奧沙利鉑一線(xiàn)化療效果，為增加患者臨床獲益并改善預(yù)后水平，應(yīng)進(jìn)行MMR及MSI檢測(cè)并酌情調(diào)整治療方案。