彭禹熙，樊雙喜，張 婭，李細(xì)芬，尹學(xué)忠，王國(guó)江，楊禮紅，侯玉祥，盧 君*，李長(zhǎng)文

（1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州仁懷 564501；2.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)研究院，天津 300410）

2,3-丁二酮（2,3-butanedione，C4H6O2）又稱雙乙酰，稀溶液呈現(xiàn)出奶油、酸奶的氣味。適量的2,3-丁二酮對(duì)白酒具有重要的風(fēng)味作用，有助于進(jìn)口噴香，增強(qiáng)香味感知，但當(dāng)酒體中2,3-丁二酮含量失調(diào)時(shí)，會(huì)使酒體在感官上呈現(xiàn)出“餿飯味”“發(fā)悶”的感受，顯著影響白酒品質(zhì)[1-5]。因此，迫切需要建立一套快速、方便、準(zhǔn)確定量檢測(cè)白酒中2,3-丁二酮的方法。

目前食品中的2,3-丁二酮的檢測(cè)方法主要包括紫外分光光度法[6-7]、熒光分光光度法[8]、高效液相色譜法[9-10]以及氣相色譜法等[5，11，12，14]。其中，分光光度法是最常用的方法，如GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中規(guī)定采用鄰苯二胺比色法測(cè)定啤酒中2,3-丁二酮的含量，然而，該方法不能排除結(jié)構(gòu)類似產(chǎn)物的測(cè)定干擾，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏高。液相色譜法測(cè)定2,3-丁二酮需要進(jìn)行化學(xué)衍生，過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，會(huì)造成結(jié)果誤差[13]。氣相色譜法主要包括直接進(jìn)樣-氣相色譜法（direct injection-gas chromatography-flame ion detector,DI-GC-FID）、頂空進(jìn)樣氣相色譜法（headspace sampling-gas chromatographyflame ion detector,HS-GC-FID）和固相微萃取結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GCMS）。MACCIOLA 等[11]建立了氣相色譜法（GC）測(cè)定乳制品中2,3-丁二酮的新方法，該方法只需丙酮作為溶劑，樣品的制備簡(jiǎn)單、快速、節(jié)省成本。TIAN 等[12]建立了一種基于HS-GC-FID 快速定量分析啤酒中2,3-丁二酮含量的方法，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。王莉等[5]采用靜態(tài)頂空與氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）相結(jié)合建立了一種定量分析白酒中2,3-丁二酮的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同香型白酒中2,3-丁二酮的定量分析。CHEN 等[14]基于SPME 與GC-MS 技術(shù)，建立了定量測(cè)定黃油和空氣樣品中的雙乙酰的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。以上方法采用HS 或SPME 作為樣品前處理方式，樣品之間的氣液平衡可能會(huì)受到基質(zhì)成分的影響，影響測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和回收率。如不選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物作為對(duì)照，采用HS 或SPME 測(cè)定2,3-丁二酮的結(jié)果也可能不夠準(zhǔn)確[15]。此外，直接進(jìn)樣相對(duì)于HS、SPME 而言，無(wú)需進(jìn)行揮發(fā)性成分的提取和濃縮，大大減少了物質(zhì)提取過(guò)程中的損耗，同時(shí)對(duì)比MS 檢測(cè)器，F(xiàn)ID 能夠滿足白酒樣品直接進(jìn)樣的需求[16]。

本研究采用直接進(jìn)樣結(jié)合GC 技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)方法條件，研究建立了GC 外標(biāo)法定量分析檢測(cè)醬香型白酒中2,3-丁二酮的方法，為醬香型白酒質(zhì)量控制提供了檢測(cè)技術(shù)及方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：33 款醬香型白酒成品酒，分別編號(hào)為J1—J33，市售。

試劑及耗材：2,3-丁二酮（色譜級(jí)，＞99%），麥克林；乙醇（色譜級(jí)），科密歐化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：Agilent 8890 氣相色譜儀，Agilent；ME204T 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Gen Pure xCAD Plus 純水機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；0.22 μ m有機(jī)濾膜，比克曼生物科技有限公司；1 mL 一次性注射器，康城醫(yī)療器械。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

（1）53%vol 乙醇溶液：量取265 mL 乙醇（色譜級(jí)）加二純水定容于500 ml 容量瓶中，搖勻，即得53%vol乙醇溶液。

（2）2,3-丁二酮儲(chǔ)備液：精確稱取2,3-丁二酮標(biāo)準(zhǔn)品23.50 mg 于100 mL 容量瓶中，用53%vol 乙醇溶液定容，得到濃度為235 mg/L 2,3-丁二酮儲(chǔ)備液。

（3）2,3-丁二酮工作液：用移液管精確移取2,3-丁二酮儲(chǔ)備液0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用53%乙醇溶液定容，混合均勻，配制成不同梯度2,3-丁二酮工作液，各濃度分別為7.05 mg/L、11.75 mg/L、23.50 mg/L、35.25 mg/L、47.00 mg/L、70.50 mg/L、94.00 mg/L、117.50 mg/L。

1.2.2 樣品前處理

采用直接進(jìn)樣的前處理方法，樣品需過(guò)膜去除雜質(zhì)。取酒樣搖勻后放置磨口玻璃瓶?jī)?nèi)待用，取適量樣品過(guò)0.22 μ m 濾膜后置于進(jìn)樣小瓶，供GC分析。

1.2.3 儀器檢測(cè)條件

GC條件：采用HP-FFAP色譜柱（50 m×0.2 mm，0.33 μ m，型號(hào)：19091F-105）；進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度220 ℃；程序升溫為初始柱溫40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min 升溫至230 ℃，保持20 min；載氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.999 %），流量控制方式為恒流模式，流量1 mL/min；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比1∶20；進(jìn)樣量為1 μ L。

1.2.4 定性定量方法

利用2,3-丁二酮標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性。將不同濃度的2,3-丁二酮工作液按照上述樣品處理方法處理后進(jìn)行儀器分析，以2,3-丁二酮峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.1.1 柱流量

柱流量會(huì)影響樣品譜圖色譜峰形狀，流速過(guò)小會(huì)導(dǎo)致譜圖呈現(xiàn)矮寬峰，流速過(guò)大則會(huì)造成色譜柱中固定相物質(zhì)的流出，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比了柱流量分別為0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min 時(shí)氣相色譜對(duì)2,3-丁二酮的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱流量對(duì)其分離效果影響不大。因此，結(jié)合色譜柱常用柱流速，最后選擇1 mL/min為本研究柱流量檢測(cè)條件。

2.1.2 分流比

分流比較大，會(huì)造成溶劑拖尾對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生遮掩；分流比較小，會(huì)造成目標(biāo)峰峰型較差或者被基線噪聲掩蓋[17]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了分離比分別為1∶10、1∶20、1∶30 時(shí)2,3-丁二酮的分離效果，當(dāng)分流比為1∶10時(shí)，會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)峰2,3-丁二酮與左邊干擾峰乙酸丙酯共流出的現(xiàn)象，2,3-丁二酮不能得到很好的分離；提高分流比到1∶20 時(shí)，目標(biāo)峰2,3-丁二酮可以與乙酸丙酯得到很好的分離且峰型良好（詳見圖1）；當(dāng)分流比為1∶30 時(shí)，雖然目標(biāo)峰2,3-丁二酮可以得到分離但其峰型較差。因此，選擇分流比1∶20作為最佳分流比。

圖1 白酒氣相色譜圖（分流比1∶20）

2.1.3 升溫程序

升溫程序影響分配系數(shù)、分配比，從而影響分離度和分析時(shí)間。升溫速度慢，峰型扁平，分析時(shí)間長(zhǎng)；升溫速度快，分配系數(shù)小，不能達(dá)到有效分離[18]。本實(shí)驗(yàn)選擇優(yōu)化40 ℃升至90 ℃這段升溫速率，對(duì)比了升溫速率分別為2 ℃/min、3 ℃/min、4 ℃/min時(shí)氣相色譜對(duì)2,3-丁二酮的分離效果。當(dāng)升溫速率分別為2 ℃/min、3 ℃/min 時(shí)，2,3-丁二酮都可以得到很好的分離效果；當(dāng)升溫速率為4 ℃/min 時(shí)，部分實(shí)驗(yàn)樣品會(huì)出現(xiàn)2,3-丁二酮與左邊干擾峰乙酸丙酯共流出的現(xiàn)象。綜合考慮時(shí)間和分離效果，優(yōu)化后柱溫箱的升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞叵?0 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min。

2.2 方法的線性范圍、檢出限與定量限

通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件（柱流量、柱溫箱升溫速率和分流比），得到最終的GC 檢測(cè)方法為：柱流速為1 mL/min，分流比1∶20，柱溫箱的升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞叵?0 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min。后續(xù)將展開直接進(jìn)樣-氣相色譜檢測(cè)2,3-丁二酮的方法學(xué)驗(yàn)證。

按1.2.1 進(jìn)行2,3-丁二酮工作液的配制，各吸取1 μ L 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，以目標(biāo)峰的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以目標(biāo)峰的峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2,3-丁二酮的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限，詳見表1。由表1 可知，該方法在質(zhì)量濃度7.05～117.50 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.998。利用2,3-丁二酮工作液的最低濃度水平為依據(jù)，3 倍信噪比計(jì)算檢出限，10 倍信噪比計(jì)算定量限，得到2,3-丁二酮的檢出限為0.67 mg/L（S/N=3），定量限為2.24 mg/L（S/N=10），結(jié)果表明，該方法能夠滿足醬香型白酒中2,3-丁二酮的定量檢測(cè)需求。

表1 方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

2.3 精密度試驗(yàn)與加標(biāo)回收率試驗(yàn)

2.3.1 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)可分為分析重復(fù)性測(cè)試、進(jìn)樣重復(fù)性測(cè)試以及中間精密度測(cè)試。

分析重復(fù)性測(cè)試：對(duì)同一待測(cè)樣品，按照1.2.2要求進(jìn)行前處理，同時(shí)制備6 份測(cè)試溶液，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算分析目標(biāo)物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

進(jìn)樣重復(fù)性測(cè)試：取任一制備好的樣品，按照1.2.2要求進(jìn)行樣品前處理，重復(fù)進(jìn)樣6 次，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算分析目標(biāo)物含量的RSD值。

中間精密度測(cè)試：按照上述前處理方法和儀器條件，隨機(jī)取一份供試樣品，分別由同一人員在不同天數(shù)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同天數(shù)檢測(cè)目標(biāo)物含量的RSD值。

精密度試驗(yàn)具體結(jié)果，詳見表2。由表2 可以看出，2,3-丁二酮分析重復(fù)性測(cè)試結(jié)果RSD 為0.85 %，進(jìn)樣重復(fù)性測(cè)試結(jié)果RSD 為0.41 %，中間精密度測(cè)試結(jié)果RSD 為1.44 %，表明該方法精密度良好，符合分析精密度要求。

表2 方法精密度

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取同一批白酒樣品適量，按照上述前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行分析。根據(jù)該樣品中2,3-丁二酮的實(shí)際濃度，按50 %、100 %、150 %三個(gè)水平分別添加，每個(gè)水平平行六份，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試樣品及加標(biāo)樣品中2,3-丁二酮的含量，考察該方法的加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率=（加標(biāo)樣品平均測(cè)得量-樣品平均測(cè)得量）/加標(biāo)量*100%。2,3-丁二酮的加標(biāo)回收率測(cè)試結(jié)果，如表3 所示。由表3可知，2,3-丁二酮的加標(biāo)回收率在82.77 %～112.61 %之間，均在允許回收率限度范圍內(nèi)，結(jié)果表明該方法回收率良好，符合分析加標(biāo)回收率要求。

表3 方法加標(biāo)回收率

2.4 酒樣檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法，對(duì)市售33 款醬香型白酒樣品的2,3-丁二酮含量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定2 次，計(jì)算平均值，檢測(cè)結(jié)果見表4。由表4 可知，32 款白酒樣品中均檢測(cè)出了2,3-丁二酮，含量在3.97～29.49 mg/L 之間，32 款醬香白酒樣品的2,3-丁二酮含量的平均值為9.99 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.42 mg/L。2,3-丁二酮在醬香白酒中普遍存在且含量差異明顯，醬香白酒的風(fēng)味協(xié)調(diào)與穩(wěn)定性是由各種風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果，某種成分含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響醬香型白酒的香氣協(xié)調(diào)，感官上會(huì)造成不愉悅的感受。

表4 33款醬香型白酒中2,3-丁二酮測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了直接進(jìn)樣-氣相色譜（DI-GC）外標(biāo)法定量分析醬香白酒中2,3-丁二酮的方法。通過(guò)對(duì)方法參數(shù)（柱流速、分流比和柱溫箱升溫程序）進(jìn)行優(yōu)化及確認(rèn)，驗(yàn)證及考察了該方法的線性范圍、檢出限、定量限、精密度和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，該方法在質(zhì)量濃度7.05～117.50 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998）；檢出限為0.67 mg/L（S/N=3），定量限為2.24 mg/L（S/N=10）；加標(biāo)回收率范圍在82.77 %～112.61 %之間；日內(nèi)與日間RSD 分別為0.41 %和1.44 %。對(duì)市售33 款醬香白酒中的2,3-丁二酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，32 款醬香白酒中含量范圍在3.97～29.49 mg/L 之間，平均值為9.99 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD=5.43 mg/L。2,3-丁二酮在醬香型白酒中普遍存在，不同醬香白酒樣品中2,3-丁二酮的含量表現(xiàn)出一定的差異。2,3-丁二酮是醬香白酒風(fēng)味相關(guān)的重要指標(biāo)，其含量過(guò)高或過(guò)低會(huì)造成白酒感官風(fēng)味的不協(xié)調(diào)，影響酒體品質(zhì)。本研究建立的基于GC-FID 檢測(cè)醬香型白酒中2,3-丁二酮的測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可以廣泛推廣應(yīng)用于醬香型白酒中2,3-丁二酮含量測(cè)定。