劉秋云，劉睿童，唐東亞，王平剛，程玉鑫，李苑麟，黃永光*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州花酒有限公司，貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）屬薔薇科薔薇屬植物[1]，是我國新興的特色果樹資源，廣泛分布于貴州、四川、湖北等省，其中由以貴州省資源最為豐富[2]。2020 年，刺梨在貴州省經(jīng)濟(jì)栽培面積超13 萬hm2，鮮果產(chǎn)量超10 萬t[3]，重點分布在六盤水市、遵義市、畢節(jié)市及黔南布依族苗族自治州4 個市州[4]。由于刺梨中的維生素C含量極高（達(dá)2585 mg/100 g鮮果）且含超氧化物歧化酶（SOD），被廣泛應(yīng)用于食品加工產(chǎn)業(yè)，如刺梨汁[5]、刺梨茶[6]、刺梨酒[7]、罐頭[8]和糕點[9]等，其中刺梨酒一直是研發(fā)熱點[10]。

果酒是以水果或果汁為原料，主要經(jīng)破碎、榨汁、發(fā)酵、調(diào)配等工藝制作而成的酒精濃度在7%～18%的飲料酒，根據(jù)其釀造工藝的不同大致可分成發(fā)酵果酒、蒸餾果酒、配制果酒和起泡果酒4 種[11]。目前對果酒的研究主要集中于保健功能和香氣成分，郭志君等[12]采用離子色譜法和頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法對進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵后的刺梨酒的香氣揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測，共檢測到114種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括酯類48種、醇類26種、酸類13 種、烷烴類10 種；洪鎏等[13]通過頂空固相微萃?。℉eadspace Solid Phase Microextraction,HSSPME）、氣相色譜-嗅聞技術(shù)、GC-MS 對櫻桃酒的特征香氣成分進(jìn)行探究，共測得特征香氣化合物共31 種，其中反-3-己烯酸乙酯、丙醇、苯乙醇、己酸、辛酸、糠醛和苯甲醛是櫻桃酒的主要香氣成分；張新華等[14]通過GC-MS 對玫瑰花酒陳釀過程中的香氣成分變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其苯乙醇、總酸及總酯的含量不斷增加，而苯甲醇、雜醇油的含量則呈下降趨勢；劉志剛等[15]通過HS-SPME 結(jié)合GC-MS 對8 種獼猴桃果酒的香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種的獼猴桃果酒的揮發(fā)性成分均在80 種以上，且酯類物質(zhì)的種類和含量均占比最多，此外醇類和酸類的種類較多。

在食品及其他一些行業(yè)，香氣感知的質(zhì)量和強(qiáng)度是影響消費(fèi)者體驗的決定性部分。GC-MS 是探究酒精飲料中香氣成分最常用的檢測技術(shù)，通常用于測定低含量揮發(fā)性化合物，結(jié)合了氣相色譜具有高效分離能力和質(zhì)譜對未知物具有獨特鑒定能力的優(yōu)點[16]?；诖?，本研究選用以刺梨酒為代表的5 種貴州特色發(fā)酵酒，通過GC-MS 和感官評價法分析比較了其主要揮發(fā)性香氣成分和感官特性的差異，期望為果酒質(zhì)量提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒樣

選取市面所售的貴州特色發(fā)酵酒共5 種，具體信息詳見表1。

表1 5種貴州特色發(fā)酵酒信息

1.1.2 試劑與儀器

試劑及耗材：氯化鈉（分析純）、二氯甲烷（色譜級），均購于上海國藥集團(tuán)；超純水，由超純水機(jī)（Labonova Direct Pro S）制備，購于Think-Lab Corporation 公司。

儀器設(shè)備：分析天平（FA1104），購于上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Chromatec Crystal 9000 系），購于Fuli 公司；渦旋振蕩器（Traveller），購于北京華銳捷科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

參考馬宇等[17]方法，吸取10 mL 稀釋至酒精度10%vol 的酒樣，加入3 g 左右NaCl 至飽和，加入20 μL 混合內(nèi)標(biāo)仲辛醇（終濃度9.15 mg/L）、乙酸戊酯（終濃度8.95 mg/L）、2-乙基丁酸（終濃度9.39 mg/L），2 mL 二氯甲烷于渦旋振蕩器中振蕩3 min，靜置分層后取有機(jī)相。

1.2.2 GC-MS色譜條件

GC條件：采用DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)；檢測器和進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣，氦氣作為載氣，流量2 mL/min，色譜柱初溫40 ℃維持2 min，以3 ℃/min 升溫到110 ℃，再以3.5 ℃/min升溫至250 ℃，并保持該溫度15 min。

MS 條件：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 25～550。

1.2.3 揮發(fā)性成分的定性和定量

本研究中有標(biāo)樣的化合物用外標(biāo)法定量，無標(biāo)樣的化合物采用內(nèi)標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量:以體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液為溶劑配制待測物標(biāo)準(zhǔn)液，并進(jìn)行梯度稀釋，分析條件與酒樣分析條件相同。采用選擇離子法計算各化合物的峰面積，以化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，建立相關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行全定量分析。根據(jù)樣品總離子流圖，結(jié)合NIST17a.L 譜庫對不同樣本中主要揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行鑒定，篩選匹配度達(dá)到85%以上的化合物作為主要香氣成分，同時排除柱流失等干擾性化合物。以仲辛醇、乙酸戊酯、2-乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)作為峰面積參照，采用內(nèi)標(biāo)法半定量計算其余組分含量。

1.2.4 感官分析

根據(jù)文獻(xiàn)[18]方法，選取10 人對5 個發(fā)酵酒樣品從香氣和滋味兩個維度進(jìn)行感官評價。品評人員包括研究白酒風(fēng)味的6 名研究生和具有10 年以上品酒經(jīng)驗的4 名老師（國家一級品酒師、貴州省白酒評委）。經(jīng)培訓(xùn)練習(xí)后，感官品評人員對5 款發(fā)酵酒樣品的香氣，如發(fā)酵香（酒香）、草本/生青、花香、甜香、果香、醋香等香氣和酸味、甜味、苦味、澀味、協(xié)調(diào)度、澄清度等感官強(qiáng)度進(jìn)行評定，評定分?jǐn)?shù)范圍為0～5，0 分為未聞/感知到，5 分為聞/感知到的香氣最強(qiáng)。取20 mL 酒樣于白酒品評專用杯中，于室溫下（20 ℃±1 ℃）進(jìn)行感官評定，取所得分值結(jié)果的平均值做感官評價雷達(dá)圖。

1.2.5 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Excel 2021 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用在線平臺聯(lián)川生物云平臺（https://www.omicstudio.cn/）進(jìn)行偏最小二乘（PLS-DA）分析；采用Origin 2023（學(xué)生版）和在線平臺Chiplot（https://www.chiplot.online/）進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品主要揮發(fā)性香氣成分分析

在5 個樣品中檢測到主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)共計121 種，包括醇類27 種、酯類35 種、酸類23 種、醛酮類14 種及其他類22 種，其中有6 種化合物是5 個樣品所共有的，分別是異丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯丙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯。研究結(jié)果表明，5個發(fā)酵酒樣品中醇類、酸類和酯類的種類差異較大，揮發(fā)性成分的總和也存在差異；數(shù)量上，酯類、醇類和酸類是揮發(fā)性化合物中含量最多的三個類群。

經(jīng)鑒定的主要揮發(fā)性香氣化合物中，酯類成分的種類最多。在蒸餾酒中酯類物質(zhì)的含量與比例會影響酒體風(fēng)格[19]，在果酒中，酯類物質(zhì)是果酒重要的香氣成分，賦予果酒濃郁的花香和果香[20]。乳酸乙酯呈現(xiàn)水果和甜香香氣，在5 個樣品中均以較高濃度存在，且以水果為原料的發(fā)酵酒普遍高于以食用花卉為原料的發(fā)酵酒：YT(191.42 mg/L±110.96 mg/L)＞CL(101.21 mg/L±58.35 mg/L)＞BXG(85.97 mg/L±20.53 mg/L)＞MGBG(20.02 mg/L±6.87 mg/L)＞MGGH(8.32 mg/L±0.55 mg/L)。琥珀酸單乙酯呈現(xiàn)微弱的水果香氣等令人愉快的氣味，在以水果為原料的發(fā)酵酒中表現(xiàn)出了較高的含量，在BXG 樣品中相對含量占比為52.27 %、YT 樣品中為48.22%、CL 樣品中為31.97%，關(guān)于琥珀酸單乙酯的香氣描述尚未見報道。丁二酸二乙酯呈現(xiàn)煮熟的蘋果和依蘭香氣和熱帶水果味道，丁二酸二乙酯的含量是區(qū)分同年份葡萄酒是否經(jīng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵的差異化合物之一[21]，本次在5 款發(fā)酵酒樣品均檢測到，其含量濃度排序為BXG(91.98 mg/L±27.30 mg/L)＞YT(16.07 mg/L±2.91 mg/L)＞MGBG(4.45 mg/L±1.19 mg/L)＞CL(3.93 mg/L±0.73 mg/L)＞MGGH(2.02 mg/L±1.19 mg/L)。

在飲料酒工業(yè)中，一般碳原子數(shù)大于2 的醇稱為高級醇（higher alcohols），如異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，其對酒精飲料的質(zhì)量影響巨大，影響的積極性或消極性取決于高級醇的濃度、香氣強(qiáng)度以及酒精飲料的類型[22]。酵母產(chǎn)生的高級醇可以通過碳源的Harris 途徑合成，也可以通過Ehrlich 途徑降解支鏈氨基酸合成[23]。苯乙醇呈現(xiàn)玫瑰花的香氣，在5 款發(fā)酵酒樣品中均有檢出，按含量占比排序為MGBG(48.96 %)＞BXG(23.25 %)＞MGGH(18.28 %)＞CL(17.30 %)＞YT(7.09 %)。異戊醇表現(xiàn)為杏仁、清香和刺激味，在MGGH和BXG樣品中含量占比最高，分別為69.66%和67.74%。(+)-α-松油醇具有紫丁香氣味，是兩款以玫瑰花為原料釀造酒特有的主要揮發(fā)性香氣化合物，且(+)-α-松油醇含量在MGBG樣品中(0.42 mg/L±0.15 mg/L)略高于MGGH樣品(0.66 mg/L±0.26 mg/L)。

圖1 5個發(fā)酵酒樣品主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類圖

圖2 5個發(fā)酵酒樣品主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量圖

有機(jī)酸類物質(zhì)也是經(jīng)由糖類或氨基酸通過酵母代謝產(chǎn)生的，其既是飲料酒中的呈味化合物，同時對果酒的香氣也起著重要的補(bǔ)充和修飾作用[20]。除MGGH 和CL 樣品外，酸類物質(zhì)在其余幾款釀造酒樣品中含量甚微。在MGGH和CL樣品的酸類物質(zhì)中，山梨酸的含量最高且相似，分別為142.80 mg/L±16.92 mg/L 和145.27 mg/L±27.04 mg/L。山梨酸屬于有機(jī)酸類防腐劑，具有較好的抗菌性能，通過抑制微生物體內(nèi)的脫氫酶系統(tǒng)達(dá)到抑制微生物的生長作用。乙酸常呈現(xiàn)尖銳的、刺激性的酸味，在MGGH 和MGBG 樣品中含量相似，分別為30.56 mg/L±10.68 mg/L 和35.05 mg/L±10.95 mg/L。苯甲酸呈現(xiàn)油脂香，在YT 樣品中的酸類物質(zhì)中含量最高，為46.11 mg/L±10.15 mg/L。

2.2 感官評價分析

10 名品評員對8 個樣品的6 個香氣指標(biāo)和6 個滋味指標(biāo)進(jìn)行感官評價并打分，感官評價結(jié)果如圖3所示。

圖3 5個發(fā)酵酒樣品香氣與滋味感官評價雷達(dá)圖

在香氣方面，MGGH 和MGBG 樣品以花香為主，輔以甜香和果香，這與苯乙醇的高含量有關(guān)。以水果為原料的發(fā)酵酒的香氣層次較食用花卉發(fā)酵酒更為豐富，這與水果本身特有的香氣相關(guān)，果實本身的香氣成分是形成果酒典型風(fēng)味的最重要來源[25]。

在滋味方面，MGGH 和MGBG 樣品表現(xiàn)相似，這與兩個樣品發(fā)酵用原料相同有關(guān)；BXG 與CL 樣品表現(xiàn)相似，推測這與百香果及刺梨酸度和甜度均較大的特點相關(guān)[26-27]；YT 樣品在澀味方面表現(xiàn)突出，這是由于氨基酸、有機(jī)酸、酚類化合物是櫻桃酒中最重要的不揮發(fā)化合物，其對櫻桃酒的酸度、苦味、收斂性（澀味）及澄清度均有重要作用[28]。

2.3 偏最小二乘法分析

從圖4A 可看出，CL、MGBG、MGGH、YT 組樣品分別分布在第一象限、第二象限、第四象限，BXG組樣品分布在原點附近，5 款樣品在PC1 和PC2 兩個方向上均有較好的區(qū)分。且同種原料發(fā)酵酒的平行實驗樣品聚集在一起，R2為0.7725，說明實驗穩(wěn)定性較好。有19 種物質(zhì)的VIP＞1，可以作為區(qū)分這5 種發(fā)酵酒的主要差異性揮發(fā)性香氣化合物，分別為異丁醇、3-己烯-1-醇、(+)-α-松油醇、正己醇、3-甲硫基丙醇、糠醇、琥珀酸單乙酯、煙酸乙酯、富馬酸單乙酯、4-羥基丁酸、山梨酸、苯乙酸、苯甲酸、蘋果酸、糠酸、2H-吡喃-2,6-二酮、3-羥基-2-丁酮、苯酚和2,4-二叔丁基酚。

圖4 基于主要風(fēng)味物質(zhì)的PLS-DA得分圖（A）和模型檢驗圖（B）

3 結(jié)論

本研究針對5 種貴州特色資源為原料釀制而成的5 款貴州特色發(fā)酵酒樣品的主要香氣成分進(jìn)行研究，共檢測到主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)共計121種，包括醇類27 種、酯類35 種、酸類23 種、醛酮類14 種及其他類22 種，其中丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯丙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯為5 個樣品所共有。在含量上5 個樣品的主要揮發(fā)性香氣化合物均主要由酯類、醇類化合物構(gòu)成，其次是酸類化合物。琥珀酸單乙酯（呈微弱的水果香氣）在以水果為原料的發(fā)酵酒中均有較高的含量，其中BXG 組占比52.27 %、YT 組占比48，22 %、CL 組占比31.97 %。異戊醇（杏仁、清香和刺激味）在MGGH和BXG 樣品中的含量分別高達(dá)69.66 % 和67.74 %。(+)-α-松油醇具有紫丁香氣味，是兩款以玫瑰花為原料釀造酒特有的主要揮發(fā)性香氣化合物。在感官評價方面，5 個樣品中YT 組在澀味方面的表現(xiàn)較為突出；水果原料發(fā)酵酒的香氣層次更為豐富。通過PLS-DA 的變量投影重要度分析確定了能夠區(qū)分19 種不同原料發(fā)酵酒的主要特征標(biāo)志物，分別為異丁醇、3-己烯-1-醇、(+)-α-松油醇、正己醇、3-甲硫基丙醇、糠醇、琥珀酸單乙酯、煙酸乙酯、富馬酸單乙酯、4-羥基丁酸、山梨酸、苯乙酸、苯甲酸、蘋果酸、糠酸、2H-吡喃-2,6-二酮、3-羥基-2-丁酮、苯酚和2,4-二叔丁基酚。

表2 5種發(fā)酵酒主要差異性揮發(fā)性香氣化合物VIP值得分表