屈嘉燕，周潤(rùn)宇，繆成鵬，王群力，張曉紅，高邦牢，江理廣，惠竹梅，4*，王雪飛，4*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.山西戎子酒莊有限公司，山西鄉(xiāng)寧 042100；3.福建藍(lán)家渡酒莊有限公司，福建上杭 364200；4.陜西葡萄與葡萄酒工程中心，陜西楊凌 712100)

貴腐葡萄酒又稱“液體黃金”，是用灰霉菌侵染的成熟葡萄果實(shí)釀造而成的高端甜型葡萄酒，其香氣復(fù)雜濃郁、口感甜美、風(fēng)味獨(dú)特，具有較高的產(chǎn)品附加價(jià)值[1-2]。貴腐葡萄原料產(chǎn)生的自然條件較為苛刻，需在溫差較大的河流交會(huì)山谷處產(chǎn)生，且感染時(shí)機(jī)難以控制。世界上的自然貴腐酒大多數(shù)產(chǎn)自歐洲[3]，著名的貴腐酒有法國(guó)波爾多產(chǎn)區(qū)的蘇玳（Sauternes）、匈牙利托卡伊（Tokaji）產(chǎn)區(qū)的奧蘇（Aszú）、德國(guó)精選干甜葡萄特級(jí)優(yōu)質(zhì)酒（Trockenbeerenausless）等[4]。

在灰霉菌成功侵染葡萄果實(shí)后，早上潮濕的氣候有利于灰霉菌生長(zhǎng)，中午過(guò)后的干熱天氣使得葡萄果實(shí)中的水分從侵染的小孔處蒸發(fā)。在這種獨(dú)特的條件下，葡萄漿果逐漸干縮，糖、酸和香氣物質(zhì)等也得到進(jìn)一步濃縮[5-6]，最終賦予新鮮葡萄酒柑橘和干果風(fēng)味，賦予陳年葡萄酒橘皮風(fēng)味并伴有蜂蜜或者蠟狀的特征[7]。由于自然貴腐作用對(duì)氣候條件要求苛刻，且除歐洲傳統(tǒng)的優(yōu)質(zhì)貴腐酒產(chǎn)區(qū)外，世界上其他的葡萄酒產(chǎn)區(qū)很難發(fā)生自然貴腐作用[8]，這極大的提高了貴腐酒的生產(chǎn)和釀造成本，限制了貴腐酒的產(chǎn)量和消費(fèi)市場(chǎng)，導(dǎo)致其難以成為大眾消費(fèi)品。

針對(duì)自然貴腐酒對(duì)氣候條件的高要求、釀造的高成本以及潛在的市場(chǎng)需求，人工貴腐酒的釀造方法得以研究并取得了一定進(jìn)展。Sivertsen 等[9]和Magyar 等[10]在成熟或采摘后的葡萄果實(shí)表面人工噴灑灰霉菌孢子懸液獲得兩種人工貴腐葡萄原料。Tosi 等[11]將新采摘的葡萄依次進(jìn)行人工灰霉菌孢子懸液噴灑處理和干化處理，最后對(duì)所釀葡萄酒進(jìn)行香氣分析，發(fā)現(xiàn)灰霉菌的侵染水平和葡萄的干化程度對(duì)貴腐酒中揮發(fā)性物質(zhì)的影響較大，灰霉菌的侵染和干化過(guò)程使葡萄酒中酯類、內(nèi)酯類、萜烯類、C13-去甲類、異戊二烯類、醛酮類和酚類物質(zhì)等總量增加，且經(jīng)灰霉菌感染后葡萄汁的酯酶活性升高，貴腐酒中酯類物質(zhì)的總含量降低。陶永勝等[12]采用人工接種葡萄果實(shí)和葡萄汁的方法來(lái)釀造貴腐酒，結(jié)果表明使用人工貴腐葡萄和人工貴腐葡萄汁所釀酒中的高級(jí)醇質(zhì)量濃度較小，人工貴腐葡萄所釀酒中含有γ-癸內(nèi)酯、苯乙酸和2-壬酮等特殊香氣物質(zhì)，人工貴腐葡萄汁所釀酒的香氣更為復(fù)雜和典型，具有明顯的焦糖、甜杏、芒果、烘烤等特征。

我國(guó)葡萄酒產(chǎn)品以干型酒為主，甜型酒較少，貴腐葡萄酒極少且未能實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)[8，13]，人工貴腐酒生產(chǎn)在我國(guó)具有良好的發(fā)展前景。從現(xiàn)有研究來(lái)看，前人研究主要集中于人工貴腐葡萄酒的釀造過(guò)程及其品質(zhì)特征分析，未有研究桃紅貴腐葡萄酒產(chǎn)品的報(bào)道。因此，本研究在總結(jié)前人的研究成果上加以創(chuàng)新，采用人工接種灰霉菌孢子懸液的方式制備貴腐葡萄果實(shí)，結(jié)合釀造工藝的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行小容器釀造，通過(guò)理化指標(biāo)檢測(cè)、香氣成分分析和感官品鑒，評(píng)價(jià)桃紅貴腐葡萄酒的品質(zhì)特征與釀造工藝的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料菌種：健康和自然貴腐的“美樂(lè)”（Merlot）葡萄于2021 年9 月采自山西戎子酒莊葡萄園，采后立刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理；灰霉菌（Botrytis cinerea）保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院。

PDA 培養(yǎng)基[12]：土豆汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 %、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、瓊脂粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、硫酸鎂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、磷酸二氫鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%。

儀器設(shè)備：GC/MS-QP2020 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；安東帕Lyza 5000 葡萄酒分析儀，奧地利安東帕公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 灰霉菌孢子懸液的制備

灰霉菌孢子懸液的制備參考陶永勝等[14]的方法，略作修改。具體方法為：將灰霉菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，用牙簽挑取菌絲于50 mL離心管中，加入20 mL 無(wú)菌水，8000 r/min 渦旋1 min，隨后用4層紗布過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)入新的50 mL 離心管中，使用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋至孢子終濃度為106cfu/mL。最后在濾液中加入9 g/L氯化鈉、10 g/L蔗糖和0.01%吐溫-80配制成灰霉菌孢子懸液。

1.2.2 貴腐葡萄果實(shí)的制備

葡萄果實(shí)離體接種參考蘭圓圓[3]方法，略作修改。采集健康、成熟度良好的美樂(lè)葡萄果實(shí)，均勻噴灑75 %的酒精于表面進(jìn)行消毒，重復(fù)三次。晾干后，將制備好的灰霉菌孢子懸液噴灑在葡萄果穗表面，隨后將果穗裝入感濕培育袋中，設(shè)置培養(yǎng)箱溫度24 ℃±2 ℃，濕度75 %，培養(yǎng)至噴施灰霉菌孢子懸液的葡萄果實(shí)表面均勻長(zhǎng)滿灰霉菌絲。對(duì)獲得的葡萄果實(shí)進(jìn)行逐穗挑選，去除干癟果粒，將果穗平鋪于托盤中，40 ℃烘箱中烘至失水率30%～40%，含糖量達(dá)270～290 g/L。

對(duì)照處理中健康的葡萄果實(shí)采用9 g/L 氯化鈉、10 g/L 蔗糖和0.01 %吐溫-80 配制成的無(wú)菌溶液噴施，其余步驟同上。對(duì)照組處理果實(shí)用于釀造美樂(lè)甜紅葡萄酒。

美樂(lè)自然貴腐酒的葡萄果實(shí)采摘于山西戎子酒莊葡萄園。

1.2.3 小容器釀造

采用5 L 廣口玻璃瓶進(jìn)行發(fā)酵和貯藏，參照牛見明等[15]、王超萍等[1]和杜娟等[16]方法，略作修改。將烘干處理后的葡萄果實(shí)迅速除梗破碎、入罐，加入80 mg/L SO2，2 h 后加入20 mg/L 果膠酶（Lallemand EX-V），15～18 ℃浸漬發(fā)酵24 h 后接出自流酒，皮渣帽壓榨取汁。隨后接種2%活化后的釀酒酵母（Lalvin D254），控溫在15～18 ℃進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)比重降至1.050 左右時(shí)，加入60 mg/L SO2，滿罐密封轉(zhuǎn)移至4 ℃靜置沉淀。20 d 后，加入1 g/L 經(jīng)活化的膨潤(rùn)土，再次滿罐密封，4 ℃靜置，20 d 后虹吸出上層酒液加入100 mg/L 山梨酸鉀滿罐密封，4 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.4 葡萄酒理化指標(biāo)檢測(cè)

使用安東帕Lyza 5000 葡萄酒分析儀進(jìn)行葡萄酒基本理化指標(biāo)的檢測(cè)，所測(cè)指標(biāo)包括乙醇、總糖、葡萄糖、果糖、可滴定酸、蔗糖、丙三醇、揮發(fā)酸、酒石酸、總多酚、蘋果酸、乳酸、葡萄糖酸、pH值、密度、固形物。

1.2.5 香氣成分檢測(cè)

參考陶永勝等[12]的方法，采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行香氣化合物分析。

香氣成分萃?。菏褂肈VB/CAR/PDMS 萃取纖維（50/30 μm 涂層厚度，2 cm，可伸縮長(zhǎng)度）進(jìn)行香氣成分萃取。在裝有磁力攪拌子的20 mL 頂空瓶中加入8 mL 酒樣、2 g NaCl 和50 μL 內(nèi)標(biāo)液（0.4 mg/L，2-辛醇），啟動(dòng)攪拌子，在40 ℃水浴中穩(wěn)定10 min，隨后用萃取頭吸附40 min，將萃取頭放入GC進(jìn)樣口熱解析5 min。

GC-MS 分析條件：樣品注射體積為1μL，不分流進(jìn)樣，氦氣（純度99.999 %）為載氣，氦氣流速為1 mL/min。柱升溫程序：3 ℃/min從40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升至250 ℃，保持8 min。連接桿溫度為230 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，離子源溫度為250 ℃。質(zhì)譜采用電子源電離轟擊，掃描范圍為33～450 u，掃描速率0.2 次/s，電子源電壓為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，檢測(cè)器電壓為350 V。

定性定量分析：采用樣品質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜對(duì)比、樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，結(jié)合NIST 17 譜庫(kù)查詢進(jìn)行香氣化合物的定性分析，采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行香氣化合物的定量分析。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用五點(diǎn)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 感官量化評(píng)價(jià)

葡萄酒感官量化分析采用Tao 等[17]的方法，略作修改。評(píng)價(jià)小組由30名經(jīng)培訓(xùn)人員組成，品嘗前進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)味感物質(zhì)和香氣物質(zhì)訓(xùn)練。品嘗時(shí)一次分析3 款酒樣，取適量酒樣于品嘗杯中，以其色澤、氣味、口感為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用5 點(diǎn)標(biāo)度法對(duì)感知的感官特征量化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較（Duncan 新復(fù)極差法，P ＜0.05），利用Origin pro 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工貴腐果實(shí)的制備

人工接種侵染的美樂(lè)葡萄果實(shí)在感染初期果面發(fā)病不明顯，果梗上可見少量菌絲（圖1），感染中期部分果實(shí)表面產(chǎn)生菌絲，感染后期大部分果穗感染明顯，果實(shí)表面布滿菌絲和孢子。經(jīng)烘箱40 ℃處理后，果穗明顯皺縮，體積變小。

圖1 人工接種后葡萄果實(shí)的貴腐化過(guò)程

2.2 不同桃紅貴腐葡萄酒的基礎(chǔ)理化指標(biāo)

理化指標(biāo)是評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量的基本依據(jù)，受葡萄品種、生長(zhǎng)環(huán)境、葡萄酒釀造及陳釀工藝的影響[18]，主要包括酒精度、總糖、揮發(fā)酸等。從所得結(jié)果來(lái)看（表1），三款酒樣的乙醇含量為13.07%vol～14.14%vol，在乙醇和密度方面沒有明顯差異；自然貴腐酒和人工貴腐酒的基本理化指標(biāo)較為接近。從自然貴腐酒與人工貴腐酒的對(duì)比來(lái)看，自然貴腐酒在可滴定酸含量上高于人工貴腐酒，其余指標(biāo)上兩者之間沒有明顯差異。

表1 不同酒樣的基礎(chǔ)理化指標(biāo)

前人研究發(fā)現(xiàn)成熟的葡萄果實(shí)在被灰霉菌侵染后，由于灰霉菌的生長(zhǎng)代謝作用會(huì)使得葡萄果實(shí)的成分發(fā)生變化，其中葡萄糖酸含量會(huì)升高，酒石酸含量會(huì)下降[13，19]，但也有學(xué)者[20]研究發(fā)現(xiàn)灰霉菌感染對(duì)葡萄酒中酒石酸和蘋果酸的含量沒有顯著影響。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看（表2），自然貴腐酒和人工貴腐酒的葡萄糖酸含量顯著高于對(duì)照酒樣，自然貴腐酒的酒石酸含量顯著高于對(duì)照酒樣。

表2 不同酒樣中酸的含量

酒樣糖含量如表3 所示，自然貴腐酒與人工貴腐酒之間無(wú)明顯差異，與對(duì)照酒樣之間差異顯著。在總糖含量上，美樂(lè)甜紅葡萄酒（對(duì)照）達(dá)到了半甜葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)，自然貴腐酒與人工貴腐酒均達(dá)到了甜型葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同酒樣中糖的含量 (g/L)

2.3 不同桃紅貴腐葡萄酒的香氣組分分析

葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的分析在葡萄酒質(zhì)量和特征方面起到了決定性作用[21]。從單個(gè)香氣成分實(shí)際氣味貢獻(xiàn)來(lái)看，用氣味活度值（odour activity value，OAV）表示葡萄酒中各香氣化合物對(duì)主體香氣成分的貢獻(xiàn)是目前使用較多的方法，當(dāng)OAV＞1 時(shí)，該香氣化合物對(duì)葡萄酒香氣起直接作用，當(dāng)OAV＜1 時(shí)，嗅覺器官對(duì)此化合物的氣味無(wú)明顯感覺[22-23]。

Blanco-ulate 等[24]研究發(fā)現(xiàn)貴腐菌的感染會(huì)對(duì)賽美容葡萄果實(shí)的發(fā)育及代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響，會(huì)使葡萄果實(shí)的花色苷、萜烯類物質(zhì)及脂肪酸香氣前體物質(zhì)的生物合成明顯升高。從所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在酯類物質(zhì)方面，自然貴腐酒和人工貴腐酒中的乙酸乙酯含量高于美樂(lè)甜紅葡萄酒，這與陶永勝等[12]的研究結(jié)果相符，可能是由于灰霉菌的侵染使得葡萄汁中乙酸濃度較高，最終使葡萄酒中乙酸乙酯含量較高；在醇類物質(zhì)方面，三個(gè)酒樣中1-戊醇、苯乙醇和3-甲硫基丙醇在含量方面差異不顯著，而苯乙醇被認(rèn)為是美樂(lè)葡萄品種的特征香氣物質(zhì)[18]；在酸類物質(zhì)方面，人工貴腐酒在醋酸含量上低于自然貴腐酒，在辛酸含量上顯著高于自然貴腐酒，使得人工貴腐酒與自然貴腐酒相比醋味較淡、澀味稍重，在其他香氣成分上，自然貴腐酒中的壬醛含量高于另外兩個(gè)酒樣，這是因?yàn)橄啾扔诖碱惢蛘啧ヮ愇镔|(zhì)，醛類物質(zhì)在植物抵抗真菌的侵染方面發(fā)揮重要作用[25]，導(dǎo)致灰霉菌侵染后的葡萄果實(shí)釀造的葡萄酒中醛類物質(zhì)增多。

在關(guān)于貴腐酒香氣物質(zhì)的研究中，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中硫醇的含量對(duì)貴腐酒的香氣有一定影響[7]，3-巰基己醇主要貢獻(xiàn)酒中的柑橘味[26]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)δ-內(nèi)酯類和γ-內(nèi)酯類對(duì)貴腐酒香氣有顯著影響[27-28]。Genovese等[29]和Sivertsen等[9]研究發(fā)現(xiàn)貴腐酒在蜂蜜、杏仁、杏和成熟花朵等香氣描述詞匯上得分更高，而蜂蜜、干無(wú)花果和杏仁等香氣被認(rèn)為是貴腐甜酒的典型香氣。在貴腐葡萄酒的特征香氣物質(zhì)方面，本研究所得到的人工貴腐酒與自然貴腐酒雖然存在差異，但從所得結(jié)果來(lái)看（表4），人工貴腐酒具有花香、檸檬味、苦杏仁味等和貴腐葡萄酒相關(guān)的香氣特征[6]。

表4 不同酒樣的香氣分析

2.4 不同桃紅貴腐酒的感官品鑒

葡萄酒的感官評(píng)價(jià)是指通過(guò)眼、口、鼻、舌等感覺器官?gòu)念伾?、氣味、口感等方面?duì)葡萄酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[39]。將三個(gè)酒樣的感官品鑒結(jié)果進(jìn)行PCA 分析（圖2），發(fā)現(xiàn)第一主成分貢獻(xiàn)率為38.7 %，第二成分貢獻(xiàn)率為31.9 %，累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.6 %。通過(guò)主成分分析圖可以發(fā)現(xiàn)自然貴腐酒與人工貴腐酒之間差異較小，主要為蜂蜜、杏仁、烤面包以及山楂花等香氣，而美樂(lè)甜紅葡萄酒（對(duì)照）與前兩個(gè)酒樣之間存在著顯著差異，表明人工貴腐酒的香氣更接近于自然貴腐酒，具有一定程度的貴腐葡萄酒香氣特征。

圖2 不同酒樣的感官品鑒主成分分析

3 結(jié)論

本研究借鑒前人的研究成果，采用人工離體接種灰霉菌的方式，結(jié)合桃紅葡萄酒和貴腐葡萄酒的釀造工藝，釀造得到桃紅貴腐葡萄酒。所得的人工貴腐酒各項(xiàng)理化指標(biāo)更接近于自然貴腐葡萄酒，且人工貴腐酒和自然貴腐酒在糖含量上均達(dá)到了甜型葡萄酒的標(biāo)準(zhǔn)；在香氣成分和感官品鑒上，人工貴腐酒接近于自然貴腐酒，具有花香、杏仁、檸檬、奶油以及山楂花等香氣。本研究中的人工桃紅貴腐葡萄酒兼具了桃紅葡萄酒的活躍果香與貴腐葡萄酒的甜潤(rùn)口感和濃郁香氣，表明了人工桃紅貴腐葡萄酒釀造技術(shù)具有可行性。