劉雪峰 袁項(xiàng)成 向蘋葦 馬曉麗

摘要? 在柑橘生長后期、采摘后運(yùn)輸和貯藏期間爛果現(xiàn)象十分普遍，造成了果實(shí)品質(zhì)的惡化和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。通過對近年來國內(nèi)外有關(guān)芽孢柑橘防控柑橘采后病害的研究報(bào)道進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌防控柑橘采后病害的研究主要集中在綠霉病和青霉病，酸腐病和炭疽病方面也有少量報(bào)道；拮抗菌種主要包括枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，其他芽孢桿菌種類較少；生防機(jī)制主要涉及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生、對營養(yǎng)物質(zhì)和空間的競爭以及誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。柑橘采后病害生防芽孢桿菌的資源發(fā)掘、作用機(jī)制均有待深入研究。

關(guān)鍵詞? 芽孢桿菌；生物防控；柑橘；采后病害

中圖分類號? TS255.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ?文章編號? 0517-6611（2024）07-0010-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.003

Research Progress on Controlling Citrus Postharvest Diseases by Bacillus

LIU Xue feng， YUAN Xiang cheng， XIANG Ping wei et al（Chongqing Three Gorges Academy of Agricultural Sciences， Wanzhou， Chongqing 404155）

Abstract? It is very common for citrus to rot during the late growth period， post harvest transportation and storage period， resulting in the deterioration of fruit quality and serious economic losses. Bacillus has broadspectrum antibacterial activity and has been widely used in agricultural production. The research reports on the prevention and control of citrus postharvest diseases by spore citrus at home and abroad in recent years were analyzed. It was found that the research on controlling citrus postharvest diseases by Bacillus mainly focused on green mold and penicillium， and there were also a few reports on acid rot and anthrax;Antagonistic strains mainly include Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens， and other Bacillus species are less;Biocontrol mechanisms mainly involve the production of antibacterial substances， competition for nutrients and space， and induction of systemic resistance. The resource exploration and action mechanism of Bacillus spp. against citrus postharvest diseases need to be further studied.

Key words? Bacillus;Biological prevention and control;Citrus;Postharvest diseases

柑橘是世界上種植最廣泛的果樹之一。目前，它已在超過137個(gè)國家進(jìn)行了商業(yè)種植，年產(chǎn)量超過1.4億t［1］。由于采后保鮮、預(yù)冷、分級、包裝與處理不當(dāng)，冷鏈設(shè)施不足等因素，我國柑橘采后損失率為20%～30%，而在發(fā)達(dá)國家則為10%～20%［2］。柑橘采后病害分為非傳染性病害和傳染性病害，前者主要是由惡劣的環(huán)境條件或營養(yǎng)不良等因素導(dǎo)致果實(shí)畸形、壞死或腐爛，相對較好防治；后者主要因果實(shí)受到病原菌侵染造成，也是導(dǎo)致柑橘采后損失的主要原因［3］，為當(dāng)前防治重點(diǎn)。傳染性病害有很多種，包括指狀青霉引起的綠霉?。?］、意大利青霉引起的青霉?。?］、白地霉引起的酸腐?。?］、鏈格孢引起的黑腐?。?］、柑橘間座殼引起的褐色蒂腐?。?］、褐腐疫霉引起的柑橘褐腐?。?］、黑色蒂腐病菌引起的黑色蒂腐?。?0］、炭疽病菌引起的柑橘炭疽?。?1］、灰葡萄孢引起的灰霉?。?2］等。其中，綠霉病和青霉病是柑橘采后最易發(fā)生的病害，柑橘采后90%的腐爛由二者引起［13］，可使柑橘損失率達(dá)30%～50%［14］。

迄今為止，化學(xué)藥劑防治是柑橘采后病害防控中應(yīng)用最廣泛和最有效的技術(shù)手段?；瘜W(xué)殺菌劑是一種作用機(jī)理明確、能夠抑制或者殺死病原菌的化學(xué)合成物，其具有高效、速效、使用方便、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)。但使用不當(dāng)可對植物產(chǎn)生藥害，引起人畜中毒，殺傷有益微生物，造成環(huán)境污染，導(dǎo) 致病原菌產(chǎn)生抗藥性等［15］。

生物防治是植物采后病害防控的另一條途徑。生防菌劑被認(rèn)為是最有希望替代化學(xué)藥劑的產(chǎn)品之一［16］。在柑橘生產(chǎn)中，生防菌如芽孢桿菌、伯克霍爾德氏菌、鏈霉菌被認(rèn)為是防控柑橘病害的重要工具［17-19］。芽孢桿菌是植物根際和葉際的天然生物，其可以形成內(nèi)孢子并產(chǎn)生各種有價(jià)值的代謝物，如抗生素、酶、維生素和次生代謝物，可以抗菌或促進(jìn)植物生長，同時(shí)有利于生態(tài)環(huán)境［20］。其作為一類典型的生防菌，在柑橘上被廣泛研究和報(bào)道。例如，枯草芽孢桿菌及其代謝物被用來控制柑橘的綠霉病、青霉病、炭疽?。?1-23］。解淀粉芽孢桿菌DH-4對柑橘果實(shí)采后青霉菌、綠霉菌也具有顯著的抑致活性［24］。此外，枯草芽孢桿菌還被認(rèn)為具有防控柑橘潰瘍病的潛力［25］。

采后病害對柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。芽孢桿菌種類多、分布廣，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［26-27］，無毒、綠色、安全和無抗藥性等特點(diǎn)使其有潛力成為理想的生防菌。該研究概述芽孢桿菌作為防控柑橘采后病害生防菌的研究進(jìn)展，以期為柑橘采后病害新型生防菌劑研發(fā)或新型防控技術(shù)的集成提供參考。

1 生防芽孢桿菌概述

芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強(qiáng)，耐熱、耐酸堿、理化性質(zhì)穩(wěn)定，抑菌譜廣泛［28］。許多已知的芽孢桿菌已被用于防控植物病害，包括解淀粉芽孢桿菌［29］、貝萊斯芽孢桿菌［30］、枯草芽孢桿菌［31］、巨大芽孢桿菌［32］、蠟樣芽孢桿菌［33］、蘇云金芽孢桿菌［34］、短小芽孢桿菌［35］、地衣芽孢桿菌［36］、多粘類芽孢桿菌［37］、萎縮芽孢桿菌［38］、短短芽孢桿菌［39］、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌［40］等。

2 芽孢桿菌防控柑橘采后病害種類

2.1 綠霉病

由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的柑橘綠霉病是柑橘采后貯藏及運(yùn)輸過程中最為嚴(yán)重的病害之一［41］。其常通過各種果實(shí)傷口、果蒂切口及蒂緣組織等創(chuàng)口進(jìn)行侵染［42］。國外有學(xué)者利用枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌防控檸檬果實(shí)上的綠霉菌，結(jié)果顯示均能抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)［43］?？莶菅挎邨U菌內(nèi)孢子及其無細(xì)胞培養(yǎng)上清液（含抗真菌代謝物）對綠霉病菌均有較強(qiáng)的拮抗活性［44］。此外，短小芽孢桿菌和芽孢桿菌W176也可以抑制柑橘果實(shí)的綠霉病菌［45］。在國內(nèi)，2000年，范青等［46］發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠抑制柑橘青、綠霉病。此后，張靜等［47］發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌PY-1發(fā)酵液、菌懸液、無菌發(fā)酵液、熱處理發(fā)酵液對柑橘綠霉病的抑制作用依次減弱。2013年，安國棟等［48］從根際土壤中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌，對柑橘綠霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性。另一項(xiàng)研究中，采用酸沉淀法提取解淀粉芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)，得到的抗菌粗提物對柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)抑制率為9692%［49］。俞坤輝［50］發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌Y25發(fā)酵液對綠霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用。從廣東湛江海域的海底淤泥中分離得到的解淀粉芽孢桿菌HY 2-1，具有耐受高鹽的特性，且其發(fā)酵上清液對柑橘綠霉病菌指狀青霉的抑制穩(wěn)定性較好［51］。在對沙糖橘的活體試驗(yàn)中，通過解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液、菌懸液及發(fā)酵濾液處理，柑橘綠霉病的發(fā)生率均低于20%，病斑直徑均在10 mm以下［52］。

2.2 青霉病

柑橘青霉病主要由意大利青霉（Penicillium italicum）引起［5］。果實(shí)感染后的表征與綠霉病相似，不同在于綠霉病覆蓋的菌絲層與分生孢子霉層更厚，且綠霉病的分生孢子通常呈現(xiàn)深綠色，而青霉病的分生孢子呈現(xiàn)藍(lán)綠色。同時(shí)，綠霉病比青霉病的發(fā)病速率更快且病變更為嚴(yán)重。2001年，秦文等［53］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌B4菌株對柑橘青霉病具有良好的防治效果。此后，有學(xué)者研究了溫度對芽孢桿菌控制柑橘青霉病效果的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌磁場誘變株在10 ℃時(shí)對青霉病的防效要高于20 ℃時(shí)的防效，說明低溫抑制了病原菌的生長［54］。而在柑橘果皮的內(nèi)生菌中，枯草芽孢桿菌對柑橘青霉病菌的抑制作用最為明顯［55］。涂起紅［56］以新余蜜橘和南豐蜜橘為試驗(yàn)材料，篩選到了對柑橘青霉病和綠霉病抑制作用強(qiáng)的拮抗菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及基因等多重鑒定，確定該菌株屬類芽孢桿菌。另一項(xiàng)研究也表明，類芽孢桿菌YS-1代謝產(chǎn)物粗提液可抑制意大利青霉分生孢子萌發(fā)，且濃度越高，抑制能力越強(qiáng)［57］。

2.3 酸腐病

由柑橘白地霉（Geotrichum citri-aurantii）侵染柑橘引起的酸腐病是僅次于柑橘果實(shí)青、綠霉病的一種典型的柑橘采后病害，對全球所有柑橘品種均具有不同程度的危害，造成柑橘產(chǎn)業(yè)的損失及環(huán)境的潛在污染［58］?？莶菅挎邨U菌AF 1被用來控制檸檬酸腐病，其全細(xì)胞上清液效果明顯高于β-1，4-n-乙酰氨基葡萄糖酶［59］。李登勇等［60］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌對白地霉的抑菌率為82.58%。當(dāng)柑橘酸腐病發(fā)病率為96.67%時(shí)，接種8～10 CFU/mL生防菌能有效降低柑橘酸腐病發(fā)病率至13.89%。多項(xiàng)研究證實(shí)，解淀粉芽孢桿菌對柑橘綠霉菌、指狀青霉、意大利青霉和柑橘酸腐菌均有明顯的抑制作用［61-62］。

2.4 炭疽病

由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）引起的柑橘炭疽病，其在柑橘全生育期均可發(fā)病，尤以為害果實(shí)引起腐爛等造成的損失最大［11］。2010年，汪茜等［63］從辣椒根際土壤中分離出了一株短短芽孢桿菌，其對柑橘炭疽病的防治效果明顯，處理后第20天防效仍達(dá)64.9%。第二年，該團(tuán)隊(duì)又從廣西藥用植物園雞血藤的根際土壤中分離得到了對柑橘炭疽病菌具有拮抗活性的枯草芽孢桿菌菌株［64］。

綜上，目前芽孢桿菌防控柑橘采后病害種類主要集中在綠霉病和青霉病，酸腐病和炭疽病方面也有少量報(bào)道，而對于蒂腐病、黑腐病等其他采后病害的防控研究未見報(bào)道，這可能與綠霉病和青霉病是柑橘采后最易發(fā)生的病害有關(guān)。此外，現(xiàn)有的研究主要集中在利用枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌防控柑橘采后病害，其他種類芽孢桿菌是否對柑橘采后病害防控有益值得進(jìn)一步研究探討。

3 作用機(jī)制

隨著生物防控越來越受重視，生防微生物被廣泛發(fā)掘，其作用機(jī)制也已被逐步解析。目前，生防微生物作用機(jī)制主要包括抗菌物質(zhì)或分解酶的產(chǎn)生、營養(yǎng)和空間競爭、寄生、信號干擾和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。對于芽孢桿菌屬，合成抗菌物質(zhì)是其最重要的生物防治機(jī)制之一［65］，其次是對營養(yǎng)和空間方面的競爭［66］，此外還可以通過間接誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性［67］。

3.1 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)

已有研究報(bào)道了芽孢桿菌屬可以生物合成2種抗菌物質(zhì)：一種是細(xì)菌素，由核糖體合成；另一種是脂肽，由非核糖體合成［68］。一般情況下，枯草芽孢桿菌中4%～5%的基因組專門用于合成20多種結(jié)構(gòu)多樣的抗菌物質(zhì)［69］。脂肽受到廣泛的關(guān)注，可能是由于其理想的特性，如顯著的抗菌活性，低毒、抗病毒和抗腫瘤活性，生物降解性和高溫穩(wěn)定性［70］。此外，脂肽被認(rèn)為比化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境更安全［71］。

環(huán)脂肽（CLPs）是芽孢桿菌合成的主要化合物，主要包括芬枯草菌素、伊枯草菌素A和表面活性素。芬枯草菌素對多種真菌具有拮抗活性，但對細(xì)菌和酵母無抑制作用。表面活性素具有很強(qiáng)的抗菌作用［69］。表面活性素和芬枯草菌素是植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)因子［23，72］。據(jù)報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌霉素L、芬枯草菌素、表面活性素和伊枯草菌素的共同生產(chǎn)者［73-74］。研究人員在解淀粉桿菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)芽孢桿菌霉素D和大乳蛋白家族成員的3個(gè)同源物［75］。枯草芽孢桿菌也可以產(chǎn)生多種抗菌化合物，如輔脂肪酶［67］，細(xì)胞外酶，β-1，3-葡聚糖酶［76］和揮發(fā)性化合物［61］。

研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬w176的無細(xì)胞上清液含有的抗霉枯草菌素、bacillaene、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和表面活性素等抗菌化合物可以引起綠霉病原菌細(xì)胞空泡化［45］。此外，從類芽孢桿菌YS-1發(fā)酵物分離純化得到的胞嘧啶對意大利青霉具有較強(qiáng)的抑制活性［77］。解淀粉芽孢桿菌HY2-1的發(fā)酵上清液含有拮抗柑橘綠霉病菌的活性物質(zhì)，但是活性化合物的種類和數(shù)量還需進(jìn)一步的分離、鑒定［51］。解淀粉芽孢桿菌RY3粗提物使綠霉病菌細(xì)胞膜遭受破壞，透性增大，胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，胞內(nèi)蛋白和糖透過細(xì)胞膜大量滲漏［49］。范青等［46］認(rèn)為，枯草芽孢桿菌B-912抑制柑橘青、綠霉病的作用機(jī)理主要是產(chǎn)生抗菌素。地衣芽孢桿菌W10產(chǎn)生的抗菌蛋白對柑橘青霉病菌菌絲形態(tài)和生長都有明顯的破壞與抑制作用［78］。

雖然芽孢桿菌屬的抗菌物質(zhì)表現(xiàn)出顯著的生物活性，但其在某些系統(tǒng)中的生物防治機(jī)制尚未明確闡明?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗生素在體內(nèi)工作良好，但在柑橘果實(shí)上沒有檢測到［44］。這表明，抗菌作用可能并不代表枯草芽孢桿菌在果實(shí)中的全部拮抗活性。因此，必須考慮果實(shí)病變部位的競爭因素。此外，病原菌耐藥性不容忽視，這可能成為未來使用生防微生物的障礙［79］。

3.2 競爭營養(yǎng)與空間

微生物之間的相互作用通常涉及對營養(yǎng)物質(zhì)和空間的競爭，這與它們的生長和發(fā)育有關(guān)。對營養(yǎng)物質(zhì)和空間的競爭是最重要的生物防治機(jī)制之一，它是酵母和細(xì)菌的普遍作用模式［80］。當(dāng)在果實(shí)損傷部位爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和空間時(shí)，生防微生物需要快速繁殖，并比病原菌更好地適應(yīng)環(huán)境，即使是在使用低濃度的營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)也是如此［81］。因此，生防微生物通過耗盡可用的營養(yǎng)物質(zhì)，來阻止病原菌利用這些營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖［82］。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7在接種24 h時(shí)可定植到臍橙表皮傷口處，通過搶占空間和營養(yǎng)來抑制指狀青霉的生長［83］?？莶菅挎邨U菌BS-Z菌株分泌的抗菌物質(zhì)以及與青、綠霉病原菌競爭營養(yǎng)和空間都是其生防機(jī)制的組成部分，此外，其能夠促進(jìn)過氧化物酶、超氧化物歧化酶的分泌，有效地降低病原菌引起的丙二醛含量升高，提高柑橘自身的抗病能力［84］。類芽孢桿菌YS-1的菌懸液和上清液均能抑制柑橘青、綠霉病菌孢子的萌發(fā)，其抑菌機(jī)制為營養(yǎng)和空間競爭，分泌的抗菌物質(zhì)起主要作用，菌體本身也有抑菌作用［56］。

3.3 誘導(dǎo)抗性

誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）是指誘導(dǎo)植物宿主產(chǎn)生抗性反應(yīng)的一種機(jī)制。植物可能在不同的植物系統(tǒng)中啟動(dòng)靶基因的表達(dá)并激活靶化學(xué)物質(zhì)，以抵御病原體感染［85-86］。防御途徑涉及許多生物化學(xué)反應(yīng)，以及病原相關(guān)蛋白（PRs）的產(chǎn)生和組織結(jié)構(gòu)的變化。病原相關(guān)蛋白在植物被病原菌感染的初始反應(yīng)階段合成，可以保護(hù)植物免受病原菌的攻擊。夏橙果實(shí)受到綠霉菌侵染時(shí)，枯草芽孢桿菌ABS-S14的環(huán)脂肽誘導(dǎo)了相關(guān)防御基因的表達(dá)，芬枯草菌素增強(qiáng)了葡聚糖酶（GLU）的轉(zhuǎn)錄［87］。研究表明，枯草芽孢桿菌ABS-S14自身及其粗提物和殼聚糖可誘導(dǎo)受感染的柑橘果實(shí)中過氧化物酶（POX）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，從而共同抑制綠霉?。?3］。芽孢桿菌NCPSJ7和指狀青霉復(fù)合處理明顯降低了臍橙的發(fā)病率和病斑直徑，提高了果實(shí)中多酚氧化酶、過氧化物酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力，促進(jìn)果實(shí)的總酚含量、總黃酮含量、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清能力和還原力的增加［83］。

綜上所述，目前發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌防控柑橘采后病害的生防機(jī)制主要涉及抗菌物質(zhì)（如環(huán)脂肽和揮發(fā)性有機(jī)物）的產(chǎn)生、對營養(yǎng)物質(zhì)和空間的競爭以及誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。林福呈等［88］曾通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌吸附在立枯絲核菌的菌絲上，將病原菌菌絲溶解。表明枯草芽孢桿菌具有寄生或溶解病原菌的能力，然而在芽孢桿菌抑制柑橘采后病害病原菌的過程中是否存在該作用機(jī)制尚未見到公開報(bào)道。因此，將芽孢桿菌拮抗菌和柑橘采后病害病原菌置于體內(nèi)或體外密切接觸的策略，可能有助于是否存在寄生或溶解作用機(jī)制的研究。

4 結(jié)語和展望

枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等芽孢桿菌屬拮抗菌可以通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等防控柑橘青、綠霉病等采后病害。生防芽孢桿菌制劑的研發(fā)與應(yīng)用在柑橘采后病害防控領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，單獨(dú)使用生防芽孢桿菌并不能實(shí)現(xiàn)對柑橘采后病害的完全控制。但是，芽孢桿菌與其他生物、化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的策略為控制柑橘采后病害提供了潛力。解淀粉芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌與熱水和碳酸氫鈉對青霉、綠霉和酸腐病有較強(qiáng)的抑制作用，解淀粉芽孢桿菌加茶皂苷的防控效果超過90%［89-90］。枯草芽孢桿菌與季也蒙畢赤酵母組合完全抑制綠霉菌而不損害柑橘果實(shí)品質(zhì)［91］。鹽被發(fā)現(xiàn)是控制柑橘采后病害的一種有用的田間防控策略，在果實(shí)采前和采后同時(shí)應(yīng)用更有效［92］。因此，可以將鹽和生防芽孢桿菌組合納入控制柑橘采后病害的綜合方法。此外，有必要開展生防芽孢桿菌與新型抑菌物質(zhì)的組合、不同種類生防芽孢桿菌之間的組合防控柑橘采后病害的研究。

生防芽孢桿菌菌體及其代謝產(chǎn)物對環(huán)境條件要求較高，這也是目前商業(yè)化的產(chǎn)品較少以及生產(chǎn)應(yīng)用效果不明顯的重要原因。因此，基于基因組學(xué)、代謝組學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)深入發(fā)掘具有廣譜抗菌活性且生存能力強(qiáng)的生防菌株，同時(shí)系統(tǒng)解析生防芽孢桿菌的作用機(jī)理等工作應(yīng)作為未來研究重點(diǎn)。

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基金項(xiàng)目?? 國家重大水利工程建設(shè)基金項(xiàng)目（5001012022FA00001）。

作者簡介?? 劉雪峰（1990—），男，河南商丘人，助理研究員，碩士，從事果樹學(xué)研究。

通信作者，助理研究員，碩士，從事果樹學(xué)研究。