姜冰

摘要：本實驗室前期從大連灣地區(qū)健康的仿刺參養(yǎng)殖池塘沉積物中分離出兩株芽孢桿菌即B6和B7。首先，通過分析二者的生長特性發(fā)現(xiàn)，B6和B7的最適生長溫度為15～35 ℃；最適pH范圍為6～8；最適鹽度為3%～5%。 菌株產(chǎn)酶特性檢測結果表明，B6和B7均可產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶， B7產(chǎn)脂肪酶。將兩種菌懸液投喂仿刺參后發(fā)現(xiàn)，B6和B7可有效提高仿刺參腸道內(nèi)的消化酶活性以及體腔液中多種非特異性免疫酶活性。本研究結果表明：B6和B7可作為益生菌劑的基礎菌株添加至仿刺參生長環(huán)境中，并且對仿刺參的消化及免疫功能具有正向刺激作用。

關鍵詞：芽孢桿菌；仿刺參；消化酶；非特異性免疫酶活性

仿刺參（Apostichopus japonicus）營養(yǎng)豐富，具有較高的藥用及食用價值，是目前我國遼寧沿海養(yǎng)殖范圍最廣的經(jīng)濟品種之一[1-2]。近年來，養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴張，養(yǎng)殖密度過高，仿刺參相關病害問題日趨凸顯，極大制約了其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康、穩(wěn)定的發(fā)展[3]。近年來，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用越來越多。益生菌的應用抑制病原，激活免疫，從而減少疾病的發(fā)生；益生菌可以作為補充營養(yǎng)成分，促進生長。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣使用益生菌，有利于保障遼寧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[4]。

芽孢桿菌，是具有芽孢的好氧革蘭氏陽性菌，具有耐酸、耐鹽、耐高溫和可分泌多種能降解有機物的酶類（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）等特點，有助動物對飼料的消化，增強動物的免疫力，因此現(xiàn)今常將其作為一種益生菌劑添加至動物飼料以及養(yǎng)殖環(huán)境中[5-6]。Kozasa等[7]將從土壤中分離的芽孢桿菌投喂鰻鱺，發(fā)現(xiàn)該菌可有效提高鰻鱺對弧菌的抵抗能力，增強其抗病性；除此之外，袁豐華等[8]在尖吻鱸飼料中添加不同量的凝結芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌對尖吻鱸的生長有一定的促進作用，并可以影響其肝蛋白酶和胃淀粉酶的活性。目前應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領域中的益生芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等，且在魚蝦養(yǎng)殖中的應用較為常見，在仿刺參養(yǎng)殖過程中卻少有報道，更多研究亟待深入[9]。本實驗室前期自大連地區(qū)健康仿刺參養(yǎng)殖池塘底泥中篩選并鑒定到兩株芽孢桿菌，分別命名為B6和B7，通過分析二者的生長特性，產(chǎn)酶特性以及對仿刺參消化酶和非特異性免疫酶活性的影響，探討二者作為仿刺參益生菌種資源的可行性，為芽孢桿菌在仿刺參養(yǎng)殖過程中的應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種本研究中使用的芽孢桿菌株B6和B7，來自遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院菌種保藏室，從大連灣地區(qū)的健康仿刺參養(yǎng)殖池塘底泥中分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基

2216E固體以及液體培養(yǎng)基：采購于青島海博生物科技有限公司；

LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，NaOH調(diào)pH至7.0，121 ℃、20 min高壓滅菌。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（W/L）：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，淀粉5 g，瓊脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL純凈水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

脫脂牛奶培養(yǎng)基（W/L）：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，脫脂奶粉 5 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，1 000 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min后，均勻倒入平板中備用。

羅丹明B橄欖油瓊脂培養(yǎng)基（W/L）：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min，向滅菌后培養(yǎng)基中加入31.25 mL橄欖油和10 mL羅丹明B溶液（ 1 g /L），經(jīng)磁力攪拌器劇烈攪拌后，靜置幾分鐘，均勻倒入平板中備用。

1.1.3實驗儀器酶標儀，潔凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床，熒光顯微鏡，離心機。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的生長特性分析將B6和B7菌株進行活化后，分別按照5%的接種量轉接至100 mL的LB培養(yǎng)基中，不同溫度、鹽度和pH條件下對其進行震蕩培養(yǎng)，每隔三小時取一次樣，利用分光光度計測定菌液在660 nm處的吸光度值，并繪制菌株的生長曲線。實驗溫度設定為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃五個梯度，鹽度設定為30‰、50‰、75‰、100‰和125‰五個梯度，pH設定為6、6.5、7、8和9五個梯度。

1.2.2菌株的產(chǎn)酶特性分析通過盧革氏碘液法測定考察菌株產(chǎn)淀粉酶特性；通過脫脂牛奶法考察菌株的產(chǎn)蛋白酶特性；通過羅丹明B橄欖油法考察菌株產(chǎn)脂肪酶特性[10]。

1.2.3實驗設計與管理試驗于遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院苗室進行。選取規(guī)格相近（約13 g）、生長環(huán)境相似的健康仿刺參，在實驗室暫養(yǎng)一周后，分別飼養(yǎng)于裝有50 L水體的藍色水槽中，每個水槽中10頭， 4個水槽為一組，其中一組加入芽孢桿菌B6，一組加入芽孢桿菌B7，另外一組作空白對照。試驗階段水溫為15±1 ℃，期間連續(xù)充氣。試驗組，按仿刺參體質(zhì)量的5%投餌并投入終密度為108 cfu/L的菌懸液；對照組只投餌不投喂菌液，每組2個重復。實驗時間設定為28 d。每7 d取樣一次，從實驗組和對照組中隨機抽取5頭仿刺參，充分消毒后，解剖并取其體腔液上清和腸道，置于-80 ℃冷凍保藏待測。

1.2.4仿刺參腸道消化酶的測定選取仿刺參腸道脂肪酶、淀粉酶以及蛋白酶作為消化酶的評價標準。將仿刺參腸道樣品從-80 ℃ 冰箱中取出，于冰上解凍。稱取相同重量腸道樣品置于手動勻漿器中，加入9 倍體積的0.9%氯化鈉溶液，冰浴勻漿。勻漿后的樣品液置于離心管中，4 000 r /min，離心10 min，取上清液待測。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測仿刺參腸道蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶活性，具體測定方法參照產(chǎn)品說明書。

1.2.5仿刺參非特異性免疫酶活性測定仿刺參的非特異性免疫酶選取4個指標作為評價標準，包括：總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、酚氧化酶活性（PO）的活性。

采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測仿刺參體腔總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性，具體測定方法參照產(chǎn)品說明書。其中酚氧化酶的檢測采用多巴絡合物生成法[11]。

2實驗結果

2.1菌株生長特性

菌株的生長隨溫度、鹽度、pH變化曲線如圖1所示。由圖1可知，菌株B6和B7在15～35 ℃范圍內(nèi)均可生長，且長勢良好；二者生長所需的最適pH范圍較為寬泛，菌株B6在pH為6.0～9.0范圍內(nèi)生長較快，于6 h后進入指數(shù)增長期，18 h后進入穩(wěn)定期；菌株B7在pH為6.0～8.0范圍內(nèi)生長較快，而在pH為9時生長相對緩慢，于24 h時才進入指數(shù)增長期，由此得出，二者生長最適pH范圍為6.0～8.0；除此之外，菌株B6在鹽度為30‰～50‰時生長較快，在12 h后進入指數(shù)增長期，而菌株B7在鹽度為30‰～75‰范圍內(nèi)生長較快，于6 h后便進入指數(shù)增長期。

2.2菌株的產(chǎn)酶特性

將芽孢桿菌株B6、B7點種于不同的產(chǎn)酶特征瓊脂平皿，培養(yǎng)48 h后觀察結果。結果顯示：在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，加入盧革氏碘液后，B6、B7菌落周圍變色，說明兩菌株均可產(chǎn)淀粉酶；在脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，兩株菌株的周圍產(chǎn)生透明水圈，說明二菌株都可產(chǎn)蛋白酶；但在羅丹明B瓊脂培養(yǎng)基上在紫外線照射下，B7菌株周圍看到橙色光圈，說明該菌株自身可產(chǎn)生脂肪酶，而在B6菌株周圍未發(fā)現(xiàn)橙黃色熒光圈，說明B6菌株未產(chǎn)生脂肪酶。

2.3菌株對仿刺參腸道消化酶的影響

如圖3所示，菌株B6和B7可以有效提高仿刺參體內(nèi)多種消化酶的活性，其中B6和B7菌株對仿刺參體腸道內(nèi)脂肪酶的活性影響較大，而對淀粉酶的并沒有顯著的刺激作用，而B6菌株對蛋白酶的作用效果優(yōu)于B7菌株，由此初步推斷，益生菌株對仿刺參體內(nèi)酶活的影響可能具有相對特異性。

2.4菌株對仿刺參體腔非特異性免疫酶的影響

如圖4所示，菌株B6和B7對仿刺參體腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均有顯著性的影響，尤其是兩種處理樣品中ACP的活性明顯高于對照組。而菌株B7對AKP、T-SOD以及PO的影響均較B6菌株顯著。從圖中可以看出菌株的投喂對仿刺參的免疫刺激作用均有正向刺激，且B7菌株作用效果優(yōu)于B6。

3討論

微生物生長需要在特定的溫度、鹽度和pH范圍內(nèi)，因而明確菌株的生長特性也是菌株應用的前提和基礎。仿刺參作為一種重要的養(yǎng)殖品種，其生長最適溫度往往不得高于23 ℃，最適鹽度為3%，最適pH范圍為7.9～8.4，在此范圍內(nèi)仿刺參長勢良好。據(jù)此，在篩選對刺參具有益生作用的菌株時，首先應選用生長條件與仿刺參接近的益生菌。通過分析B6和B7的生長特性發(fā)現(xiàn)，二者生長所需的條件較為寬泛，最適溫度為15～35 ℃，最適pH范圍為6～8，最適鹽度為3%～5%，因此兩株菌株可以作為候選益生菌，進行后續(xù)試驗。

芽孢桿菌作為水生益生菌劑中常用的菌種，在其發(fā)酵過程中可產(chǎn)生許多胞外酶如蛋白酶和淀粉酶等[12-13]，因而當把該菌株添加至飼料中可有效提高動物的生產(chǎn)性能。本實驗結果表明：B6和B7均可以產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，且B7自身可產(chǎn)生脂肪酶，因此兩株菌株具有潛在的益生作用。除此之外，將B6和B7菌株添加至仿刺參飼料中發(fā)現(xiàn)，二者可提高仿刺參腸道內(nèi)蛋白酶和脂肪酶的活性，然而對于淀粉酶的活性并沒有顯著影響，尤其是B7菌株雖自身可產(chǎn)生淀粉酶，卻未能有效增強仿刺參體內(nèi)該酶的活性。因此，關于B6和B7菌株對于仿刺參腸道內(nèi)消化酶的影響機制還有待于進一步研究。

除了消化酶之外，本研究發(fā)現(xiàn)兩種芽孢桿菌可以提高刺參體腔液中的多種免疫酶活性。酸性磷酸酶（ACP）是巨噬細胞內(nèi)溶酶體標志酶，是溶酶體的重要組成部分，主要參與吞噬水解機體內(nèi)的異物[14]；堿性磷酸酶（AKP）是生物體內(nèi)的一種重要的調(diào)控酶，在堿性環(huán)境下可催化磷酸單酯水解，參與蛋白質(zhì)的合成等，也是溶酶體酶的重要組成部分[15-16]；總超氧化物歧化酶（T-SOD）能夠有效清除機體代謝過程所產(chǎn)生的超氧根陰離子，與生物的免疫水平密切相關，其活性變化可以作為反映某些海洋生物的機能健康狀況及衡量其免疫狀態(tài)的指標[17]；酚氧化酶（PO）是無脊椎動物的免疫防御中的重要免疫酶，它往往以無活性的免疫酶原形式存在，可將酚催化形成黑色素，而黑色素及中間產(chǎn)物具有抗微生物的活性，所以酚氧化酶對于維持動物體液的無菌性十分重要[18]。綜上可見，上述幾種酶均可以作為評價動物免疫能力的重要指標。本研究結果表明，菌株B6和B7對仿刺參體腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均可產(chǎn)生正向的刺激作用，尤其是對ACP酶活性的影響最為顯著，該結論與近期許多研究結果相符合。朱學芝[19]等用枯草芽孢桿菌投喂凡納濱對蝦后，發(fā)現(xiàn)蝦血中的ACP和AKP的活性顯著升高；駱藝文[20]用添加了0.1%的復合芽孢桿菌制劑的餌料投喂仿刺參后，發(fā)現(xiàn)仿刺參體腔液中的AKP、ACP、T-SOD和PO活性顯著高于對照組，以上結果均與本研究得出的結論相符合。綜上所述，將芽孢桿菌B6和B7作為益生菌劑的基礎菌株添加至刺參飼料中具有可行性，二者可在一定程度上提高刺參體內(nèi)的消化酶及免疫酶活性，更好地增強仿刺參的消化和抗病能力。

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