王媛 劉國英 孔大為 李建斌 金新莉 張玉紅 葛文超 成琳 劉佳璇 劉玉振

(河南省紅十字血液中心，河南 鄭州 450012)

冷沉淀凝血因子(cryoprecipitated antihemophilic factor，CAF)是新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma， FFP)在1℃～6℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的冷不溶解白色沉淀物在1 h 內(nèi)速凍呈固態(tài)的成分血，主要組分是Ⅷ因子、血管性血友病因子、纖維蛋白原(簡稱Fbg)、纖維連接蛋白、Ⅴ因子和ⅩⅢ因子等，在甲型血友病、血管性血友病、先天性或獲得性纖維蛋白原缺乏癥、手術(shù)大出血、嚴(yán)重創(chuàng)傷及彌散性血管內(nèi)凝血等患者治療中取得了明顯的效果，而血液質(zhì)量是保障臨床治療效果的前提，由于CAF 中的Ⅷ因子不穩(wěn)定，其含量與采集時(shí)間、制備方法、速凍溫度、CAF 融化后的儲(chǔ)存等有關(guān)[1-3]。 而CAF 融化后儲(chǔ)存方法國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)差別太大，歐美是室溫保存，我國是冷藏保存，另外，國內(nèi)對(duì)于制備CAF 的原料FFP 報(bào)道較多[4-6]，對(duì)于CAF 融化后儲(chǔ)存溫度及時(shí)間報(bào)道較少[7-8]。 鑒于以上原因，本研究大批量研究CAF 融化后儲(chǔ)存不同的溫度和時(shí)間對(duì)Ⅷ因子和Ⅴ因子的影響，為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)，以保證臨床輸血及時(shí)、有效、安全，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)503298)；質(zhì)控品(批號(hào)507921、507795、 507788)；Ⅷ因子試劑(批號(hào)560832A、560839、 560809、 560801)； Ⅴ因 子 試 劑(批 號(hào)504995A、504990B)； Fbg 試 劑(批 號(hào)565179 、565127、565092A、56571A)；PT 試劑(批號(hào)568064、565798A、565796A)；ATPP 試劑(批號(hào)558665A)；OVBUFFER 緩沖液(批號(hào)569916)；CaCl2溶液(批號(hào)563894A)；清洗液(批號(hào)A2136)，以上均由德國西門子SIEMENS 公司提供。 大容量低溫離心機(jī)(美國西格瑪)；MBF-42 速凍機(jī)(盧森堡多美達(dá))；全自動(dòng)CAF 制備儀(佛山沃塘醫(yī)療科技有限公司)；恒溫?fù)u擺式水浴箱(美國科瑞特CT-4T.6C)；ALS 多層速凍機(jī)(意大利Angelantonilife Science S.r.l 公司，山東威高代理)；CS-2400 全自動(dòng)血凝儀(日本Sysmex 公司)；HSWS-600 電熱恒溫水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；50mL 轉(zhuǎn)移袋(山東威高公司)。

1.2 CAF 制備

1.2.1CAF 制備原料

CAF 的制備原料是FFP，本中心制備CAF 均來源于400 mL 全血，對(duì)全血400 mL 采集時(shí)間＞13 min進(jìn)行標(biāo)識(shí)，不能用于制備FFP，采集后儲(chǔ)存于冷藏環(huán)境中，本站采用ACD-B 抗凝劑(含量100 mL)采血袋，最好在6 h 內(nèi)完成上層血漿分離并速凍(下層紅細(xì)胞加入100 mL MAP 保養(yǎng)液，制成懸浮紅細(xì)胞，保存期由21 d 升為35 d)，從血液采集到完成血漿分離最長時(shí)限不得超過18 h。 應(yīng)當(dāng)將FFP 快速凍結(jié)，建議在1 h 內(nèi)將中心溫度降至-30℃以下。 FFP 在-18℃以下儲(chǔ)存，有效期為1 年。

1.2.2CAF 制備方法

1.2.2.1人工虹吸法

將FFP 袋置于1℃～6℃恒溫?fù)u擺式水浴箱中，另一空袋懸于水浴箱外，位置低于血漿袋，2 袋之間形成一定的高度落差。 血漿融化后，隨時(shí)被虹吸至空袋中，當(dāng)融化至剩下40～50 mL 血漿與沉淀物時(shí)，閉合導(dǎo)管，阻斷虹吸。 轉(zhuǎn)移至空袋的血漿，制成去CAF 的冰凍血漿。 將血漿與沉淀物混合，最終CAF容量控制在53(48～58)mL，制成CAF，宜在制備后1 h 內(nèi)完成速凍，并且1 h 內(nèi)將中心溫度降至-30℃以下。 然后CAF 在-18℃以下儲(chǔ)存，有效期為1 年。

1.2.2.2儀器虹吸法

打開全自動(dòng)制備儀器，提前制冷到設(shè)定1℃～6℃，按“預(yù)溫”按鈕進(jìn)行預(yù)先制冷，若制冷完成，按“啟動(dòng)”鍵開始制備，將FFP 在室溫下放置5 min，待管路軟化后上機(jī)制備，依次把血漿聯(lián)袋放入制備盒中，按下“批量”按鈕(所有袋同時(shí)進(jìn)行稱重)，進(jìn)入第二步操作，把三聯(lián)袋分開，把空袋放入制備盒中，血漿袋放入水浴箱中，軟管卡入夾管閥，按下該位置的確認(rèn)按鈕(稱量空袋重量)，同樣操作其它血袋，如果是三聯(lián)帶，將2 個(gè)空袋都放入制備盒，全部血袋放置完畢后，儀器開始處理。 約30 min，當(dāng)收集CAF 袋子剩余53(48～58)mL 時(shí)(儀器提前按重量進(jìn)行設(shè)定)，軟管卡自動(dòng)卡住，此時(shí)制備完成的位置會(huì)有聲音和燈光提示，按一下提示燈光的按鈕，取出該位置血袋，進(jìn)行熱合離斷CAF 和血漿，宜在制備后1 h 內(nèi)完成速凍，并且在1 h 內(nèi)將中心溫度降至-30℃以下。 在-18℃儲(chǔ)存，有效期為1 年。

1.3 CAF 樣本抽檢

2021 年6 月—2023 年5 月，每月抽檢4袋CAF，并于當(dāng)月完成檢測(cè)，2 年共抽檢96 袋。

1.4 凝血因子檢測(cè)

每月抽檢儲(chǔ)存在-18℃以下的CAF，在37℃水浴箱融化后稱重，對(duì)外觀有輕中度脂血予以標(biāo)記，每袋融化后的CAF 和2 個(gè)50 mL 轉(zhuǎn)移袋用無菌接駁機(jī)分裝成2 袋兩組CAF 各20 mL，1 組放置(4±2)℃(簡稱4℃)冰箱，另1 組放置(22±2)℃(簡稱22℃)電熱恒溫水浴箱中，放置時(shí)間段為0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 各自進(jìn)行無菌取樣2 mL放入試管中，用加樣槍在另1 試管中加入樣品1 mL 和OVBUFFER 緩沖液3 mL 混勻，并及時(shí)在全自動(dòng)血凝儀進(jìn)行Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg 檢測(cè)，打印結(jié)果留存記錄，計(jì)算結(jié)果乘以4。 Ⅷ因子和Ⅴ因子計(jì)量單位均為IU/袋，F(xiàn)bg 計(jì)量單位為mg/袋。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

96 袋CAF 實(shí)驗(yàn)完成后，從其中隨機(jī)選取60 袋無輕中度脂血CAF 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均值t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ⅷ因子含量檢測(cè)結(jié)果

融化后CAF 0h 檢測(cè)Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg的平均值分別為(118.62±52.82)IU/袋、(41.19±10.37)IU/袋、(268.86±89.65)mg/袋，變異系數(shù)分別是44.53%、25.18%、33.34%，其中Ⅷ因子含量變異系數(shù)最大。 融化后CAF 中的Ⅷ因子含量，2 組儲(chǔ)存結(jié)果比較，在4℃24h 及22℃48h，Ⅷ因子含量均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且在22℃儲(chǔ)存，Ⅷ因子衰減速度更慢(表1)。

表1 CAF 融化后貯放不同的溫度及時(shí)間對(duì)Ⅷ因子結(jié)果的影響(IU/袋，n＝60)Table 1 Influence of different storage temperature and time on the results of FactorⅧafter CAF melting (IU/bag， n＝60)

2.2 Ⅴ因子含量檢測(cè)結(jié)果

融化后CAF 中的Ⅴ因子含量，兩組儲(chǔ)存結(jié)果比較，在4℃48h Ⅴ因子含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，22℃48hⅤ因子含量有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且在22℃儲(chǔ)存，Ⅴ因子衰減速度更快(表2)。

表2 CAF 融化后貯放不同的溫度及時(shí)間對(duì)V 因子的影響(IU/袋，n＝60)Table 2 Influence of storage temperature and time on V factor after CAF melting(IU/ bag， n＝60)

2.3 Fbg 含量檢測(cè)結(jié)果

融化后CAF 中的Fbg 含量，兩組儲(chǔ)存結(jié)果比較，各時(shí)間段與0h 含量比對(duì)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明Fbg 是比較穩(wěn)定的凝血因子(表3)。

表3 CAF 融化后貯放不同的溫度及時(shí)間對(duì)Fbg 的影響(mg/袋，n＝60)Table 3 Effects of storage temperature and time on Fbg after melting CAF (mg/ bag， n＝60)

3 討論

CAF 是臨床輸血治療的一種重要血液成分，主要用于預(yù)防和治療出血性疾病。 如何避免融化后CAF 凝血因子下降，《美國AABB 技術(shù)手冊(cè)》規(guī)定融化后的CAF 在20℃～24℃儲(chǔ)存，在開放系統(tǒng)中匯集的，儲(chǔ)存期為4 h，單袋或采用經(jīng)FDA 批準(zhǔn)的無菌接駁裝置匯集的，儲(chǔ)存期為6 h[9]。 《英國輸血服務(wù)指南》規(guī)定CAF 一旦解凍，該成分不得再冷凍，應(yīng)立即使用，如果延遲是不可避免的，在室溫下儲(chǔ)存，并在4 h 內(nèi)使用[10]。 我國對(duì)融化后CAF 的儲(chǔ)存規(guī)定:在2℃～6℃儲(chǔ)存，儲(chǔ)存期為24 h[11]。 CAF的制備原料是FFP，Cardigan 等[12]報(bào)道全血儲(chǔ)存于4℃18～24 h 分離的血漿對(duì)于絕大多數(shù)需要輸注FFP的患者是可以接受的。 Wilsher 等[13]發(fā)現(xiàn)全血儲(chǔ)存于22℃24 h 分離的血漿中Ⅷ因子含量仍符合英國標(biāo)準(zhǔn)。 為了驗(yàn)證CAF 融化后的儲(chǔ)存條件，本研究將CAF 融化后分成2 組，分別放置4℃和22℃儲(chǔ)存，經(jīng)過48 h 放置，檢測(cè)凝血因子的變化。

本研究顯示，60 份融化后的CAF 0 h 檢測(cè)，Ⅷ因子、Ⅴ因子以及Fbg 的平均值分別是(118.62±52.82) IU/袋、(41.19±10.37) IU/袋、(268.86±89.65)mg/袋，變異系數(shù)分別是44.53%、25.18%、33.34%，其中Ⅷ因子含量變異系數(shù)最大，這可能與獻(xiàn)血者血型、性別以及CAF 制備方法等差異相關(guān)[14-15]，由于O 型Ⅷ因子含量最低，《英國輸血服務(wù)指南》7.18 規(guī)定混合輸注CAF，應(yīng)來自O(shè) 型和非O 型CAF 的等量混合，國內(nèi)對(duì)這方面沒有規(guī)定。CAF 中的Ⅷ因子2 種(4℃和22℃)貯放溫度24 h濃度下降率(20.46%和14.39%)低于文獻(xiàn)報(bào)道[16]，可能與本研究標(biāo)本數(shù)量大和去除輕中度脂血樣本等有關(guān)。

表1 顯示，CAF 融化的2 組貯放溫度Ⅷ因子含量均隨貯放時(shí)間而下降。 4℃24 h 和22℃48 h 貯放與0 hⅧ因子含量比對(duì)，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明22℃貯放Ⅷ因子含量衰減率慢于4℃，原因可能是CAF 經(jīng)過37℃融化后，其內(nèi)部溫度高于15℃以上，如果將融化后的CAF 重新放在4℃冰箱儲(chǔ)存，隨著時(shí)間延長超過12 h，CAF 袋內(nèi)溫度逐漸下降到4℃，這時(shí)的溫度又達(dá)到Ⅷ因子重新析出臨界溫度，相當(dāng)于反復(fù)凍融，導(dǎo)致析出的Ⅷ因子聚合體增加，從而使Ⅷ因子含量加速下降，這也驗(yàn)證了歐美國家CAF 融化后不冷藏而采取室溫保存的規(guī)定；另外，如果制備CAF 原料FFP 中的血小板(英國規(guī)定血小板＜60×109/L[17]，我國沒有相關(guān)規(guī)定)含量高，導(dǎo)致CAF 中的血小板濃度也高，過多的血小板在4℃聚集性增加，再加上和Ⅷ因子析出的白色物結(jié)合，激活凝血途徑，導(dǎo)致細(xì)小纖維蛋白微聚物析出增多[18]，從而導(dǎo)致Ⅷ因子含量下降。反觀融化后的CAF 在22℃貯放可以克服上述缺點(diǎn)，阻止了Ⅷ因子析出和血小板聚集，大大延緩了Ⅷ因子含量下降率，因此，本研究CAF 融化后貯放于22℃與美國和英國貯放室溫是接近的，而不是我國目前融化后CAF 在2℃～6℃儲(chǔ)存24 h，因此，建議我國對(duì)融化后的CAF 儲(chǔ)存方法進(jìn)行改進(jìn)，首選儲(chǔ)存4℃，最長儲(chǔ)存時(shí)間不超過12 h，次選儲(chǔ)存22℃，最長儲(chǔ)存時(shí)間不超過24 h。 表2 顯示，融化后的CAF，2 組貯放溫度Ⅴ因子含量均隨貯放時(shí)間而下降，證明Ⅴ因子也是不穩(wěn)定的凝血因子，與文獻(xiàn)報(bào)道有一致的[19]也有不一致的[20]。 但Ⅴ因子下降速率沒有Ⅷ因子明顯，且4℃和22℃貯放24 h與0 hⅤ因子含量比對(duì)，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，當(dāng)超過48 h 2 組貯放才均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4℃貯放Ⅴ因子含量衰減率要慢于22℃，原因是如果將融化后的CAF 重新放在4℃冰箱儲(chǔ)存，CAF 中的Ⅴ因子在4℃時(shí)不會(huì)析出白色物質(zhì)以及微聚物，從而不會(huì)導(dǎo)致Ⅴ因子下降速率增加。 表3顯示，2 種貯放溫度，F(xiàn)bg 48 h 內(nèi)與0 h 含量比對(duì)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明Fbg 是比較穩(wěn)定的凝血因子。

綜上所述，CAF 融化后儲(chǔ)存22℃Ⅷ因子衰減速度比4℃更慢。 CAF 融化后應(yīng)盡快輸注，如果延遲不可避免；若延遲時(shí)間＜12 h，采用4℃保存，若延遲時(shí)間超過12 h＜24 h，采用22℃保存，這兩種保存方法其實(shí)并不矛盾，是由CAF 中的Ⅷ因子在4℃析出白色物質(zhì)這物理特性決定的。 將CAF 融化后由目前國標(biāo)儲(chǔ)存4℃24 h 縮短到12 h；或者由目前歐美標(biāo)準(zhǔn)22℃存放6 h 延長到24 h，這兩種方法目的都是為了減少Ⅷ因子重新析出造成的反復(fù)凍融，從而導(dǎo)致Ⅷ因子失活，為臨床和決策者對(duì)融化后CAF保存提供了理論依據(jù)，既保證了CAF 中的Ⅷ因子活性的安全有效性，又減少了血液資源的浪費(fèi)。