席俊男,馮松松,薛惠元,騰東,陳麗薇

腦卒中是導(dǎo)致中老年人死亡和殘疾的主要原因之一[1]。急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke, AIS)約占腦卒中的70%,具有起病急、發(fā)展迅速及預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。間α胰蛋白酶抑制因子重鏈4(inter alpha trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)主要由肝臟合成并分泌,在血液中被血漿激肽釋放酶切割活化,參與炎性反應(yīng)、免疫及腫瘤等疾病過(guò)程[3-4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),ITIH4在心腦血管疾病中發(fā)揮抗炎效應(yīng),與動(dòng)脈粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān),是評(píng)估主要不良心血管事件的血清標(biāo)志物[5]。髓樣細(xì)胞白血病因子-1(myeloid cell leukemia sequence 1,MCL-1)屬于B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2家族成員,參與維持線粒體外膜的完整性,發(fā)揮抗凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn),腦組織缺血再灌注損傷過(guò)程中MCL-1表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加,是潛在的缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物[7]。目前AIS患者血清ITIH4、MCL-1表達(dá)水平及臨床意義尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)AIS患者血清ITIH4、MCL-1的表達(dá)水平,探討兩者與AIS病情程度及預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2019年7月—2022年7月河南科技大學(xué)附屬黃河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治AIS患者128例(AIS組),男74例,女54例;年齡37～81(63.02±6.53)歲;體質(zhì)量指數(shù)18.47～26.70(23.37±2.19)kg/m2;病程2～72(21.47±6.89)h;均無(wú)明顯誘因;AIS家族史4例;有吸煙史45例;基礎(chǔ)病:高血壓54例,糖尿病36例。另選取同期醫(yī)院體檢的健康者70例為健康對(duì)照組,男40例,女30例;年齡40～78(62.73±5.86)歲;體質(zhì)量指數(shù)18.26～26.57(23.20±2.11)kg/m2;AIS家族史1例;有吸煙史26例;基礎(chǔ)病:高血壓30例,糖尿病15例。2組受試者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、AIS家族史、吸煙史、高血壓史、糖尿病史比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2019-S058),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①所有病例均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南(2018)》制定的AIS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②頭顱MR檢查顯示與臨床癥狀相符合的責(zé)任病灶;③首次發(fā)病或復(fù)發(fā)但既往未遺留明顯后遺癥;④發(fā)病72 h內(nèi)入院;⑤年齡>18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①短暫腦缺血發(fā)作、顱內(nèi)占位、腦出血及腦外傷患者;②合并急慢性腎功能不全,或嚴(yán)重的心肺、肝臟疾病;③合并自身免疫性疾病或惡性腫瘤;④合并血液性疾病;⑤合并神經(jīng)退行性疾病、顱內(nèi)感染性疾病、腸道炎性反應(yīng);⑥發(fā)病前任何原因所致生活不能自理。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清ITIH4、MCL-1檢測(cè):患者入院后次日清晨、健康對(duì)照組體檢時(shí)留取肘靜脈血5 ml,4℃冰箱靜置2 h,離心留取上層血清。采用多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer有限公司,型號(hào)EnVisionXcite)以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清ITIH4(試劑盒購(gòu)自上海臻科生物科技公司,貨號(hào)ZK-3744)、MCL-1(試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技公司,貨號(hào)XY-MCL1-Hu)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成檢測(cè)。

1.3.2 梗死部位及面積測(cè)定:患者入院72 h內(nèi)采用美國(guó) GE 公司 HDXT1.5T磁共振儀測(cè)量顱腦梗死部位(皮質(zhì)、皮質(zhì)下、腦干/小腦),計(jì)算梗死面積。

1.3.3 病情程度評(píng)估:參考美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)[9]對(duì)AIS患者入院24 h病情程度評(píng)估,包含意識(shí)水平檢查、雙眼凝視及視野情況、面部癱瘓程度、上下肢運(yùn)動(dòng)檢查、共濟(jì)失調(diào)檢查、有無(wú)感覺(jué)障礙、語(yǔ)言表達(dá)情況、構(gòu)音是否正常、有無(wú)忽視癥狀共計(jì) 13 個(gè)部分,范圍0～42分,分?jǐn)?shù)越高神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重,并分為輕度亞組(NIHSS<6分,n=42),中度亞組(6分≤NIHSS<14分,n=52),重度亞組(NIHSS≥14分,n=34)[10]。

1.3.4 預(yù)后評(píng)估:出院后90 d對(duì)所有AIS患者進(jìn)行門(mén)診和電話隨訪,根據(jù)隨訪情況進(jìn)行改良Rankins評(píng)分(modified Rankins score, mRS)[11],包括是否存在神經(jīng)功能缺損癥狀、能否完成日常職責(zé)和活動(dòng)、是否可獨(dú)立自理,評(píng)分0～5分,評(píng)分越高預(yù)后越差,并分為預(yù)后不良亞組(評(píng)分>2分,30例)和預(yù)后良好亞組(評(píng)分≤2分,98例)。采用簡(jiǎn)易智能狀態(tài)量表(mini-mental state examination,MMSE)和蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment, MoCA)評(píng)估AIS患者認(rèn)知功能,評(píng)分范圍均為0～30分,分值越低,患者認(rèn)知功能越差。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清ITIH4、MCL-1水平比較 AIS組患者血清ITIH4、MCL-1水平分別為(24.17±4.58)μg/L和(7.03±1.34)μg/L,低于健康對(duì)照組的(63.29±8.17)μg/L和(22.53±3.64)μg/L,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.211、43.191,P均<0.001)。

2.2 不同病情程度AIS患者血清ITIH4、MCL-1水平比較 血清ITIH4、MCL-1水平比較,輕度亞組>中度亞組>重度亞組患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 不同病情程度AIS患者血清ITIH4、MCL-1水平比較

2.3 不同預(yù)后AIS患者病理特征比較 預(yù)后不良亞組梗死面積、入院24 h NIHSS評(píng)分高于預(yù)后良好亞組,血清ITIH4、MCL-1水平及出院3個(gè)月MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分低于預(yù)后良好亞組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表2。

表2 不同預(yù)后AIS患者病理特征比較

2.4 血清ITIH4、MCL-1與病情程度及預(yù)后的相關(guān)性 AIS患者血清ITIH4、MCL-1與梗死面積、入院24 h NIHSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān),與出院3個(gè)月的MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分呈正相關(guān)(P均<0.01),見(jiàn)表3。

表3 AIS患者血清ITIH4、MCL-1與病情程度的相關(guān)性

2.5 影響AIS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 以AIS患者預(yù)后為因變量(預(yù)后不良=1,預(yù)后良好=0),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,出院3個(gè)月MMSE評(píng)分高、出院3個(gè)月MoCA評(píng)分高是影響AIS患者預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素,血清ITIH4低、MCL-1低、梗死面積大、入院24 h NIHSS評(píng)分高是危險(xiǎn)因素(P均<0.01),見(jiàn)表4。

表4 影響AIS患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清ITIH4、MCL-1預(yù)測(cè)AIS預(yù)后的價(jià)值 繪制血清ITIH4、MCL-1預(yù)測(cè)AIS預(yù)后價(jià)值的預(yù)測(cè)效能ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:血清ITIH4、MCL-1及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的AUC分別為0.811、0.835、0.923,兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的AUC大于單一指標(biāo),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.258、4.119,P均<0.001),見(jiàn)表5,圖1。

圖1 血清ITIH4、MCL-1預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的ROC曲線分析

表5 血清ITIH4、MCL-1預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的價(jià)值

3 討 論

腦卒中是危害我國(guó)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,中國(guó)腦卒中病死率為149.49/10萬(wàn),占居民總死亡率的22.3%[12]。AIS是腦卒中最常見(jiàn)的類型,病理表現(xiàn)為腦血栓形成或腦血管閉塞后局部缺血缺氧,引起腦細(xì)胞能量代謝障礙、鈣超載及氧化應(yīng)激等的發(fā)生,導(dǎo)致腦細(xì)胞的死亡,是中老年人致死致殘的主要原因之一。深入研究AIS疾病機(jī)制,尋找能有效評(píng)估AIS預(yù)后的血清標(biāo)志物,對(duì)于AIS的早診斷、早治療具有較大臨床意義。

ITIH4屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，其作為肝源性血清糖蛋白,參與透明質(zhì)酸代謝、細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程,與惡性腫瘤、炎性反應(yīng)及心血管疾病關(guān)系密切[13]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),血清ITIH4能夠改善腦組織AIS急性期炎性反應(yīng),與AIS患者神經(jīng)功能康復(fù)有關(guān),是潛在的反映AIS患者預(yù)后的血清生物標(biāo)志物[14]。本研究中,AIS患者血清ITIH4水平降低,并與患者病情程度有關(guān),提示ITIH4的降低參與促進(jìn)AIS疾病過(guò)程,與既往血清利用蛋白質(zhì)譜的研究結(jié)果一致[15]。分析其原因,ITIH4作為一種抗炎因子,在心腦血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。研究表明,ITIH4作為一種糖蛋白和蛋白酶抑制劑,通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的纖維化穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì),能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,改善冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度,降低冠心病患者主要不良心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5,16]。AIS患者血清ITIH4降低增加腫瘤壞死因子α、白介素6等促炎細(xì)胞因子的分泌,加重AIS患者病變組織炎性反應(yīng)程度,導(dǎo)致AIS患者病情加重。本研究中,AIS患者血清ITIH4與MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分呈正相關(guān),提示ITIH4的降低加重AIS患者認(rèn)知功能障礙。分析其原因,ITIH4的降低促進(jìn)AIS后神經(jīng)元死亡,加重AIS患者認(rèn)知功能障礙。有學(xué)者證實(shí),ITIH4能夠抑制白介素6、白介素8及白介素17A等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制AIS中過(guò)量補(bǔ)體活化,并與細(xì)胞外組蛋白形成ITIH4組蛋白復(fù)合物,阻斷膠質(zhì)細(xì)胞中補(bǔ)體激活受體C5aR1,減輕對(duì)海馬神經(jīng)元的細(xì)胞毒性,而小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后6 h給予靜脈注射ITIH4,能顯著改善AIS模型小鼠神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度和認(rèn)知功能[17]。本研究中,血清ITIH4低是影響AIS患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示檢測(cè)血清ITIH4水平有助于評(píng)估AIS患者預(yù)后。筆者分析,ITIH4能夠抑制中性粒細(xì)胞活化,維持中性粒細(xì)胞形態(tài),抑制活性氧釋放及中性粒細(xì)胞與血腦屏障中血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,發(fā)揮保護(hù)缺血腦組織的效應(yīng)[17]。而AIS發(fā)生時(shí),ITIH4的降低會(huì)導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及過(guò)量的補(bǔ)體激活,引起外周炎性細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等募集到腦組織損傷部位,加重缺血腦組織炎性反應(yīng),特別是缺血半影區(qū)的炎性反應(yīng),加重神經(jīng)元損傷程度,導(dǎo)致AIS患者不良預(yù)后[18]。

MCL-1編碼基因定位于人類染色體1q21, 其作為Bcl-2家族成員,能夠下調(diào)促凋亡蛋白BH-3域蛋白,具有重要的抗凋亡生物學(xué)效應(yīng),與腫瘤、DNA損傷修復(fù)及缺血再灌注損傷等病理生理學(xué)過(guò)程關(guān)系密切。本研究中,AIS患者血清MCL-1水平降低與患者病情程度有關(guān),提示MCL-1的降低參與促進(jìn)AIS疾病進(jìn)展。AIS中MCL-1的表達(dá)受miR-106b-5p的表達(dá)調(diào)控。有學(xué)者通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MCL-1是miR-106b-5p的直接下游靶基因,在大腦中動(dòng)脈閉塞的缺血性腦卒中大鼠模型中,腦組織中miR-106b-5p表達(dá)顯著升高,miR-106b-5p降低MCL-1和B細(xì)胞淋巴瘤-2的表達(dá),抑制超氧化物歧化酶的活性,促進(jìn)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡,加重神經(jīng)功能缺損的程度[19]。本研究中,AIS患者血清MCL-1與MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分呈正相關(guān),提示MCL-1的降低加重AIS患者認(rèn)知功能障礙。分析其原因,海馬區(qū)在學(xué)習(xí)、認(rèn)知和記憶存貯中均發(fā)揮重要的功能,MCL-1能夠通過(guò)減輕AIS中海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[20-21]。研究表明,缺血性腦卒中動(dòng)物模型中,缺血腦組織及血清中MCL-1的表達(dá)顯著降低,海馬CA1錐體神經(jīng)元的存活率顯著降低,大鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為和認(rèn)知障礙,應(yīng)用葛根素或磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002治療后,磷脂酰肌醇3激酶/Akt1/糖原合成酶激酶-3β信號(hào)通路激活,MCL-1表達(dá)上調(diào),減輕海馬神經(jīng)元缺血再灌注損傷及認(rèn)知功能障礙[22]。本研究中,血清MCL-1低是影響AIS患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示檢測(cè)血清MCL-1水平有助于評(píng)估AIS患者預(yù)后。分析其原因,MCL-1的表達(dá)降低能夠抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑,增加基質(zhì)金屬蛋白酶9的產(chǎn)生,促進(jìn)SH-SY5Y神經(jīng)元的凋亡和炎性反應(yīng),促進(jìn)腦組織水腫及神經(jīng)功能缺損的程度[23]。本研究中,血清ITIH4、MCL-1聯(lián)合預(yù)測(cè)AIS預(yù)后不良的診斷效能較高,表明血清ITIH4、MCL-1聯(lián)合能夠有效評(píng)估AIS患者的預(yù)后,臨床醫(yī)生可參考血清ITIH4、MCL-1水平,對(duì)AIS患者出院后3個(gè)月神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)于預(yù)后不良的高?；颊?臨床上給予積極有效的干預(yù)治療及隨訪,盡可能改善患者的預(yù)后,降低致殘和致死率。

綜上所述,AIS患者血清ITIH4、MCL-1水平降低,且AIS病情越重,血清ITIH4、MCL-1水平降低更為明顯。血清ITIH4、MCL-1水平是影響AIS患者預(yù)后的獨(dú)立因素,ITIH4、MCL-1聯(lián)合對(duì)AIS患者的預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值,可能為AIS的分層管理和預(yù)測(cè)預(yù)后提供參考。本研究也存在一定的局限,其一是患者入院時(shí)的 NIHSS 評(píng)分以及隨訪過(guò)程中對(duì)患者的mRS評(píng)分可能存在一定的評(píng)分誤差。其二是入組病例數(shù)偏少且僅為單中心研究,存在一定的納入偏倚。后續(xù)的研究中將通過(guò)增加樣本量、開(kāi)展多中心研究來(lái)糾正納入偏倚,以進(jìn)一步研究AIS患者血清ITIH4、MCL-1的臨床意義。

利益沖突：所有作者均聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

席俊男:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);馮松松:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;薛惠元:資料搜集整理;騰東:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;陳麗薇:課題設(shè)計(jì),論文修改