馬睿,姜博文,董琪,牛凱星,林思祥

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的一種類型,占肺癌比例的85%以上,其發(fā)病率和病死率較高[1-2]。NSCLC癥狀包括咳嗽、咯痰、呼吸困難等[3]。NSCLC早期無明顯癥狀,大多數(shù)患者被確診時(shí)已為中晚期,從而失去最佳治療機(jī)會(huì),且影響患者預(yù)后效果[4]。因此,尋找有效的生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC患者預(yù)后生存期進(jìn)行評(píng)估,可以幫助醫(yī)生更好地了解患者的治療和恢復(fù)情況,指導(dǎo)治療方案的制定和調(diào)整[5]。lncRNA FOXD2-AS1可作為一種致癌基因,在多種癌癥(胃癌、肺癌、宮頸癌等)中表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,增強(qiáng)癌細(xì)胞的放射敏感性[6-9]。miR-1913與前列腺癌、骨腫瘤、膀胱癌等多種癌癥進(jìn)展相關(guān),可作為癌癥的生物標(biāo)志物[10]。目前,關(guān)于lncRNA FOXD2-AS1和miR-1913在NSCLC中的研究還相對(duì)較少,因此本研究分析NSCLC患者癌組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表達(dá),以及與患者生存期的關(guān)系,以期為提高患者生存期提供一定的理論依據(jù),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年11月—2019年11月濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院腫瘤中心收治的NSCLC患者100例作為研究對(duì)象,男57例,女43例,年齡45～70 (54.37±6.54)歲。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1709251),NSCLC患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1) 納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)臨床病理確診為NSCLC[11];②患者入組前未接受過任何手術(shù)、放療、化療等抗腫瘤治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①NSCLC復(fù)發(fā);②合并其他部位惡性腫瘤者;③伴有其他臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷者;④合并自身免疫性疾病者;⑤臨床病例及隨訪資料不全者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)水平檢測(cè):采集NSCLC外科手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織(距離癌組織>5 cm),液氮下速凍。取待檢組織,研磨并以細(xì)胞裂解液裂解,采用TRIzol法抽提組織總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司)說明書的操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行,將總RNA合成cDNA,U6作為miR-1913的內(nèi)源性對(duì)照,GAPDH作為lncRNA FOXD2-AS1的內(nèi)源性對(duì)照,引物由Primer-BLAST網(wǎng)站設(shè)計(jì),并通過南京金斯瑞生物科技公司合成,引物序列見表1。以cDNA為模板通過LightCycler 480II型 qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司)以實(shí)時(shí)熒光定量—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)患者組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)水平,重復(fù)3次,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 隨訪:以微信、電話及門診復(fù)查的方式對(duì)所有受試者進(jìn)行為期3年的隨訪,隨訪率為100%,隨訪開始于手術(shù)當(dāng)天,隨訪終點(diǎn)為NSCLC患者死亡或者至2022年11月,必要時(shí)行影像學(xué)檢查。統(tǒng)計(jì)隨訪結(jié)束時(shí)NSCLC患者的生存和死亡人數(shù)。根據(jù)術(shù)后3年預(yù)后情況分為生存組58例與死亡組42例。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織 lncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平比較 與癌旁組織比較,NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平升高(P<0.01),miR-1913表達(dá)水平降低(P<0.01),見表2。

表2 癌旁組織和NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1 與miR-1913表達(dá)水平比較

2.2 生存組與死亡組患者NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平比較 與生存組比較,死亡組患者NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平升高(P<0.01),miR-1913表達(dá)水平降低(P<0.01),見表3。

表3 生存組和死亡組患者NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平比較

2.3 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平的相關(guān)性 Target Scan Human網(wǎng)址預(yù)測(cè)lncRNA FOXD2-AS1與miR-1913間存在結(jié)合位點(diǎn),見圖1。NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.406,P<0.001)。

圖1 lncRNA FOXD2-AS1與miR-1913間結(jié)合位點(diǎn)

2.4 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異比較 根據(jù)NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)水平的平均值,將患者lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)<1.22作為lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)亞組54例,≥1.22作為lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)亞組46例;miR-1913表達(dá)<0.84作為miR-1913低表達(dá)亞組53例,≥0.84作為miR-1913高表達(dá)亞組47例。結(jié)果顯示,不同性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型的NSCLC患者lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度的NSCLC患者lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)比例高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化程度的NSCLC患者(P均<0.05)。TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度的NSCLC患者miR-1913低表達(dá)比例高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化程度的NSCLC患者(P均<0.01),見表4。

表4 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異 [例(%)]

2.5 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)與生存期的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示,lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)NSCLC患者3年生存率為43.48%(20/46),低于lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)患者的70.37%(38/54)(χ2=7.830,P=0.005);miR-1913高表達(dá)患者3年生存率為70.21%(33/47),高于miR-1913低表達(dá)NSCLC患者的47.17%(25/53)(χ2=6.125,P=0.013),見圖2。

圖2 lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表達(dá)與NSCLC患者生存期的關(guān)系Fig.2 Correlation between expression of lncRNA FOXD2-AS1 and miR-1913 and survival of patients with NSCLC

2.6 Cox分析NSCLC患者預(yù)后的影響因素 以NSCLC患者生存狀態(tài)為因變量,以lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為自變量,lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913為連續(xù)變量,TNM分期(賦值:Ⅲ+Ⅳ期為“1”;Ⅰ+Ⅱ期為“0”),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值:是為“1”;否為“0”),分化程度(賦值:低分化為“1”;中/高分化為“0”),進(jìn)行多因素Cox分析,結(jié)果顯示:miR-1913高是NSCLC患者預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.01),lncRNA FOXD2-AS1高、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低是NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.01),見表5。

表5 Cox分析NSCLC患者預(yù)后的影響因素

3 討 論

NSCLC的致病機(jī)制較為復(fù)雜,發(fā)病率和病死率較高。近年來,關(guān)于NSCLC治療和診斷的方式不斷改善,其術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍然較高,預(yù)后效果較差[12-13]。目前NSCLC評(píng)估主要以影像學(xué)檢查為基礎(chǔ),其檢出率較低,患者往往在NSCLC中晚期才被檢出,臨床治療干預(yù)時(shí)間縮短,治療預(yù)后效果較差,死亡率增加[14-15]。因此本研究分析NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表達(dá),探究其與患者生存期的關(guān)系,以期改善NSCLC患者預(yù)后。

LncRNA FOXD2-AS1作為lncRNA家族的一員,在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)[16]。Guo等[9]研究表明,lncRNA FOXD2-AS1在胃癌患者組織中表達(dá)上調(diào),敲低可抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),激活lncRNA FOXD2-AS1/miR-31/CDK1軸可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程。在本研究中,NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平升高。提示了上調(diào)lncRNA FOXD2-AS1水平可能會(huì)導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生。該結(jié)果與Yuan等[19]的研究結(jié)果一致,結(jié)合以往研究結(jié)果推測(cè)敲低lncRNA FOXD2-AS1可減弱A549細(xì)胞增殖、侵襲和增加細(xì)胞凋亡。但由于目前尚無lncRNA FOXD2-AS1在NSCLC中的機(jī)制研究,仍需后續(xù)驗(yàn)證。另外,與生存組比較,死亡組患者lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平升高,lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)NSCLC患者3年生存率低于lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)患者,提示了lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NSCLC患者死亡率上升。

miRNA是小的非編碼RNA[20]。miR-1913作為miRNA位于人類基因組的第19號(hào)染色體上,長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸,miR-1913已被證實(shí)可靶向多個(gè)基因(BCL2L11、CDK6和PTEN等基因)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、代謝等過程,在多種生物過程中發(fā)揮重要作用。miR-1913可作為癌癥的生物標(biāo)志物,其水平異常與多種癌癥(前列腺癌、骨腫瘤、膀胱癌等)進(jìn)展相關(guān)[21-22]。在本研究中,NSCLC組織中miR-1913表達(dá)水平降低,提示了miR-1913低表達(dá)與NSCLC發(fā)生有關(guān)。另外,與生存組比較,死亡組患者組織中miR-1913表達(dá)水平降低,miR-1913高表達(dá)患者3年生存率高于miR-1913低表達(dá)NSCLC患者,提示了敲低miR-1913會(huì)增加NSCLC患者死亡率,有望成為NSCLC預(yù)后生存期的評(píng)估方法。

Target Scan Human網(wǎng)址預(yù)測(cè)lncRNA FOXD2-AS1與miR-1913間存在結(jié)合位點(diǎn)。NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1與miR-1913表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),提示了lncRNA FOXD2-AS1與miR-1913之間存在靶向作用,兩者相互作用影響了肺癌的進(jìn)程,臨床可將兩者聯(lián)合作為新的肺癌治療靶點(diǎn)。根據(jù)Cox分析顯示,miR-1913高是NSCLC患者預(yù)后的保護(hù)因素,lncRNA FOXD2-AS1高、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低是NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。這表明lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表達(dá)水平可能對(duì)NSCLC患者預(yù)后具有重要的評(píng)估意義,通過調(diào)節(jié)lncRNA FOXD2-AS1和miR-1913水平,及時(shí)調(diào)整治療方案,有助于改善NSCLC患者預(yù)后。

綜上,NSCLC組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)水平升高,miR-1913的表達(dá)水平降低,兩者與患者預(yù)后生存期有關(guān)。然而,本研究也存在一些限制,需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究來探究lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913影響NSCLC預(yù)后生存期的具體作用機(jī)制,提高結(jié)果的可靠性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬睿:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;姜博文、牛凱星:實(shí)施研究過程,資料搜集整理;董琪:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;林思祥:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核