韓璐,紀(jì)愛芳,魏子白,栗彥琪,王彪

肝癌是全球發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)報道2022年中國肝癌發(fā)病和死亡例數(shù)分別為431 383例、412 216例[2]。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最常見的病理學(xué)類型(75%～85%),惡性程度高,長期預(yù)后較差[3]。沉默調(diào)節(jié)蛋白5(sirtiun 5,SIRT5)是一種去乙酰化酶,能通過乙?；揎椬饔脜⑴c腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。實驗報道,SIRT5在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)[5]。富含半胱氨酸腸蛋白1(cysteine rich protein 1,CRIP1)是一種LIM/雙鋅指蛋白,能通過抑制免疫和激活信號通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。實驗報道,CRIP1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)[7]。相關(guān)研究指出,SIRT5異常表達(dá)與結(jié)直腸癌、分化型甲狀腺癌等腫瘤患者預(yù)后不良有關(guān)[8-9];CRIP1異常表達(dá)與卵巢癌、急性髓細(xì)胞性白血病等腫瘤患者預(yù)后不良有關(guān)[10-11]。但關(guān)于SIRT5、CRIP1在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義尚不明確,基于此本研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年5月長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除HCC患者150例,其中男91例,女59例,年齡27～75(60.00±5.75)歲,≥60歲79例,<60歲71例;乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)/(hepatitis C virus,HCV)陽性128例,HBV/HCV陰性22例;腫瘤位置:左葉63例,右葉74例,跨葉13例;甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)79.26～857.68(507.20±148.15)μg/L,≥400 μg/L 129例,<400 μg/L 21例;腫瘤數(shù)目:單發(fā)67例,多發(fā)83例;腫瘤直徑1.15～7.98(4.63±1.99)cm,≥5 cm 66例,<5 cm 84例;分化程度:低分化38例,中高分化112例;有脈管侵犯72例;TNM分期[12]:Ⅰ期37例,Ⅱ期61例,Ⅲ期52例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2018005),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②初次確診為HCC(經(jīng)病理診斷);③接受根治性或姑息性切除;④TNM分期Ⅰ～Ⅲ期。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①入院前已接受任何抗腫瘤治療;②拒絕隨訪;③合并其他部位惡性腫瘤;④不能耐受手術(shù);⑤嚴(yán)重肝腎功能障礙;⑥合并嚴(yán)重感染;⑦肝移植患者;⑧合并自身免疫性疾病;⑨資料不完整。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫組化檢測肝組織SIRT5、CRIP1表達(dá):術(shù)中收集部分癌組織及對應(yīng)癌旁組織(距離癌組織>2 cm)福爾馬林固定,取部分福爾馬林固定組織,常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后,pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行高壓熱修復(fù)5 min,室溫自然冷卻。切片放置于3%H2O2避光15 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗滌3次(5 min/次)阻斷非特異性反應(yīng)。再將一抗[兔抗人SIRT5(1∶100)、CRIP1(1∶100),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,編號 67257-1-IG、15349-1-AP]滴加到切片中,4℃下過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,PBS洗滌3次(5 min/次),二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精反染,乙醇梯度脫水,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照,以PBS(代替一抗)作為陰性對照,以已知陽性切片作為陽性對照進(jìn)行免疫組化評分(染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞比例),以≥3分為陽性表達(dá)。染色強(qiáng)度:無染色、黃色、淺褐色、深棕色分別為0分、1分、2分、3分;陽性細(xì)胞:0、<5%、5%～<30%、30%～<50%、≥50%分別為0分、1分、2分、3分、4分[8]。根據(jù)HCC組織中SIRT5、CRIP1表達(dá)將HCC患者分為SIRT5、CRIP1陽性/陰性表達(dá)組。

1.3.2 隨訪:HCC患者術(shù)后通過電話、門診、互聯(lián)網(wǎng)等方式隨訪3年,截止日期為2023年5月31日或失訪/死亡,統(tǒng)計SIRT5、CRIP1陽性/陰性表達(dá)HCC患者3年總生存率。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT5、CRIP1在HCC組織及癌旁組織中表達(dá)比較 HCC組織SIRT5陽性表達(dá)率低于癌旁組織,CRIP1陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.01),見表1。

表1 SIRT5、CRIP1在HCC組織及癌旁組織中表達(dá)比較 [例(%)]

2.2 SIRT5、CRIP1陽性表達(dá)在HCC患者不同臨床/病理特征中比較 腫瘤單發(fā)、腫瘤直徑小、中高分化程度、無脈管侵犯、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的HCC組織較腫瘤多發(fā)、腫瘤直徑大、低分化、有脈管侵犯、TNM分期Ⅲ期SIRT5陽性表達(dá)率升高、CRIP1陽性表達(dá)率降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),不同性別、年齡、HBV/HCV、腫瘤位置、AFP的HCC組織SIRT5、CRIP1陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 SIRT5、CRIP1表達(dá)在HCC患者不同臨床/病理特征中差異比較 [例(%)]

2.3 不同SIRT5、CRIP1表達(dá)的HCC患者生存率比較 150例HCC患者隨訪3年,失訪11例,死亡71例,3年總生存率為56.83%(79/139)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,SIRT5陽性表達(dá)組(35例)3年總生存率68.57%(24/35)高于SIRT5陰性表達(dá)組(104例)的42.31%(44/104);CRIP1陽性表達(dá)組(82例)3年總生存率31.71%(26/82)低于CRIP1陰性表達(dá)組(57例)的73.68%(42/57)(Log-rankχ2=7.552、20.942,P=0.006、<0.001),見圖1。

圖1 SIRT5、CRIP1陽性/陰性表達(dá)HCC患者Kaplan-Meier生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival curve of patients with positive/negative expression of SIRT5 and CRIP1 in HCC

2.4 Cox回歸分析影響HCC患者預(yù)后的因素 以HCC患者預(yù)后(死亡/存活=1/0)為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:腫瘤數(shù)目多發(fā)、腫瘤直徑≥5 cm、低分化、脈管侵犯、TNM分期Ⅲ期、CRIP1陽性為HCC患者死亡的獨立危險因素,SIRT5陽性為獨立保護(hù)因素(P<0.05),見表3。

表3 Cox回歸分析影響HCC患者預(yù)后的因素

3 討 論

HCC是起源于肝細(xì)胞且血供豐富的惡性腫瘤,其發(fā)病可能與HBV/HCV感染、非酒精性脂肪性肝炎、飲酒過度、肝硬化、食用黃曲霉毒素污染食物等有關(guān)[3]。根治性切除是早期HCC的有效治療方法,但由于其起病隱匿和HCC高危人群篩查未能普及,導(dǎo)致70%～80%的初診患者處于中晚期,5年總體生存率不足15%[13]。雖然近年來基于程序性細(xì)胞死亡蛋白-1及配體的免疫藥物和基于血管生長因子的靶向藥物被用于HCC治療,但HCC血供復(fù)雜、惡性程度高且進(jìn)展迅速,僅部分患者能獲得臨床效益[14-15]。因此有必要確定更多HCC預(yù)后生物標(biāo)志物,對指導(dǎo)臨床早期干預(yù)和促進(jìn)預(yù)后改善意義重大。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是蛋白質(zhì)翻譯中或翻譯后的共價加工過程,乙酰化修飾作為最常見的?；揎楊愋?參與代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子激活、染色質(zhì)重塑等幾乎所有的生命活動過程,在惡性腫瘤中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。SIRT5是沉默信息調(diào)節(jié)因子2的同源基因家族第5個成員,主要定位于線粒體,能通過催化脫丙醇?；⒚撶牾；?、賴氨酸脫谷氨酰化等過程參與細(xì)胞代謝、損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、DNA轉(zhuǎn)錄、血管生成等調(diào)控[4,16]。近年來多項研究報道了SIRT5與腫瘤的關(guān)系,如SIRT5能抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路,抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17];SIRT5能通過促進(jìn)醛脫氫酶5家族成員A1去琥珀?；?促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[18]。這些研究提示SIRT5在不同腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌作用。有學(xué)者報道,肝癌細(xì)胞SIRT5低表達(dá)會促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長[5]。同時SIRT5低表達(dá)導(dǎo)致胰腺癌患者預(yù)后不良,SIRT5高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示,HCC組織SIRT5低表達(dá),與腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、分化程度、脈管侵犯和TNM分期有關(guān),且SIRT5陽性表達(dá)患者3年生存率升高,可降低HCC患者死亡風(fēng)險,說明SIRT5低表達(dá)與HCC惡性進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)。究其原因,SIRT5低表達(dá)有助于波形蛋白乙?；せ?促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力,促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展[21];同時SIRT5低表達(dá)也有助于激活信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3乙?；せ?通過Nanog同源基因維持腫瘤細(xì)胞干性,促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和分化失控,從而導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展[5]。

CRIP1是一種在腸道廣泛表達(dá)的小分子蛋白,可通過LIM結(jié)構(gòu)域的鋅指結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用,從而影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、免疫、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等腫瘤進(jìn)程[6]。近年來大量研究報道了CRIP1參與腫瘤進(jìn)程,如CRIP1能促進(jìn)p65結(jié)合CXC趨化因子1/5,增加核因子-κB轉(zhuǎn)錄,抑制CD8+T細(xì)胞浸潤,從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞免疫逃逸[22]。CRIP1能激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路,促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。有學(xué)者報道,肝癌細(xì)胞CRIP1高表達(dá)會促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[7]。本研究結(jié)果顯示,HCC組織CRIP1高表達(dá),與腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、分化程度、脈管侵犯和TNM分期有關(guān),且CRIP1陽性表達(dá)患者3年生存率降低,會增加HCC患者死亡風(fēng)險,說明CRIP1高表達(dá)與HCC惡性進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)。究其原因,CRIP1能與γ-丁甜菜堿羥化酶相互作用激活Wnt/β-catenin信號通路,維持HCC細(xì)胞干性,從而導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展[24]。同時CRIP1還能與大鼠肉瘤基因相互作用,激活大鼠肉瘤基因/蛋白激酶B信號通路,促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖[25]。

綜上所述,SIRT5在HCC組織中低表達(dá),CRIP1高表達(dá),與腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、分化程度、脈管侵犯和TNM分期有關(guān),是HCC患者死亡的獨立危險因素,可能成為HCC患者預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。但仍需多中心、大樣本研究驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

韓璐、紀(jì)愛芳:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;魏子白:課題設(shè)計,論文撰寫;栗彥琪:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;王彪:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改