李靈玉，雷 程，王海江

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)2021 年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（IARC）發(fā)布的2020 年全球最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，CRC 世界發(fā)病率和死亡率均排前三［1］。在中國，CRC 是第二常見的癌癥，癌癥死亡的第五大原因。每年發(fā)病率和死亡率均占全世界總的三分之一［2］。CRC 治療主要是以外科手術(shù)為中心的多學(xué)科治療模式，使其預(yù)后得到了很大改善。然而，我國CRC 發(fā)病率和死亡率仍處于較高水平，因此，有必要深入探索CRC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為診斷和治療尋找新的生物標(biāo)志物。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子結(jié)合蛋白1（reticulocalbin-1，RCN1）是 CREC（Cab45/Reticulocalbin/ERC-55/CALU）蛋白家族中的一員，位于人類基因組的11p13 區(qū)域，翻譯成331 個氨基酸前體，是一種高度保守的鈣離子結(jié)合蛋白質(zhì)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），含有6 個鈣結(jié)合基序、一個HDEL 序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高保留信號［3］。RCN1 在肝癌、肺癌、腎癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤組織中的高表達(dá)已被證實(shí)，并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)［4-9］。結(jié)腸癌中RCN1 在基因和蛋白水平也呈高表達(dá)，但其分子機(jī)制及預(yù)后價值還尚未闡明［10，11］。多項(xiàng)研究表明，RCN1 功能與ER 應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）密切相關(guān)。而葡萄糖蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是UPR 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，也稱作BIP，由熱休克蛋白70（heat shock protein，Hsp70）家族成員HSPA5編碼，位于真核生物的ER膜上，是UPR 的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白。UPR 是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性反應(yīng)，由三個傳感器（IRE1、ATF6和PERK）構(gòu)成，它們都具有結(jié)合GRP78 的管腔結(jié)構(gòu)域。在正常條件下為無活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激時，累積的未折疊蛋白質(zhì)的存在導(dǎo)致三種傳感器與GRP78 解離，形成反饋控制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并使得GRP78 的表達(dá)增加［12］。

因此，本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫及臨床樣本驗(yàn)證的方法，分析RCN1 和GRP78 的表達(dá)與CRC 臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性及預(yù)后價值，驗(yàn)證兩者在CRC中的表達(dá)相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 從TCGA、UALCAN 和GSCA 在線數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

從XENA 下載TCGA 結(jié)腸癌（COAD）和直腸癌（READ）患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證RCN1 mRNA和HSPA5 mRNA 在CRC 中的表達(dá)水平。利用UALCAN 在線數(shù)據(jù)庫探索RCN1 和HSPA5 mRNA 與CRC 臨床病理特征的相關(guān)性。

1.2 臨床資料標(biāo)本來源

收集2017 年1 月～2022 年8 月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院初治經(jīng)病理診斷為CRC 且行手術(shù)治療的癌及癌旁石蠟組織標(biāo)本，共78 例。癌旁組織均距離癌組織至少5 cm 以上的正常結(jié)直腸組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18 歲；（2）術(shù)后病理診斷分期為Ⅱ～Ⅲ期并接受標(biāo)準(zhǔn)方案奧沙利鉑+卡培他濱兩藥輔助化療；（3）隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（4）既往5年內(nèi)有其他惡性腫瘤病史；（5）存在嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病或合并癥，可能干擾本研究的評估；（6）合并家族性腺瘤性息肉病或者炎癥性腸病。按年齡分組：年齡≤60 歲43 例，＞60 歲35 例。按發(fā)病部位：結(jié)腸癌38 例，直腸癌40 例。大體類型：隆起性15 例，潰瘍型61 例，浸潤型2 例。分化程度：低分化30 例，中-高分化48 例。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：K-2023044），患者均知情且簽署同意書。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

從標(biāo)本庫調(diào)取78 例CRC 癌及癌旁組織，制作成4 μm的切片。脫蠟水化后進(jìn)行高溫修復(fù)抗原，經(jīng)0.3%過氧化氫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后加入兔抗人單克隆抗體RCN1（1∶150，abcom）、GRP78（1∶100，proteintech），4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗37 ℃溫育1 h，DAB 顯色及蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，封片。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化結(jié)果由兩名病理科醫(yī)師判定，評分包括染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度評分：無染色計(jì)0 分，黃色計(jì)1 分，黃褐色計(jì)2 分，棕色計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%計(jì)0 分，6%～25%計(jì)1 分，26%～50% 計(jì)2 分，51%～75% 計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分?？偡譃殛栃约?xì)胞評分和染色強(qiáng)度評分相乘，評分范圍為0～12 分。根據(jù)免疫組化評分結(jié)果進(jìn)行分組，其中≤6 分為低表達(dá)組，＞6 分為高表達(dá)組。

1.5 病例隨訪

對患者的隨訪采用病例隨訪系統(tǒng)查詢及電話隨訪兩種方式，隨訪所有患者的生存狀態(tài)及生存時間，截止時間為2023 年3 月1 日，無病生存期（disease free survival，DFS）為手術(shù)日期至患者疾病復(fù)發(fā)或隨訪截止日期?？偵鏁r間（overall survival，OS）為手術(shù)日期至患者死亡日期或隨訪截至日期。隨訪截止時，未發(fā)生死亡或復(fù)發(fā)根據(jù)隨訪截止時間做后續(xù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在線數(shù)據(jù)庫分析采用數(shù)據(jù)庫默認(rèn)統(tǒng)計(jì)方法，實(shí)驗(yàn)及病例資料數(shù)據(jù)采用SPSS27.0.1 和Graphpad 8處理數(shù)據(jù)，RCN1、GRP78 的表達(dá)情況采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，臨床病理特點(diǎn)分析采用卡方檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 生存分析、單因素及多因素COX回歸分析。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCN1 和HSPA5 基因在CRC 中的表達(dá)及相關(guān)性分析

利用TCGA 數(shù)據(jù)庫探究RCN1、HSPA5基因在CRC 的表達(dá)情況。如圖1 所示，RCN1和HSPA5 在COAD 和READ 組織中的表達(dá)水平顯著高于正常腸黏膜組織，兩者mRNA 表達(dá)在COAD 和READ中均呈正相關(guān)。

圖1 RCN1 和HSPA5 mRNA 在COAD 和READ 中的表達(dá)水平及兩者表達(dá)相關(guān)性Fig 1 Expression levels of RCN1 and HSPA5 mRNA in COAD and READ their expression correlation

2.2 UALCAN 分析RCN1、HSPA5 基因表達(dá)與CRC 臨床病理特征的相關(guān)性

如圖2 所示，RCN1 mRNA 水平與READ N 分期相關(guān)，在N2 中的表達(dá)顯著高于N1 和N0，HSPA5 mRNA 在結(jié)腸黏液腺癌中表達(dá)更高。 RCN1 mRNA 與CRCTP53突變相關(guān)，TP53突變的CRC中mRNA 的表達(dá)顯著高于TP53未突變。

圖2 通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析RCN1、HSPA5 mRNA 與CRC 臨床病理特征的相關(guān)性Fig 2 The association of RCN1 / HSPA5 mRNA with the clinicopathological features of colorectal cancer were analyzed by the UALCAN database

2.3 RCN1 和GRP78 蛋白在CRC 癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

根據(jù)免疫組化結(jié)果，RCN1 及GRP78 蛋白在CRC 組織中定位在細(xì)胞質(zhì)（圖3）。78 例CRC 組織中RCN1 高表達(dá)58 例，占74.4%，低表達(dá)20 例，占25.6%，癌旁組織中高表達(dá)3 例，占3.8%，低表達(dá)75例，占96.2%。RCN1 在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，圖4）。78 例CRC 癌組織中，GRP78 高表達(dá)39 例，占50%，低表達(dá)39 例，占50%，癌旁組織中高表達(dá)1例，占1.2%，低表達(dá)77 例，占98.8%。GRP78 在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，圖4）。

圖3 免疫組化檢測RCN1、GRP78 蛋白表達(dá)情況（SP×100）Fig 3 The expression of RCN 1 and GRP 78 protein detected by immunohistochemistry （SP×100）

圖4 RCN1 和GRP78 蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁中的表達(dá)水平Fig 4 Expression levels of RCN 1 and GRP78 protein in colorectal and adjacent cancers

2.4 RCN1 和GRP78 的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

分析RCN1 和GRP78 的蛋白表達(dá)水平與臨床病理特點(diǎn)之間的相關(guān)性（表1）。RCN1、GRP78 表達(dá)與CRC 患者性別、年齡、腫瘤位置、最大直徑、分化程度、N 分期、大體類型以及是否侵犯血管和神經(jīng)無顯著相關(guān)性。其中，GRP78 與CRC T 分期顯著相關(guān)（P=0.011）。

表1 RCN1、GRP78 蛋白表達(dá)與CRC 臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 The correlation between RCN1/GRP78 protein expression and clinicopathological features of colorectal cancer

2.5 RCN1 和GRP78 與CRC 患者預(yù)后的相關(guān)性

78 例結(jié)腸癌患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)39 例，未復(fù)發(fā)39例，死亡13 例，其余65 例末次隨訪時間時仍存活。采用K-M 生存曲線分析，RCN1 高表達(dá)與CRC 患者較短的DFS 顯著相關(guān)（P＜0.01），高表達(dá)RCN1 患者的OS 比低表達(dá)RCN1 的患者有更短的趨勢，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）。

圖5 RCN1 蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存預(yù)后情況Fig 5 Survival rate of groups with high and low RCN 1 protein expression

單因素COX 回歸分析CRC 的DFS 危險因素，N 分期、TNM 分期、腫瘤侵犯神經(jīng)和血管、RCN1 高表達(dá)是CRC 不良預(yù)后的危險因素（表2）。RCN1 高表達(dá)組的復(fù)發(fā)風(fēng)險是低表達(dá)組的3.038 倍（HR=3.038，P=0.014）。

表2 78 例CRC 患者DFS 的COX 單因素分析Tab 2 COX univariate analysis of DFS in 78 colorectal cancer patients

用N 分期、TNM 分期、腫瘤侵犯神經(jīng)和血管、RCN1 表達(dá)進(jìn)行DFS 多因素COX 回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤神經(jīng)侵犯情況、TNM 分期和RCN1 表達(dá)水平是CRC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素（表3）。

表3 78 例CRC 患者DFS 的COX 多因素分析Tab 3 COX multivariate analysis of DFS in 78 colorectal cancer patients

2.6 RCN1 和GRP78 在CRC 中的表達(dá)相關(guān)性

與生信分析結(jié)果一致，相關(guān)性分析結(jié)果提示，RCN1 和GRP78 在CRC 中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.260，P=0.021，表4）

表4 RCN1 和GRP78 蛋白表達(dá)相關(guān)性Tab 4 Correlation between RCN 1 and GRP 78 protein expression

3 討論

RCN1 作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，在發(fā)生ER 應(yīng)激的病理生理?xiàng)l件下促進(jìn)細(xì)胞存活［13］。已有研究發(fā)現(xiàn)，RCN1 在多種實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)，與不良預(yù)后顯著相關(guān)。RCN1 可被核因子kappa B（NF-κB）反式激活，進(jìn)而通過鈣穩(wěn)態(tài)和PERK-CHOP 信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且RCN1 的前兩個EF-hand 鈣結(jié)合基序與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域上的肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）受體1（IP3R1）特異性相互作用并降低未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放和細(xì)胞凋亡［14］。結(jié)直腸癌中，RCN1 基因水平和蛋白水平均顯著上調(diào)，但其表達(dá)與CRC 患者臨床病理特征及預(yù)后價值的研究較少［10］。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫及UALCAN 在線分析RCN1 基因在CRC 中呈顯著高表達(dá)，與N 分期、TP53 突變顯著相關(guān)。進(jìn)而通過免疫組化在78 例臨床標(biāo)本中驗(yàn)證，RCN1 蛋白在癌組織中的顯著高表達(dá)。在隨后的預(yù)后分析中發(fā)現(xiàn)，RCN1 高表達(dá)與CRC 患者DFS 顯著相關(guān)，是術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。

GRP78 已被證實(shí)在CRC 腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡抗性機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是潛在的CRC 抗腫瘤藥物治療靶點(diǎn)［15-17］。RCN1 和GRP78 在腫瘤中可以相互作用也有多項(xiàng)研究，在耐藥肝癌細(xì)胞中，RCN1 的EFh1/2 結(jié)構(gòu)域可以與GRP78 相互作用，促使GRP78 與IRE1α 解離，導(dǎo)致IRE1α 激活，進(jìn)而通過IRE1α-XBP1s 通路激活索拉非尼耐藥細(xì)胞中的c-MYC 信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展［18］。在前列腺癌研究發(fā)現(xiàn)，抑制癌細(xì)胞中RCN1 的表達(dá)，可觀察到caspase-3 的激活和核酶PARP 的裂解，GRP78 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致依賴CaMKII 的通路激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 中，GRP78 呈顯著高表達(dá)，臨床病理特征分析中與T 分期相關(guān)。RCN1 和GRP78 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：兩者表達(dá)呈正相關(guān)。提示RCN1 可能通過GRP78 促進(jìn)CRC 的發(fā)展，為揭示CRC 發(fā)展的分子機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)提供了新的線索。

綜上所述，RCN1 在CRC 中顯著高表達(dá)，與UPR 關(guān)鍵蛋白GRP78 表達(dá)呈正相關(guān)，此外，腫瘤神經(jīng)侵襲、TNM 分期及RCN1 高表達(dá)是CRC 不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。本研究數(shù)據(jù)首次驗(yàn)證RCN1 高表達(dá)對RCR 患者的OS 和DFS 產(chǎn)生影響，其潛在的致癌作用可能與GRP78 的表達(dá)有關(guān)。這對進(jìn)一步證實(shí)RCN1 在CRC 中的確切功能具有重要意義。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李靈玉、雷程：研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析；李靈玉：文章撰寫，實(shí)驗(yàn)校對；雷程：論文撰寫指導(dǎo)；王海江：全面指導(dǎo)研究，經(jīng)費(fèi)資助。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。