吳清勝，李媛媛，姚春萍

國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京 101111

SARS-CoV-2 是2019 年COVID-19 的病因，WHO宣布COVID-19 為大流行?。?-2］。疫苗被認(rèn)為是人類(lèi)面對(duì)病毒感染最有效的預(yù)防手段，基于不同技術(shù)路線的疫苗均在加緊研制中［3-4］。基因工程亞單位疫苗無(wú)需P3 實(shí)驗(yàn)室，易于放大生產(chǎn)，對(duì)抗原的改造可提高其免疫原性［5-8］。桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)（baculovirus-insect cell system，BICS）具有安全性高、重組蛋白表達(dá)水平高、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，可對(duì)重組蛋白進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于預(yù)防性及治療性疫苗和基因治療藥物的研發(fā)及生產(chǎn)［9-11］。

SARS-CoV-2 通過(guò)S 蛋白上受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）與宿主細(xì)胞的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合［12］，S1 蛋白、RBD、RBD 二聚體蛋白具有良好的免疫原性，是制備疫苗的理想抗原［13-15］。信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一段多肽，一般由15 ～30 個(gè)氨基酸殘基組成，位于合成肽鏈的N-端。信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放到細(xì)胞外的主要方式之一，可提高分泌表達(dá)效率［16-18］。信號(hào)肽在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中會(huì)被位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔表面的信號(hào)肽酶水解、切除，不會(huì)在重組蛋白上引入外源序列。

本研究采用BICS對(duì)比不同信號(hào)肽對(duì)SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD 二聚體蛋白分泌表達(dá)量的影響，為疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為BICS 表達(dá)其他外源蛋白時(shí)，N-端基因序列優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 ExpiSf9TM細(xì)胞、pFastBac1TMdonor plasmid和DH10BacTMChemically Competent Cells（DH-10BacTM感受態(tài)細(xì)胞）均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific Inc。

1.2 主要試劑及儀器 蛋白marker、Lipofectamine 3000、FBS、ExpiSf9 cells和ExpiSfTMCD Medium 均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientificInc；SFX-InsectMedium、XK16／20 Column 和Ni Sepharose excel 均購(gòu)自美國(guó)Cytiva 公司；Strep-Tactin?XT Superflow?resin 和Bio-tin購(gòu)自德國(guó)IBA Lifesciences 公司；IPTG 即用型溶液、X-Gal 即用型溶液購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；氨芐西林（Amp）、卡那霉素（Kan）、慶大霉素（Gen）、四環(huán)素（Tet）、X-Gal 溶液、IPTG 溶液和新型一步法快速WB 試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；RBD蛋白、SARS-CoV-2 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司；IC1000Countstar?自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.3 重組pFastBac1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 使用SignalP 5.0在線軟件對(duì)6種不同的信號(hào)肽進(jìn)行分析。根據(jù)蛋白、N-端信號(hào)肽不同，以及C-端是否有Tag，共分25組，其中S1 蛋白編號(hào)A1 ～A9；RBD 蛋白編號(hào)B1 ～B8；RBD-dimer 蛋白編號(hào)C1 ～C8。委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化、基因合成、重組pFastBac1轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建。

1.4 重組桿粒的構(gòu)建 將25 種重組pFastBac1 載體轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑，使用相同方法進(jìn)行二次篩選。挑取3 個(gè)單克隆菌落，置于1 ～5 mL含Amp（終濃度50 μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。提取重組Bacmid 桿粒，使用M13 通用引物（上游：5′-GTTTTTCCCAGTCACGAC-3′，下游：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）進(jìn)行PCR 鑒定。委托生工生物工程（上海）股份有限公司，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)基因進(jìn)行全序列測(cè)序后，向菌液中加入等體積的50%滅菌甘油，-80 ℃保存菌種。

1.5 三級(jí)毒種庫(kù)的建立 使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，將25 種重組Bacmid 轉(zhuǎn)染6 孔板中貼壁的昆蟲(chóng)細(xì)胞，27 ℃靜置培養(yǎng)4 ～6 d；顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞病變后，離心收集上清液，接種至搖瓶中懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞活率降至50%左右時(shí)，收獲培養(yǎng)上清液，加入2% FBS，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，制備原始毒種庫(kù)，-80 ℃凍存。依次制備主代和工作毒種庫(kù)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)

1.6.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制及接種和收獲時(shí)間的確定 使用搖瓶培養(yǎng)Expisf9細(xì)胞，每天取樣并計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

將B2、C4 病毒分別接種至不同密度的細(xì)胞，分別為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中前期（2.8 × 106個(gè)／mL）和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（1.2×107個(gè)／mL），評(píng)價(jià)通過(guò)延后接種時(shí)間，提高接種病毒時(shí)的細(xì)胞密度是否可增加表達(dá)量。

比較接種病毒后第4 和第5 天離心上清中目的蛋白的表達(dá)量，確定最佳收獲時(shí)間。

1.6.2 25 種病毒分泌表達(dá)量的檢測(cè) 采用ELISA法。將25種病毒接種至10 mL（125 mL搖瓶）ExpiSf9TM細(xì)胞，傳代至100 mL（500 mL 搖瓶）培養(yǎng)4 d 或細(xì)胞活率降至50%以下時(shí)，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中的表達(dá)量。

1.6.3 重復(fù)驗(yàn)證 從A 系列蛋白（RBD 蛋白）中分別選擇分泌表達(dá)量最高，且N-端帶有不同信號(hào)肽的2 種病毒，再次培養(yǎng)，進(jìn)行8%固定濃度SDS-PAGE、Western blot和表達(dá)量的重復(fù)驗(yàn)證。

1.7 放大培養(yǎng)及純化 取B6 工作病毒1 支，放大培養(yǎng)至3 L（5 L 搖瓶），離心收集上清液，使用Ni Sepharose excel 和Strep-Tactin?XT Superflow?resin 填料進(jìn)行2步純化，并取樣進(jìn)行8%固定濃度SDS-PAGE分析。

1.8 數(shù)據(jù)采集及分析 使用OriginLabOriginPro 軟件繪制細(xì)胞曲線。

2 結(jié)果

2.1 重組pFastBac1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 使用SigalP 5.0 對(duì)6 種信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)不同組合，共構(gòu)建25種重組pFastBac1轉(zhuǎn)移載體，見(jiàn)圖1。

表1 SigalP 5.0軟件對(duì)6種信號(hào)肽的分析結(jié)果Tab.1 Evaluation results of 6 signal peptides by SigalP 5.0 software

圖1 25組重組基因構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction schematic diagram of 25 recombinant genes

2.2 重組Bacmid 的鑒定 第1 次藍(lán)白斑篩選，大部分為白斑；第2 次藍(lán)白斑篩選，均為白斑。每組挑取3 個(gè)單克隆編號(hào)1 ～3，使用M13 引物，進(jìn)行菌落PCR再次篩選，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，條帶大小符合（2 560 bp+目的基因）重組Bacmid 的大小，見(jiàn)圖2。挑選A1-1、A2-2、A3-1、A4-2、A5-1、A6-2、A7-2、A8-1、A9-2；B1-2、B2-3、B3-3、B4-2、B5-3、B6-2、B7-2、B8-1；C1-1、C2-1、C3-2、C4-3、C5-1、C6-3、C7-1、C8-2編號(hào)的重組菌測(cè)序，結(jié)果無(wú)突變。

圖2 陽(yáng)性重組菌的菌落PCR鑒定Fig.2 Colony PCR identification of positive recombinant bacteria

2.3 三級(jí)毒種庫(kù)的建立 A、B、C 系列的25 組重組Bacmid 桿粒轉(zhuǎn)染6 孔板中貼壁的昆蟲(chóng)細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞密度不再明顯增加，細(xì)胞發(fā)生病變，直徑變大，細(xì)胞內(nèi)折光性強(qiáng)的顆粒增多，最后脫壁死亡，見(jiàn)圖3。P0 代病毒接種懸浮培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞，細(xì)胞直徑變大，死亡，見(jiàn)圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染后貼壁細(xì)胞的顯微鏡觀察（×200）Fig.3 Microscopy of adherent cells after transfection（×200）

圖4 接種病毒后懸浮細(xì)胞的顯微鏡觀察（臺(tái)盼藍(lán)染色，×200）Fig.4 Microscopy of suspended cells after inoculation with virus（trypan blue staining，×200）

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)

2.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及接種和收獲時(shí)間的確定ExpiSf9 細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，倍增時(shí)間短；對(duì)數(shù)期長(zhǎng)，細(xì)胞密度高。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5。將B2、C4病毒分別接種至不同密度的細(xì)胞中，分泌表達(dá)量無(wú)明顯提高；接種病毒后4 d的分泌表達(dá)量明顯高于5 d。見(jiàn)表2。

表2 病毒接種至不同生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)胞不同時(shí)間的分泌表達(dá)量（mg／L）Tab.2 Secretory expression of cells at different growth stages after virus inoculation for different time duration（mg／L）

圖5 ExpiSf9細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of Expisf9 cells

2.4.2 25 種病毒的分泌表達(dá)量 ELISA結(jié)果顯示，在A 系列（S1 蛋白）中，A8 和A4（Gp67 信號(hào)肽）的表達(dá)量最高，其次是A9（N-端含HIV-ENV 信號(hào)肽）；在B系列（RBD 蛋白）中，B6（HIV-ENV 信號(hào)肽）的表達(dá)量顯著高于其他組，其次為B4（Gp67 信號(hào)肽）；在C 系列（RBD 二聚體蛋白）中，C4（Gp67 信號(hào)肽）的表達(dá)量最高，其次是C3（Gp64信號(hào)肽）。見(jiàn)表3。

表3 25種病毒培養(yǎng)上清液的分泌表達(dá)量（mg／L）Tab.3 Secretory expression of culture supernatant of 25 viruses（mg／L）

2.4.3 重復(fù)驗(yàn)證 選擇A4和A9進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，SDSPAGE 和Western blot 分析顯示，二者均有清晰的目的條帶（S1 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約75 000），表達(dá)量接近，見(jiàn)圖6。2 次傳代培養(yǎng)上清中抗原表達(dá)量一致性好，A4稍高于A9，結(jié)果與初次試驗(yàn)一致，見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)驗(yàn)證培養(yǎng)上清液的分泌表達(dá)量（mg／L）Tab.4 Secretory expression of culture supernatant in repeated verification（mg／L）

圖6 重復(fù)驗(yàn)證SDS-PAGE（A）和Western blot（B）結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）results in repeated verification

2.5 放大培養(yǎng)及純化 選擇B6放大培養(yǎng)至3 L，經(jīng)鎳柱和Strep-Tactin?XT 柱純化獲得RBD 蛋白，見(jiàn)圖7和圖8。

圖7 層析圖譜Fig.7 Chromatogram of purification

圖8 培養(yǎng)體積放大至3 L的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis after culture volume was enlarged to 3 L

3 討論

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，不同信號(hào)肽組之間分泌表達(dá)量差異明顯：A1 組（N-端為原始序列的S1-tag）的分泌表達(dá)量顯著低于A9（N-端截短S1-tag），表明S蛋白N-端序列嚴(yán)重降低了S 蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的分泌表達(dá)量；含Gp67 信號(hào)肽的3 種蛋白的分泌表達(dá)量均較高，其中S1 和RBD 二聚體蛋白分泌表達(dá)量最高的信號(hào)肽為Gp67，RBD 蛋白分泌表達(dá)量最高的是信號(hào)肽HIV-ENV，表明蛋白的氨基酸序列不同，最適信號(hào)肽在一定程度上會(huì)有差異。而C-端和N-端添加標(biāo)簽對(duì)蛋白的分泌表達(dá)無(wú)明顯影響。另外，通過(guò)增加傳代后的培養(yǎng)時(shí)間，可提高細(xì)胞密度，但接種病毒后，并不能明顯提高表達(dá)量，表明表達(dá)量的提高取決于多種因素，主要是細(xì)胞狀態(tài)及接毒后是否有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，蛋白表達(dá)時(shí)，有必要在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，特別是接種病毒后，進(jìn)行補(bǔ)料。重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量決定了工藝的難易程度、成本和產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力。影響重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量有很多因素，如改造宿主，優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)過(guò)程、調(diào)控序列、蛋白結(jié)構(gòu)等［19-22］。蛋白質(zhì)的分泌過(guò)程是關(guān)鍵步驟之一，極大地限制了重組蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。信號(hào)肽在指導(dǎo)和有效地將分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮著重要作用［23-24］。通過(guò)優(yōu)化信號(hào)肽和補(bǔ)料分批培養(yǎng)，可顯著增強(qiáng)目的蛋白的分泌和表達(dá)［25-26］。本研究結(jié)果顯示，S1 與RBD 二聚體蛋白分泌表達(dá)量最高的信號(hào)肽相同，是GP67 信號(hào)肽，而RBD 蛋白的最適信號(hào)肽是HIV-ENV 信號(hào)肽。表明N-端序列會(huì)影響蛋白的分泌，信號(hào)肽序列有一定的通用性，但也與要表達(dá)的目的蛋白序列有關(guān)。