劉玉國，羅惠瑜，林鳳涓，王潔嫻，莫嘉琦，蘇楚紅，陳俊斌，鄭鐘黛西，查龍應(yīng)

南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系廣東省熱帶病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515

外泌體是一種由各種活細(xì)胞分泌的直徑為30 ～200 nm 的細(xì)胞外囊泡。外泌體經(jīng)內(nèi)吞-融合-外排等一系列復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制產(chǎn)生，通過主動分泌方式排出細(xì)胞膜外，具備脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，能穩(wěn)定存在于血液、尿液、乳汁等各種體液中［1］。一般而言，外泌體呈茶托樣或雙凹碟形，在人體體液中呈球狀［2］。

1983 年，PAN 等［3］首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體，最初被認(rèn)為是細(xì)胞排泄的廢棄物。之后發(fā)現(xiàn)，來源于B 細(xì)胞的外泌體能夠激活T 細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、二代測序等技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類、核酸（miRNA、mRNA、DNA 等）等生物分子，且由于外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，包裹在其內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物分子能保持穩(wěn)定活性，當(dāng)其被轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞時(shí)，能被受體細(xì)胞攝取，進(jìn)而調(diào)控受體細(xì)胞功能，發(fā)揮細(xì)胞間通訊作用［2］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在疾病的預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后判定中具有良好的應(yīng)用前景，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)領(lǐng)域［4-6］。

巨噬細(xì)胞是在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的免疫細(xì)胞，分布廣，可塑性強(qiáng)，應(yīng)激條件下可極化為M1、M2型等巨噬細(xì)胞亞型［7］。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β 等）誘導(dǎo)機(jī)體炎癥的發(fā)生，也可在機(jī)體炎癥恢復(fù)過程中，產(chǎn)生促纖維化因子、血管內(nèi)皮生長因子等，從而積極抑制炎癥并促進(jìn)組織修復(fù)［8-9］。最新研究顯示，巨噬細(xì)胞可通過外泌體介導(dǎo)某些疾病的發(fā)生發(fā)展，將經(jīng)IL-4極化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體注射入ApoE-／-小鼠中，可緩解其動脈粥樣硬化程度［10］；巨噬細(xì)胞外泌體可明顯減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎［11］，可提供一個(gè)促炎環(huán)境，通過caspase-3 介導(dǎo)的途徑增強(qiáng)抗腫瘤活性，并可作為載體將紫杉醇運(yùn)輸至腫瘤組織中，增強(qiáng)藥物抗腫瘤作用［12］。以上研究表明，外泌體也是巨噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞間通訊的重要方式。但目前研究中使用的巨噬細(xì)胞外泌體多分離自傳代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞外泌體方面的研究較少。

原代巨噬細(xì)胞剛從體內(nèi)轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)尚具有一部分體內(nèi)活性，比起遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變的細(xì)胞系，能更加真實(shí)地反映體內(nèi)細(xì)胞的代謝情況［13］。原代腹腔巨噬細(xì)胞是一種分化較為成熟的細(xì)胞，體外培養(yǎng)分裂增殖速度十分緩慢［14］。傳統(tǒng)方法分離外泌體需較大數(shù)量的細(xì)胞，因此提取原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體成本較高。本研究建立了一種高效提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及其外泌體的方法，可制備足夠數(shù)量的小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞及其外泌體，為后續(xù)原代巨噬細(xì)胞外泌體生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 潔凈級C57BL／6 小鼠，雄性，5 只，8 ～10 周齡，體質(zhì)量為22 ～25 g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：44007200093999。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行小鼠養(yǎng)殖和使用，且按照南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（SMUL2020133）。

1.2 主要試劑及儀器 巰基乙酸鹽培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自中國廣州沛瑜生物科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素購自美國Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購自廣州依科賽生物科技有限公司（Excell）；5×上樣緩沖液、牛血清蛋白和脫脂奶粉購自美國Panera 公司；RIPA 裂解液購自蘇州凱基生物技術(shù)股份有限公司；蛋白酶抑制劑和PMSF 購自美國Sigma 公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量測定試劑盒購自南京百泰克生物技術(shù)有限公司；ExoQuick TC 外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；兔抗鼠TSG101、CD9和β-actin單抗購自美國ProteintechGroup公司；兔抗鼠CD63單抗購自美國Santa cruz公司；AP-F4／80+購自美國Biolegend 公司；羊抗兔IgG 二抗購自美國CST 公司；流式細(xì)胞儀（BD LSRFORTESSA X-20）購自美國BD公司；納米顆粒跟蹤分析儀購自德國Particle Metrix公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 巰基乙酸鹽培養(yǎng)基溶液 取3 g 巰基乙酸鹽培養(yǎng)基溶于100 mL 去離子水中，于121 ℃，20 min 滅菌，配制成3%巰基乙酸鹽培養(yǎng)基。

1.3.2 完全培養(yǎng)基 在高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入FBS和青霉素-鏈霉素，配制成含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基。

1.3.3 無外泌體完全培養(yǎng)基 將FBS于4 ℃，100 000×g超速離心18 h；棄沉淀，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌，獲得無外泌體血清，將其和青霉素-鏈霉素加入高糖DMEM 培養(yǎng)基中，配制成含10%無外泌體血清和1%青霉素-鏈霉素的無外泌體完全培養(yǎng)基。

1.3.4 裂解液 在RIPA 裂解液中加入1% PMSF 和1%蛋白酶抑制劑。

1.4 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的提取 經(jīng)小鼠腹腔注射3%巰基乙酸鹽培養(yǎng)基溶液，1 mL／10 g，觀察72 h；斷頸處理后，浸入75%酒精消毒5 min；固定小鼠，剪開腹部表皮，暴露腹膜（腹膜需保持完整），用5 mL無菌注射器腹腔注射5 mL 完全培養(yǎng)基，腹部按摩10 min，用5 mL無菌注射器于左下腹進(jìn)針，回抽完全培養(yǎng)基（約4 mL）至無菌離心管中；用5 mL 無菌注射器繼續(xù)腹腔注射5 mL 無菌PBS，腹部按摩5 min，用5 mL 無菌注射器于左下腹進(jìn)針，回抽PBS（約5 mL）至無菌離心管中，獲得9 mL淡黃色細(xì)胞懸液。

1.5 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的純化 將細(xì)胞懸液于500×g離心10 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪板于60 mm 培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁2 h，進(jìn)行換液，去除未貼壁紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，獲得純化的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量。

1.6 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞純度分析 采用流式細(xì)胞術(shù)。將純化后的巨噬細(xì)胞用預(yù)冷PBS 吹打、收集至避光無菌離心管中，用APC-F4／80+熒光抗體常溫孵育30 min；上流式細(xì)胞儀，檢測帶有熒光的細(xì)胞的比例，結(jié)果經(jīng)FlowJo 10軟件分析。

1.7 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體的提取 對純化后的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行換液，PBS 洗滌3次（充分去除完全培養(yǎng)基含有的外泌體），加至無外泌體完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞24 h；收集上清液，4 ℃，3 000×g離心15 min；收集上清液，按體積分?jǐn)?shù)1∶5加入ExoQuick TC外泌體提取試劑盒試劑，上下顛倒，輕彈離心管混勻，4 ℃放置過夜（12 h 以上）；4 ℃，1 500 ×g離心30 min；棄上清，用100 μL 無菌PBS重懸沉淀，獲得外泌體懸液，于-80 ℃保存。

1.8 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體含量的測定 于外泌體懸液中加入等量裂解液，冰上裂解15 min；4 ℃，12 000×g離心5 min；取上清液，采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測外泌體蛋白濃度。

1.9 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體形態(tài)的透射電鏡觀察 取外泌體懸液10 μL，滴加至銅網(wǎng)上沉淀1 min；濾紙吸去浮液，取醋酸雙氧軸10 μL，滴加至銅網(wǎng)上沉淀1 min；濾紙吸去浮液，常溫干燥數(shù)分鐘。在100 kV進(jìn)行透射電鏡檢測成像。

1.10 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體粒徑分析 取凍存的外泌體懸液，室溫解凍，待樣品溫度達(dá)25 ℃時(shí)放置2 min后，用納米顆粒跟蹤分析儀檢測粒徑。

1.11 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體標(biāo)志物的鑒定在裂解后的外泌體懸液中按體積分?jǐn)?shù)1∶5 加入5×上樣緩沖液，95 ℃金屬浴孵育7 min，待冷卻后，根據(jù)BCA試劑盒測定結(jié)果，取80 g蛋白上樣，經(jīng)12%SDSPAGE 分離后，以CD9、TSG101、β-actin、CD63 抗體為一抗（1∶500稀釋），羊抗兔IgG為二抗（1∶5000稀釋），進(jìn)行Western blot分析

1.12 數(shù)據(jù)采集及分析 使用一體式酶標(biāo)儀（Limited ELX808）采集數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)特征 腹腔注射巰基乙酸鹽肉湯可分離獲得足夠數(shù)量的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，約5×106個(gè)／只；倒置顯微鏡下觀察可見，細(xì)胞形態(tài)為圓形或卵圓形，貼壁純化培養(yǎng)3 d，細(xì)胞伸出偽足黏附在培養(yǎng)皿上，符合巨噬細(xì)胞形態(tài)特征。見圖1。

圖1 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的顯微鏡觀察Fig.1 Microscopic morphology of mouse primary peritoneal macrophages

2.2 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞純度 F4／80+陽性細(xì)胞占比為（99.17 ± 0.65）%，見圖2。表明貼壁純化后的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞純度較高。

圖2 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞F4／80+的表達(dá)情況Fig.2 Expression of F4／80+ in mouse primary peritoneal macrophages

2.3 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體含量 外泌體蛋白濃度為4.347 μg／μL，體積為200 μL，外泌體總蛋白為869 μg。

2.4 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體形態(tài) 透射電鏡觀察可見，小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞為折光性較強(qiáng)、茶托樣形態(tài)的囊泡狀結(jié)構(gòu)，粒徑約100 nm，呈典型的外泌體形態(tài)，見圖3。

圖3 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體形態(tài)的透射電鏡觀察（×60 000）Fig.3 Morphologyofexosomesfrom mouseprimaryperitoneal macrophages under transmission electron microscope（×60 000）

2.5 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體粒徑 外泌體粒徑分布集中在100 ～200 nm，平均為175.2 nm，見圖4。表明分離提取的外泌體符合外泌體粒徑標(biāo)準(zhǔn)，且純度較高。

圖4 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體粒徑Fig.4 Particle size of exosomes from mouse primary peritoneal macrophages

2.6 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體標(biāo)志物 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞外泌體中高表達(dá)外泌體特異性標(biāo)志物TSG101、CD63 和CD9，且不表達(dá)或低表達(dá)β-actin，見圖5。表明提取的外泌體純度較高，且未受到細(xì)胞及細(xì)胞碎片污染。

圖5 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體標(biāo)志物的Western blot分析Fig.5 Marker identification in exosomes from mouse primary peritoneal macrophages by Western blot

3 討論

外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn)其內(nèi)含物（蛋白質(zhì)、脂類、核酸等）發(fā)揮細(xì)胞間通訊功能，作為新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間通訊的一種新方式，已成為近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域［15］。外泌體主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體［16］。外泌體的功能主要取決于其內(nèi)含物，而外泌體包含內(nèi)含物的過程并不是隨機(jī)的，而是具有嚴(yán)格的篩選機(jī)制。研究表明，細(xì)胞所處的生理或病理狀態(tài)是影響外泌體內(nèi)含物及其功能的主要因素［2］。

外泌體相關(guān)研究的一個(gè)重要前提是需要獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，由于傳代細(xì)胞的無限傳代和增殖快速特性，已被廣泛應(yīng)用于外泌體相關(guān)研究。但傳代細(xì)胞與原代培養(yǎng)細(xì)胞的大多數(shù)蛋白質(zhì)分布不對稱，且許多蛋白質(zhì)在細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)［17］。由于原代細(xì)胞離體時(shí)間短，未經(jīng)過永生化過程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍能保持原有的遺傳特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)及活性［13，18］。外泌體作為一種具有生物學(xué)活性的細(xì)胞間通訊工具，受到其母源細(xì)胞狀態(tài)的直接影響。因此，分離純化原代細(xì)胞分泌的外泌體，能夠?yàn)檎鎸?shí)地反映外泌體的特征及其生物學(xué)作用提供研究材料。

直接灌洗法是一種被廣泛用于分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的經(jīng)典成熟方法，但直接灌洗小鼠腹腔獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，且離體培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)較差。因此，本研究預(yù)先給小鼠腹腔注射巰基乙酸鹽肉湯，募集血液中的巨噬細(xì)胞至腹腔，大大增加了巨噬細(xì)胞的提取數(shù)量。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，注射了巰基乙酸鹽肉湯后提取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有有2個(gè)亞群，分別為腹腔駐留巨噬細(xì)胞和血液募集進(jìn)入腹腔的單核巨噬細(xì)胞，二者的一些蛋白表達(dá)雖略有差異［19］，但依然具有相似的吞噬功能［20］。因此，注射巰基乙酸鹽肉湯可顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞的獲取數(shù)量，但是否會影響后續(xù)試驗(yàn)仍需進(jìn)一步探討。

隨著外泌體研究的不斷深入，涌現(xiàn)出較多分離純化外泌體的方法，常用的包括超速離心法、PEG 沉淀法、免疫磁珠法、試劑盒法。超速離心法提取的外泌體純度最高，但其產(chǎn)量卻大大降低［21］；PEG 沉淀法獲得的外泌體雜蛋白較多，純度很低；免疫磁珠法成本較高，且提取過程中pH 值和鹽濃度可能會改變外泌體的生物活性［22-23］。本研究最初使用傳統(tǒng)的超速離心法提取小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體，結(jié)果并不理想，Western bolt法很難檢測到其標(biāo)記蛋白，可能是由于原代腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量少，或者其離體培養(yǎng)后，狀態(tài)逐漸變差，外泌體分泌量減少。因此，本研究采用ExoQuick TC 外泌體試劑盒提取的腹腔原代巨噬細(xì)胞外泌體，作用于細(xì)胞不會對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，并且該試劑盒提取的外泌體與傳統(tǒng)的超離方法提取的外泌體最為接近［24-26］。本研究從5 mL小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中可獲得蛋白含量為869 μg的外泌體，通過電鏡、粒徑分析和Western blot綜合鑒定其符合外泌體典型特征，且純度較高，而采用超離方法分離Raw264.7 傳代小鼠巨噬細(xì)胞的外泌體，從325 mL 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中僅能獲得446 μg外泌體。因此，ExoQuick TC 外泌體試劑盒更適用于小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞外泌體的提取。