孟清霞，許項(xiàng)可 綜述，安文玨，張珂，2 審校

1.華蘭生物疫苗股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.華蘭生物工程股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎球菌［學(xué)名腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis，Nm）］感染引起的一種呼吸道傳染病，該病傳染性強(qiáng)、起病急、病情重，從發(fā)現(xiàn)病因至今已有百余年歷史，因其發(fā)病率和病死率高而備受關(guān)注［1-2］。在腦膜炎球菌13個(gè)血清群中，引起疾病最主要的血清群為A、B、C、W135、X和Y群［3-6］。

由于腦膜炎球菌莢膜多糖大多具有良好的抗原性，將其提純制備多糖疫苗，能有效預(yù)防流腦［7-8］。但多糖抗原一般屬于T 細(xì)胞非依賴性抗原，其免疫效果與接種人群年齡相關(guān)［9］。因2 歲以內(nèi)嬰幼兒免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全，接種多糖疫苗后，不能有效激活Th 細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞，因此不能誘導(dǎo)免疫記憶產(chǎn)生，機(jī)體免疫保護(hù)時(shí)間較短，即使2 次接種也不能加強(qiáng)免疫反應(yīng)。為解決該問題，研究人員將多糖與載體蛋白制備成多糖結(jié)合物原液，再配制成多糖結(jié)合疫苗，接種后能刺激B 細(xì)胞對多糖產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并促使T細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶，從而使B細(xì)胞產(chǎn)生更多的特異性抗體［10-12］。

本文就腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗制備的影響因素、多糖與載體蛋白的結(jié)合方式、國內(nèi)外研究以及制備過程中存在的問題進(jìn)行綜述。

1 影響因素

1.1 多糖結(jié)構(gòu) 多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈組成的碳水化合物。很多研究表明，糖鏈長度與其抗原性和免疫原性相關(guān)［13-14］。結(jié)構(gòu)較長的糖鏈能夠容易形成構(gòu)象表位，刺激B細(xì)胞，從而產(chǎn)生數(shù)量較多的抗體；結(jié)構(gòu)較短的糖鏈易激活T 細(xì)胞，使Th 細(xì)胞更好地輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體［15］。每種多糖結(jié)構(gòu)不同，糖鏈長短不一，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)，可能有些暴露在外部的位點(diǎn)與蛋白結(jié)合，還有些可能自身發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

1.2 載體蛋白在制備多糖結(jié)合疫苗時(shí)，選取的載體蛋白有破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）、白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）、白喉毒素自然突變體CRM-197、腦膜炎球菌外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）、流感嗜血桿菌D 蛋白（protein D，PD）等。這些蛋白與多糖按一定比例結(jié)合后，能顯著提高多糖免疫原性。佟巍等［16］研究結(jié)果顯示，以TT 及DT 為載體制備的A、C、Y、W135群四價(jià)腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗均具有良好的免疫原性，TT略優(yōu)于DT。

CRM197 為野生型白喉毒素的第52 位甘氨酸突變?yōu)楣劝彼岬漠a(chǎn)物，突變后的CRM197保留了T輔助表位且毒性消失。該載體蛋白最早應(yīng)用于C 群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗。接種后的結(jié)果表明，C 群腦膜炎的發(fā)病率在各年齡階段均降低，表明該疫苗對預(yù)防C 群腦膜炎具有顯著效果［17］。在近年臨床免疫原性研究中，多糖與CRM197 結(jié)合后的免疫效果不如TT。JONKER 等［18］研究了在成人體中注射A、C、Y、W135-CRM197和A、C、Y、W135-TT群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的安全性和免疫原性，結(jié)果顯示，注射A、C、Y、W135-TT 群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的人群抗體水平更高。

MICOLI 等［19］報(bào)道了MeNZB 外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）疫苗成功控制了新西蘭B 型腦膜炎的暴發(fā)后，又開發(fā)了含有OMV 的4 組分4CMenB，針對B 型菌株腦膜炎球菌提供了更廣泛的保護(hù)。SEMCHENKO 等［20］在新西蘭接種MeNZB 后，不僅降低了B 型腦膜炎的發(fā)病率，同時(shí)還降低了淋病發(fā)病率。研究表明，MeNZBOMV 抗原之間與淋球蛋白具有高度相似的序列。接種MeNZB 后，同時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)抗淋球菌抗體產(chǎn)生，阻礙了淋病發(fā)病。

王麗嬋等［21］研究了PD 作為A 群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗蛋白載體的免疫效果，發(fā)現(xiàn)PD 與A群多糖結(jié)合后能增強(qiáng)多糖免疫原性，既可提高體液免疫反應(yīng)能力，又可激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示PD 具備作為A群腦膜炎球菌多糖蛋白載體的潛力。

1.3 多糖與蛋白比值 當(dāng)多糖與蛋白比值較低時(shí)，誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的效率也較低，而比值較高時(shí)，可能會(huì)掩蓋部分載體表位，導(dǎo)致反應(yīng)不充分［22-23］。主要應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①每種多糖與載體蛋白結(jié)合時(shí)，應(yīng)有最適比值；②應(yīng)根據(jù)最適比值確定加量；③反應(yīng)結(jié)束后，去除未參與反應(yīng)物質(zhì)；④長期存放的多糖結(jié)合物可能會(huì)部分解離，進(jìn)而改變多糖與蛋白比值。

2 結(jié)合方式

目前上市的多糖結(jié)合疫苗基本采用化學(xué)結(jié)合方式，主要的化學(xué)反應(yīng)包括還原胺化、酰胺縮合和硫醚縮合等。多糖與載體蛋白結(jié)合最常用的方式為酰胺縮合反應(yīng)，是利用溴化氰（CNBr）活化多糖，即在堿性條件下CNBr與多糖分子上的鄰位順式羥基（-OH）反應(yīng)，形成氰酸酯，再與加入的己二酰肼（ADH）反應(yīng)，氰酸酯中的碳氧鍵斷裂，與ADH 的氨基發(fā)生加成反應(yīng)，將酰肼基團(tuán)導(dǎo)入多糖分子，形成多糖衍生物。多糖蛋白結(jié)合時(shí)，在碳二亞胺（EDAC）的催化作用下，連接在多糖分子上ADH 一端的氨基（-NH2）與TT一端的羧基（-COOH）共價(jià)結(jié)合，形成多糖-蛋白結(jié)合物。酰胺縮合反應(yīng)通過CNBr 活化多糖引入了酰肼基團(tuán)，該基團(tuán)比多糖的氨基具有更高的親核反應(yīng)性，更易與蛋白分子上的羧基縮合，且由于多糖與蛋白以共價(jià)鍵形式結(jié)合，制備的結(jié)合疫苗穩(wěn)定性較高，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。

除CNBr活化多糖外，還可采用高碘酸鹽氧化［24］。高碘酸鹽氧化是采用高碘酸鈉（NaIO4）作用于糖上的鄰位羥基，將鄰位羥基氧化成C=O，同時(shí)切斷C-C單鍵。國外使用的活化劑除上述2種試劑，還包括1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸鹽（CDAP），在pH為7 ～9時(shí)活化多糖羥基［25］。

結(jié)合方式除化學(xué)結(jié)合外，還有生物合成法。疫苗主要通過工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)以及一步純化制備，多糖與蛋白的偶聯(lián)由細(xì)菌自身完成［26］。王磊［27］應(yīng)用生物合成法“一站式”制備宋內(nèi)志賀菌多糖蛋白結(jié)合疫苗，即利用基因工程手段敲除宋內(nèi)菌S7 株的O-抗原連接酶基因（waaL）構(gòu)建S7waaL 表達(dá)菌株，將糖基化系統(tǒng)質(zhì)粒pET28a-PglL-CTB4573C導(dǎo)入表達(dá)菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后制備CTB-OPS 宋內(nèi)志賀菌多糖蛋白結(jié)合疫苗。結(jié)果顯示，CTB-OPS 可在S7waaL 內(nèi)成功表達(dá)，經(jīng)純化后獲得高純度樣品。BALB／c 小鼠免疫試驗(yàn)證明，CTB-OPS 具有約72.5%的保護(hù)力。但生物合成法也存在問題，如糖基轉(zhuǎn)移酶的適用性、載體蛋白的選擇和優(yōu)化以及多糖的表達(dá)等。

3 國內(nèi)外現(xiàn)狀

3.1 國內(nèi)現(xiàn)狀 我國上市國產(chǎn)流腦多糖結(jié)合疫苗見表1，在研國產(chǎn)流腦多糖結(jié)合疫苗見表2。國產(chǎn)及國內(nèi)在研流腦多糖結(jié)合疫苗大部分采用酰胺縮合方法制備，即先活化多糖，ADH 為連接劑，在EDAC 催化下共價(jià)結(jié)合載體蛋白，結(jié)合所用活化劑為CNBr，載體蛋白為TT和CRM197。

表1 國內(nèi)上市流腦多糖結(jié)合疫苗Tab.1 Polysaccharide conjugate vaccines of Nm approved in China

表2 國產(chǎn)在研流腦多糖結(jié)合疫苗Tab.2 Polysaccharide conjugate vaccines of Nm under development in China

3.2 國外現(xiàn)狀 國外流腦多糖結(jié)合疫苗上市情況見表3［28-31］。國外流腦多糖結(jié)合疫苗上市時(shí)間均早于國內(nèi)，大多數(shù)采用還原胺化和酰胺縮合制備，使用的載體也為DT、TT和CRM197。

表3 國外上市流腦多糖結(jié)合疫苗Tab.3 Polysaccharide conjugate vaccines of Nm in international market

根據(jù)GlobalData數(shù)據(jù)，國外上市的腦膜炎球菌多糖疫苗，除B 群腦膜炎球菌為單群多糖疫苗外，還有MenC 和MenACWY 結(jié)合疫苗。葛蘭素史克（GSK）研制的Bexsero 疫苗是唯一可用于常規(guī)兒童免疫的疫苗。其他大部分腦膜炎球菌疫苗主要來自GSK、輝瑞（Pfizer）和賽諾菲（Sanofi）3 家公司。在大多數(shù)國家接種的腦膜炎球菌多糖疫苗或多糖結(jié)合疫苗，至少是2個(gè)不同種類的疫苗。

四價(jià)MenACWY 疫苗主要包括Sanofi 的Menactra、GSK 的Menveo 和Pfizer 的Nimenrix。Sanofi 的Menactra 是美國疫苗市場主要銷售的疫苗，目前約占75%的銷售額。Menactra 疫苗結(jié)合的載體為DT，Menveo疫苗結(jié)合的載體蛋白為CRM197，Nimenrix疫苗結(jié)合的載體為TT。在流腦暴發(fā)初期，Menveo 和Nimenrix疫苗均有免疫效果，但注射Nimenrix疫苗后能產(chǎn)生更高、更持久的抗體。

近兩年Sanofi 進(jìn)行了利用TT 作為載體的Men-Quadfi 疫苗的研制，相較于Menactra 疫苗，會(huì)提供更長久的保護(hù)。

國外對流腦多糖結(jié)合疫苗的研究除A、C、Y、W群，還增加了B 和X 群，見表4。正在研發(fā)的五價(jià)ABCWY 疫苗均為市場上MenACWY 和MenB 疫苗的組合，分別由GSK 的Menveo 和Bexsero 及Pfizer 的Nimenrix 和Trumenba 組成。GSK 從諾華公司獲得了五價(jià)候選疫苗（GSK3536819A），至今已完成7 項(xiàng)Ⅱ期臨床研究，結(jié)果表明，MenABCWY 誘導(dǎo)的抗體水平與Menveo差異較小，且安全性好，可預(yù)防多種B群腦膜炎球菌引起的疾?。?2］；在接種2 劑疫苗后4 年，抗體水平下降，但仍高于接種前水平，4 年后加強(qiáng)免疫可快速提高體內(nèi)抗體水平［33］。

表4 國外部分在研流腦多糖結(jié)合疫苗Tab.4 Some foreign polysaccharide conjugate vaccines of Nm under development

Pfizer 公司正在進(jìn)行MenABCWY 疫苗的Ⅲ期臨床研究，預(yù)計(jì)將成為全球首款五價(jià)腦膜炎球菌疫苗。

4 存在問題

隨著多糖結(jié)合疫苗的應(yīng)用，流腦的發(fā)病率已大大降低［34-37］。我國2015—2019年流腦報(bào)告病例540例，年均發(fā)病率為0.78／1 000 萬［38］，2020 和2021 年報(bào)告病例分別為50 和63 例［39-40］。但在疫苗生產(chǎn)中仍面臨較多問題：在制備方面，涉及超濾、層析、過濾等多步純化，導(dǎo)致產(chǎn)率較低，生產(chǎn)成本增加，疫苗價(jià)格較高，不能在發(fā)展中國家和非發(fā)達(dá)國家普及應(yīng)用；在產(chǎn)品質(zhì)量方面，多糖糖鏈長短不一，每種多糖抗原性不同，多糖與蛋白間的連接位點(diǎn)及數(shù)量也不明確，有可能自身發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，質(zhì)量控制相對較難；在環(huán)保方面，大規(guī)模培養(yǎng)致病菌和使用活化劑CNBr 對環(huán)境可能造成不可逆改變。因此，雖然多糖結(jié)合疫苗已取得了巨大成就，但面臨的上述問題仍亟待解決。

5 小結(jié)與展望

目前國內(nèi)主要接種的為腦膜炎球菌多糖疫苗，隨著A 群C 群和ACYW135 群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的上市，選擇結(jié)合疫苗，不僅能減少接種次數(shù)，還能提供更好、更持久的保護(hù)。國際市場上已經(jīng)從接種MenC 疫苗轉(zhuǎn)向接種多價(jià)結(jié)合的MenACWY 和MenB 疫苗。隨著流腦結(jié)合疫苗研究的不斷深入，開發(fā)多價(jià)結(jié)合疫苗可能成為以后的趨勢。GlobalData數(shù)據(jù)顯示，GSK 和Pfizer 的MenABCWY 疫苗預(yù)計(jì)在2024年上市。

在疫苗研發(fā)過程中，應(yīng)在充分考慮疫苗生產(chǎn)規(guī)模放大、生產(chǎn)工藝變更、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)品特征指標(biāo)等基礎(chǔ)上，確保變更后工藝對疫苗安全性和有效性不造成影響。除此之外，還應(yīng)考慮純化工藝對雜質(zhì)去除效果以及疫苗主要成分結(jié)構(gòu)的變化［41］。對于結(jié)合疫苗，可進(jìn)行官能團(tuán)狀態(tài)和功能的研究分析，如測定從多糖活化開始至多糖／蛋白結(jié)合物形成后各步驟的多糖結(jié)構(gòu)，分析每一步多糖結(jié)構(gòu)的變化；測定未結(jié)合的活化基團(tuán)含量；分析多糖與蛋白的結(jié)合方式等。

mRNA 疫苗特別是其脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LNP）遞送功能在開發(fā)蛋白、多肽抗原靶抗原疫苗上具有巨大潛力［42］。2022 年9 月29 日，印度尼西亞國家食品藥品監(jiān)管局宣布，授予由云南沃森生物技術(shù)股份有限公司和蘇州艾博生物科技有限公司2家公司采用生物技術(shù)共同研發(fā)的mRNA疫苗AW-corna緊急使用授權(quán)（Emergency Use Authorization，EUA），用于18 周歲及以上人群通過主動(dòng)免疫預(yù)防新型冠狀病毒感染?，F(xiàn)有mRNA 疫苗技術(shù)雖暫不能直接用于多糖、多糖結(jié)合靶抗原疫苗研制，但由于機(jī)體內(nèi)多糖均由具體酶促反應(yīng)合成，多糖與載體蛋白結(jié)合理論上也可借酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)［43-45］。未來將進(jìn)一步開發(fā)編碼多糖合成過程所需各種酶的mRNA 技術(shù)、體內(nèi)直接偶聯(lián)多糖與載體蛋白的酶，從而一步合成多糖蛋白結(jié)合疫苗。