王建，胡紫微 綜述，鄭柏松 審校

吉林大學(xué)第一醫(yī)院艾滋病與病毒研究所，吉林 長春 130000

正痘病毒屬（Orthopoxvirus）包括猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）、痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）、天花病毒（variola virus，VARV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）等17 個同屬病毒［1］。以VACV 為代表的正痘病毒是一種大型線性雙鏈DNA 病毒，呈橢圓形或磚形，外附脂蛋白外膜。VACV 基因組大小約為200 000 bp，編碼約209 個基因產(chǎn)物［2］。病毒基因組包含1個高度保守的中心編碼序列（central coding region sequence，CRS）區(qū)域，可編碼病毒形態(tài)發(fā)生各時期的關(guān)鍵蛋白［3］。CRS 兩側(cè)可變區(qū)含有反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs），包含決定宿主范圍和毒力的基因［3］。

VACV的生命周期起始于病毒表面的膜蛋白與細(xì)胞表面附著，隨后進(jìn)行膜融合。成熟病毒粒子（intracellular mature virus，IMV）進(jìn)入細(xì)胞后，在病毒工廠進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，并開始組裝［4］。多數(shù)組裝完整的IMV 在細(xì)胞裂解時被釋放，也可通過微管移動至內(nèi)體或反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（transGolgi network，TGN）中，經(jīng)雙層膜包裹，成為細(xì)胞內(nèi)囊膜病毒粒子（intracellular enveloped virus，IEV）；IEV 在微管的介導(dǎo)下到達(dá)細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜融合后附著于質(zhì)膜上，稱為細(xì)胞相關(guān)囊膜病毒粒子（cell-associated enveloped virus，CEV）；CEV 在肌動蛋白尾的作用下脫離細(xì)胞并在細(xì)胞間傳播，稱為細(xì)胞外囊膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV）［5-6］。IMV和EEV是VACV兩種主要感染形式，但EEV 和CEV 最外層附加膜中含有約7種不同于IMV的蛋白［7］。A33R、A34R、A56R、B5R和F13L 存在于IEV、CEV 和EEV 中，而A36R 和F12L僅存在于IEV 中［4］。近年，對VACV 的基因組序列組成、病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能、病毒蛋白間相互作用和形態(tài)發(fā)生過程等的研究已逐步深入，本文就包膜蛋白在VACV 形態(tài)發(fā)生過程中作用的研究進(jìn)展作一綜述，以期為進(jìn)一步研究VACV 的致病機(jī)理，有效預(yù)防VACV感染及疫苗研制提供理論依據(jù)。

1 VACV包膜蛋白在膜附著和膜融合中的作用

研究表明，VACV 對細(xì)胞的侵入過程分為膜附著和膜融合兩個階段，包膜蛋白A27L 和A28L 在入侵過程中發(fā)揮重要作用。VAZQUEZ 等［8］通過A27L蛋白基因表達(dá)缺陷的重組病毒體試驗發(fā)現(xiàn)，在病毒附著及后續(xù)的膜融合中，A27L 蛋白均發(fā)揮了重要作用。A27L 蛋白是由110 個氨基酸組成的膜融合蛋白，由N-末端表面肝素結(jié)合功能域（heparin-binding sequence，HBS）、二硫鍵連接結(jié)構(gòu)域（disulfide-linked domain，DLD）、C-末端亮氨酸拉鏈域（leucine zipper domain，LZD）、柔性間隔區(qū)和螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（α-helical coiled-coil domain，CCD）等5 個功能域構(gòu)成［6，9］。其中，N-末端的HBS（21～32位殘基）呈KKPE片段折疊樣結(jié)構(gòu)，可通過糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）與細(xì)胞表面的肝素分子發(fā)生特異性結(jié)合，促進(jìn)病毒附著于細(xì)胞膜上［10-11］，而A27L 蛋白C-末端的LZD（85～110位殘基）通過與A17L蛋白N-末端的F1（32～36 位殘基）和F2（20～29 位殘基）位點發(fā)生特異性相互作用，錨定在IMV 膜表面［12-13］。因此，A27L 蛋白的缺失或點突變會減少病毒對細(xì)胞的侵染，使感染突變株病毒的單層細(xì)胞呈小斑塊表型，EEV產(chǎn)生減少［14］。

另外，A28L 還介導(dǎo)了病毒與細(xì)胞的融合。SENKEVICH 等［15］發(fā)現(xiàn)，A28L 缺陷型的重組病毒體僅可進(jìn)行單輪復(fù)制，產(chǎn)生的缺陷病毒具有膜融合相關(guān)缺陷，不能再次進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)性感染。含146 個氨基酸的A28L蛋白在病毒復(fù)制周期后期表達(dá)，其N-末端將該蛋白錨定在IMV 的膜表面，其他部分則暴露在病毒顆粒表面［16］。相關(guān)研究表明，在IMV 膜的胞質(zhì)內(nèi)，A28L 蛋白通過正痘病毒特異性的氧化還原途徑形成2個分子內(nèi)二硫鍵［16］。

2 VACV包膜蛋白在病毒粒子組裝中的作用

包膜蛋白A17L 和A13L 參與了病毒粒子的組裝過程，并發(fā)揮重要作用。WOLFFE 等［17］通過A17L 缺陷型的重組病毒體證明，A17L 蛋白缺失會導(dǎo)致病毒粒子早期形態(tài)發(fā)生阻斷，此時，電鏡下僅能觀察到致密的電子結(jié)構(gòu)，未觀察到新月形膜結(jié)構(gòu)。在病毒組裝的早期，含203 個氨基酸的A17L 前體蛋白利用其N-末端結(jié)構(gòu)將支架蛋白D13L 錨定在新月體膜上［18］。A17L N-末端和C-末端的AGX共識基序經(jīng)I7L 蛋白酶酶切，釋放D13L 蛋白，使未成熟病毒粒子（immature virus，IV）向IMV轉(zhuǎn)變［19］。而A17L蛋白C-末端受其他蛋白酶切割，可在F10L 激酶的作用下發(fā)生磷酸化反應(yīng)［20］。另外，A17L 單體通過與Cys178形成的分子間二硫鍵連接為同源二聚體，并與A27L 和A14L 蛋白共同形成穩(wěn)定的復(fù)合物，在IMV 的雙層膜包裹中發(fā)揮重要作用［21］。

感染后期表達(dá)A13L 蛋白是病毒粒子組裝不可缺的過程。研究發(fā)現(xiàn)，A13L 缺失會導(dǎo)致病毒形態(tài)發(fā)生停滯在IV 向IMV 轉(zhuǎn)變的過渡期，影響病毒粒子的生命周期進(jìn)程［22］。A13L 蛋白是由70 個氨基酸組成的IMV 表面Ⅱ型膜蛋白，其N-末端（1～20 位殘基）包含1 個肉豆蔻?；颍欣谠摰鞍滓怨卜g的方式插入至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基中間室，并在膜包裹過程中成為IMV表面的膜組分［22］。而其C-末端特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使該蛋白從IMV 膜內(nèi)部延伸至表面，成為第1個出現(xiàn)在IMV內(nèi)外膜表面的蛋白質(zhì)［23］。

3 VACV包膜蛋白在IMV胞內(nèi)運(yùn)動中的作用

IMV 在病毒工廠組裝完成后，移動至TGN，包裹雙層膜成為IEV，再移動至細(xì)胞膜附近進(jìn)行出膜。這些胞內(nèi)運(yùn)動均依賴于細(xì)胞內(nèi)的微管，而組成微管的驅(qū)動蛋白-1 又與A36R 包膜蛋白存在密切的相互作用。

A36R 蛋白是IEV 外表面的一種特異性非糖基化跨膜蛋白，含有2個以色氨酸為基礎(chǔ)的驅(qū)動蛋白-1結(jié)合基序，即WD（97～98位殘基）和WE（64～65位殘基），是A36R蛋白募集驅(qū)動蛋白-1所必需的基序［24］。驅(qū)動蛋白-1 由2 條重鏈（kinesin heavy chain，KHC）和2 條輕鏈（kinesin light chain，KLC）組成。A36R 蛋白的WD／WE 基序與驅(qū)動蛋白-1 亞型KLC1 C-末端的四肽重復(fù)序列（tetratricopeptide repeat region of the kinesin light chain，KLC-TPR）相互作用，并優(yōu)先結(jié)合KLC1［24］。

HERRERO-MARTINEZ 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A36R蛋白缺失時，IEV仍可沿微管運(yùn)動至細(xì)胞外形成CEV，并可受微管解聚藥物的可逆性抑制，推測還有其他蛋白作用于微管并輔助IEV 的運(yùn)動。另有研究證明，A27L蛋白參與了微管依賴的IEV胞內(nèi)運(yùn)動，協(xié)助IMV 從病毒工廠順利轉(zhuǎn)運(yùn)至TGN，并在IMV 雙層膜包裹中發(fā)揮重要作用，抑制A27L 的表達(dá)，導(dǎo)致IMV的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻［26］。

4 VACV包膜蛋白在EEV細(xì)胞間傳播中的作用

IEV 從細(xì)胞融出轉(zhuǎn)變?yōu)镃EV 并附著于細(xì)胞外表面，其下方質(zhì)膜處通過形成肌動蛋白尾協(xié)助其在細(xì)胞間傳播。據(jù)報道，有5種蛋白（A33R、A34R、A36R、B5R 和F13L）與肌動蛋白尾的形成有關(guān)，其中僅有A36R 參與了肌動蛋白尾的形成，其他4 種是IEV 形成所必需的蛋白。

A33R、A34R 和B5R 蛋白位于IEV 的雙層膜上，當(dāng)IEV 脂蛋白膜與細(xì)胞膜融合時，這些蛋白分布在CEV 外膜和細(xì)胞質(zhì)膜上，有助于CEV 附著在細(xì)胞表面［27］。WARD 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，A36R 蛋白融入IEV 外膜依賴于A33R 蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)和A36R缺失突變的重組痘苗病毒株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，A36R和A33R 蛋白的非共價連接實際上是A36R 蛋白99～111位氨基酸殘基與A33R蛋白的胞質(zhì)尾發(fā)生的強(qiáng)相互作用。

研究發(fā)現(xiàn)，IEV與胞膜融合時，A36R蛋白被極化并發(fā)生磷酸化［29］。A36R蛋白的Tyr112和Tyr132發(fā)生磷酸化后產(chǎn)生了與Nck 和生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，Grb2）SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合的位點［30-32］。磷酸化后的Tyr112可招募WIP、N-WASP和Nck組成的復(fù)合物，并激活RSV調(diào)節(jié)肌動蛋白相關(guān)蛋白2／3（RSV modulates actin-related protein 2／3，ARP2／3）復(fù)合物誘導(dǎo)肌動蛋白成核［31-32］。而磷酸化后的Tyr132負(fù)責(zé)招募Grb2，可穩(wěn)定WIP、NWASP和Nck組成的復(fù)合物，有助于肌動蛋白尾的合成［31-33］。Grb2 在該過程中的作用不可缺，當(dāng)Grb2 缺失時，每個細(xì)胞的肌動蛋白尾數(shù)量平均減少2.6倍［34］。

5 VACV包膜蛋白在疫苗研究中的應(yīng)用

MPXV 感染引發(fā)的疾病稱為猴痘，其主要癥狀為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、肌肉痛、頭痛等。猴痘暴發(fā)的強(qiáng)度和數(shù)量仍在持續(xù)上升，嚴(yán)重威脅人類健康［35-36］，引發(fā)了全球?qū)φ徊《镜年P(guān)注。因此，有必要開發(fā)和完善VACV 的防控政策［37］。天花是唯一被根除的人類疾病，這也為使用疫苗消滅VACV 提供了可能性［38］。

保護(hù)性抗體主要針對IMV和EEV兩種感染形式的VACV表面蛋白，因此，可通過這些病毒形式的組合蛋白更好地激發(fā)完全保護(hù)性免疫［39］。目前，VACV疫苗的研究多集中在具有免疫原性的蛋白L1R、A27L、B5R 和A33R［40］。多項研究表明，用VACV 的L1R和A33R基因制備的DNA 疫苗及B5R 蛋白進(jìn)行免疫，可保護(hù)小鼠免受致命的VACV攻擊［41-42］。RUDRARAJU等［43］研究發(fā)現(xiàn)，用編碼A27L的重組腺病毒進(jìn)行單次肌內(nèi)注射，可保護(hù)小鼠免受VACV 的致命鼻內(nèi)攻擊，接種疫苗后10 周，感染后發(fā)病率顯著下降，免疫原性和保護(hù)效力至少可持續(xù)35 周。研究發(fā)現(xiàn)，一種無病毒編碼VACV A27L 蛋白的DNA 疫苗制劑可刺激產(chǎn)生A27L 特異性IFNγ，并于接種7 d 后提高體液免疫力［44-45］。

6 小結(jié)與展望

包膜蛋白在VACV 形態(tài)發(fā)生的各時期均發(fā)揮了重要作用。A27L 蛋白利用與細(xì)胞表面的肝素分子結(jié)合促進(jìn)病毒對細(xì)胞的附著，并與A17L蛋白N-末端F1、F2 位點相互作用，錨定在病毒膜上。A28L 蛋白參與VACV 與細(xì)胞膜的融合過程，A28L 缺失的病毒突變體不能進(jìn)入細(xì)胞開始感染過程。除了可幫助錨定外，A17L 蛋白可將A26L、A27L 和D13L 蛋白錨定在病毒膜上，并幫助D13L 蛋白實現(xiàn)穩(wěn)定膜彎曲的作用。A36R 蛋白在病毒體的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外運(yùn)動中均起重要作用。A36R 蛋白與驅(qū)動蛋白-1 相互作用，參與微管介導(dǎo)的胞內(nèi)運(yùn)輸。而A36R 蛋白Tyr112和Tyr132磷酸化后，與Nck、WIP 和N-WASP 組成的三元復(fù)合物及Grb2 結(jié)合，誘導(dǎo)肌動蛋白成核，并促進(jìn)肌動蛋白的形成。在未來的研究中，將對這幾種蛋白進(jìn)行深入研究，為相應(yīng)抗病毒藥物在病毒形態(tài)發(fā)生各時期作用的研究提供理論基礎(chǔ)。