梁香存，魏小雨，梁 健，王 慶，耿 廣

河北省胸科醫(yī)院 腫瘤科，河北 石家莊 050041

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌之一,也是死亡率最高的癌種之一[1]。調(diào)查顯示,肺癌每年新增病例200萬(wàn),死亡病例約176萬(wàn)[2],其發(fā)病率和死亡率不斷上升,給社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。近幾十年來(lái),中國(guó)針對(duì)肺癌的靶向藥物研發(fā)已經(jīng)取得了豐碩進(jìn)展。尤其是分子靶向治療策略已經(jīng)在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer cell, NSCLC)治療中取得了顯著成就[3]。安羅替尼(Anlotinib),商品名?？删S,是中國(guó)自主研發(fā)的新型小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑,臨床上被用來(lái)提高NSCLC患者的存活期[4]。微小RNA(microRNA, miRNA)是一段長(zhǎng)度約為18～22 nt的內(nèi)源性核苷酸單鏈,其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用[5]。迄今為止,miR-16-5p在多種癌中扮演抑癌基因的角色,其中包括NSCLC[6]。程序性細(xì)胞死亡-1(programmed cell death-1, PD-1) 是T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞常見(jiàn)的細(xì)胞表面受體。在PD-1與其配體結(jié)合后,可通過(guò)SHP-2抑制T細(xì)胞活化,使T細(xì)胞受體介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)Zap 70去磷酸化,最終抑制T細(xì)胞增殖[7]。本研究擬以NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察安羅替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響,進(jìn)而揭示安羅替尼與miR-16-5p/PD-1信號(hào)軸的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299(上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞庫(kù));SPF級(jí)6～8周齡的雄性BALB/c-nu裸鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2020-0004];安羅替尼(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物公司);annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);相關(guān)小分子試劑(agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1)和質(zhì)粒[pcDNA 3.1(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT、pGL3-PD-1-MUT](上海吉瑪公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:首先,將無(wú)菌水制備的10 nmol/L安羅替尼母液加入A549和H1299細(xì)胞中,使其終濃度分別為0、10和20 μmol/L。孵育48 h后,利用LipofectamineTM3000將相關(guān)的小分子試劑和質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中,包括agomiRNA、agomiR-16-5p、si-NC、si-PD-1、pcDNA3.1(+)、pcDNA(+)-PD-1、pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT,轉(zhuǎn)染12 h后,更換新鮮培養(yǎng)液,48 h后,收集細(xì)胞,用于后續(xù)研究。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖: 將A549和H1299細(xì)胞以2×103個(gè)/孔分別接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后,每孔加入20 μL的CCK-8試劑,避光孵育20 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm的吸光度(A)。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率(%)。細(xì)胞增殖抑制率(%)= [(A490對(duì)照組-A490實(shí)驗(yàn)組)/A490對(duì)照組]×100%。

1.2.3 EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖:將A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞以3×105個(gè)/孔分別接種于24孔板。用紅色熒光染料EDU標(biāo)記細(xì)胞。4%多聚甲醛固定。Triton×100細(xì)胞膜通透,DAPI核染色。最后,熒光顯微鏡下成像分析,計(jì)算EDU陽(yáng)性率(%)。EDU陽(yáng)性率(%)= EDU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集1×106個(gè)細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌3次,用500 μL緩沖液制成單細(xì)胞懸液。隨后,加入5 μL的annexin V-FITC,混勻,避光孵育10 min,再加入5 μL的PI,混勻,繼續(xù)孵育15 min。最后,利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)PD-1蛋白表達(dá):收集細(xì)胞,用RIPA裂解液冰上裂解,提取總蛋白。Bradford法定量總蛋白濃度,沸水浴變性。等量蛋白用10%的SDS-PAGE膠電泳。待蛋白分離后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后,脫脂奶粉封閉處理。用PBS稀釋的鼠抗PD-1(1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜。HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育2 h。洗膜,滴加ECL顯影液,顯色曝光。利用Image J分析條帶吸光度。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-16-5p與PD-1的靶向性:首先,利用Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估m(xù)iR-16-5p與PD-1之間的作用靶點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)信息設(shè)計(jì)合成pGL3-PD-1-WT和pGL3-PD-1-MUT質(zhì)粒,構(gòu)建熒光酶報(bào)告基因載體。隨后將上述報(bào)告基因載體分別與agomiRNA、agomiR-16-5p、antagomiRNA以及antagomiR-16-5p共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)A549細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.2.7 移植瘤模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞成瘤性的抑制能力:將BALB/c-nu裸鼠隨機(jī)分為3組,即對(duì)照組、安羅替尼組、陽(yáng)性組,每組6只。將處于增殖期的A549細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液。用生理鹽水調(diào)整濃度至2×1010/L,在無(wú)菌條件下每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL。陽(yáng)性組灌胃4 mg/kg順鉑處理,安羅替尼組灌胃50 mg/kg安羅替尼處理,對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水,1次/d,持續(xù)28 d。記錄各組小鼠移植瘤體積,并且麻醉處死各組小鼠后,記錄移植瘤體質(zhì)量。移植瘤體積(mm3)=(長(zhǎng)×寬2)/2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 安羅替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組相比,安羅替尼組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高,Edu陽(yáng)性率顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1)。

A.cell proliferation was detected by EDU assay; B.Cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining; C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;*P<0.05 compared with control group.

2.2 安羅替尼調(diào)控NSCLC中的miR-16-5p和PD-1表達(dá)

與對(duì)照組相比,安羅替尼組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)顯著升高,PD-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(圖2)。

A.miR-16-5p expression; B.expression of PD-1 mRNA; C.expression of PD-1 protein;*P<0.05 compared with control group

2.3 miR-16-5p直接靶向結(jié)合PD-1 3′UTR

Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè) miR-16-5p和PD-1之間的結(jié)合序列(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,僅agomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-WT細(xì)胞的熒光活性明顯降低,agomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-MUT細(xì)胞、antagomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-WT細(xì)胞、antagomiR-16-5p組PD-1 3′UTR-MUT細(xì)胞的熒光活性均未發(fā)生明顯變化(圖3B)。與agomiRNA組相比,agomiR-16-5p組細(xì)胞PD-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低,與antagomiRNA組相比,antagomiR-16-5p組細(xì)胞PD-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)(圖3C、D)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-16-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與agomiRNA組相比,agomiR-16-5p組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)顯著升高,細(xì)胞增殖和凋亡率均顯著升高,EDU陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.miR-16-5p expression; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;C.cell proliferation was detected by EDU assay; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with agomiRNA group.

2.5 敲減PD-1對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組相比,si-PD-1組細(xì)胞PD-1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低,細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著升高,EDU陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05)(圖5)。

A.PD-1 mRNA expression; B.PD-1protein expression;C.cell proliferation was detected by CCK-8 assay;D.cell proliferation was detected by EDU assay; E.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining;*P<0.05 compared with si-NC group.

2.6 過(guò)表達(dá)PD-1逆轉(zhuǎn)安羅替尼介導(dǎo)的miR-16-5p對(duì)A549細(xì)胞的生物學(xué)行為

與20 μmol/L組相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)顯著升高,細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著升高,EDU陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05);與20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA組相比,20 μmol/L+agomiR-16-5p+pcDNA-PD-1組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)顯著降低,細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著降低,EDU陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05)(圖6)。

A.miR-16-5p expression in A549 cells; B.cell proliferation was detected by CCK-8 assay in A549 cells;C.cell proliferation was detected by EDU assay in A549 cells; D.cell apoptosis was detected by annexin Ⅴ/PI staining in A549 cells; *P<0.05 compared with 20 μmol/L group; #P<0.05 compared with 20 μmol/L +agomiR-16-5p+pcDNA group.

2.7 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,安羅替尼組瘤體積(7 d、14 d除外)和瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05)(圖7)。

*P<0.05 compared with control group.

3 討論

安洛替尼是一種新型口服酪氨酸激酶抑制劑,作為一種新型分子靶向藥物能夠靶向血小板衍生生長(zhǎng)因子受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體。在晚期NSCLC 患者的3期試驗(yàn)中,安羅替尼能夠明顯提高患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期[4]。然而,安羅替尼治療NSCLC的機(jī)制仍需深入研究[8]。本研究初步探索了安羅替尼抗NSCLC的作用以及與miR-16-5p/PD-1信號(hào)軸的關(guān)系。

已有的研究證明,miR-16在人類多種癌中發(fā)揮重要的抑癌作用,包括乳腺癌、宮頸癌、和膀胱癌等[9-11]。例如,miR-16作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)XIST的下游靶點(diǎn),通過(guò)靶向CDK8抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)阻滯細(xì)胞周期[13]。然而,關(guān)于miR-16-5p作為抗癌藥物作用靶點(diǎn)的研究尚少。本研究發(fā)現(xiàn)在A549和H1299細(xì)胞中miR-16-5p的表達(dá)水平與安羅替尼的濃度呈正相關(guān),即安羅替尼能夠上調(diào)miR-16-5p表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-16-5p能夠顯著抑制A549和H1299細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PD-1/PDL-1阻斷抗體通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用。PD-1阻斷劑在多種惡性腫瘤中具有顯著的臨床療效,尤其NSCLC[12]。研究顯示,PD-1在55%的NSCLC患者中高表達(dá),利用PD-1阻斷劑治療的NSCLC晚期患者的無(wú)進(jìn)展生存期顯著延長(zhǎng)[13]。另外,PD-1抗體聯(lián)合安羅替尼對(duì)發(fā)生肝、腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者表現(xiàn)出良好的可耐受毒性和抗腫瘤活性[14]。本研究結(jié)果顯示,PD-1的表達(dá)水平與安羅替尼的濃度呈負(fù)相關(guān),PD-1是miR-16-5p的下游靶基因。降低PD-1表達(dá)能夠明顯抑制A549和H1299細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡;相反,過(guò)表達(dá)PD-1可逆轉(zhuǎn)安羅替尼介導(dǎo)的miR-16-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的促增殖、抗凋亡作用。

綜上所述,安羅替尼能夠抑制NSCLC細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,其機(jī)制可能與miR-16-5p/PD-1信號(hào)通路相關(guān)。因此,本研究為安羅替尼用于NSCLC的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。